A: Mẫu lá nghi nhiễm SMV; B: Mẫu lá nghi nhiễm BYMV; C: Mẫu lá nghi nhiễm đồng thời cả hai loài SMV và BYMV; D: Rệp ở mặt dưới lá đậu tương của cây bị bệnh khảm
2.2.2.4. Tạo vector mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của SMV và đoạn gen CPi của cả SMV và BYMV bằng kỹ thuật Gateway
đoạn gen CPi của cả SMV và BYMV bằng kỹ thuật Gateway
i) Phản ứng LR Bảng 2.5. Thành phần phản ứng LR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Plasmid pEN-gene (50 – 150 ng) 1,0 2 Vector pK7GWIWG2(II) (150 ng/µl) 0,5 3 Nước khử ion 2,5 Tổng 4,0
Tiến hành thí nghiệm: Bổ sung các thành phần trên vào ống ly tâm 1,5 ml ở nhiệt độ phòng và trộn nhẹ, làm tan hỗn hợp enzyme LR ClonaseTM trên đá trong 2 phút, trộn nhẹ 2 lần, mỗi lần 2 giây. Tiếp tục bổ sung vào ống ly tâm 2 µl enzyme LR ClonaseTM và ủ phản ứng ở 25oC trong 1 giờ. Bổ sung 1 µl dung dịch proteinase K để kết thúc phản ứng và ủ ở 37oC trong 10 phút.
ii) Biến nạp
Chuyển 3 µl phản ứng LR vào 50 µl tế bào E. coli One Shot® TOP 10 và ủ trong đá 30 phút. Sốc nhiệt tế bào ở 42oC trong 45 giây. Bổ sung 250 µl S.O.C. Ủ ở 37oC trong 1 giờ bằng máy lắc, sau đó chuyển 50 - 250 µl vào các đĩa chọn lọc chứa kháng sinh streptomycin 40 mg/l, spectinomycin 100 mg/l và chloramphenicol 100mg/l.
iii) Chọn dòng bằng phản ứng cắt bằng enzyme hạn chế và PCR
Một số khuẩn lạc được chọn ngẫu nhiên nuôi qua đêm ở 37oC trong 4ml LB lỏng có bổ sung streptomycin 40 mg/l, spectinomycin 100 mg/l và chloramphenicol 50 mg/l để tách chiết plasmid. Sau đó, phản ứng cắt plasmid bằng hai Enzyme Xba I và Hind III được thực hiện.
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme hạn chế
STT Thành phần Thể tích (l)
1 Buffer Y+/ TangoTM (2X) 2
2 Enzyme Xba I (10 U/µl) 1
3 Enzyme Hind III (10 U/µl) 1
4 H2O 3
5 Template (200 ng/µl) 3
Tổng 10
Bổ sung lần lượt các thành phần trên vào ống Eppendorf 1,5 ml, ủ ở 37oC trong 2 giờ.
Vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của SMV và BYMV được ký hiệu theo nguyên tắc là: pK7GW-đoạn gen (tên loài virus), [pK7GW-CPi-SMV, pK7GW-CPi (SMV-BYMV)].