A: Mẫu lá nghi nhiễm SMV; B: Mẫu lá nghi nhiễm BYMV; C: Mẫu lá nghi nhiễm đồng thời cả hai loài SMV và BYMV; D: Rệp ở mặt dưới lá đậu tương của cây bị bệnh khảm
2.2.3.2. Chuyển cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào cây thuốc lá C9-
Môi trường tái sinh cây in vitro phục vụ chuyển gen được trình bày ở bảng 2.7.
Bảng 2.7. Thành phần các loại môi trường tái sinh in vitro
Loại môi trường Kí hiệu Thành phần
Nảy mầm hạt (Germination medium)
GM Muối B5 (3,052 g/l )+ sucrose (20 g/l) + agar (6 g/l), pH = 5,8. Bổ sung: vitamin B5(1 mg/l)
Đồng nuôi cấy (Co-cultivation medium)
CCM Muối B5 (0,316 g/l)+ MES (3,9 g/l) + sucrose (30g/l)+ agar (5 g/l), pH = 5,4. Bổ sung: vitamin B5 (1 mg/l )+ AS (0,2 mM) + L-cysteine (400 mg/l) + Sodium thiosulfate(158 mg/l) + DTT (154 mg/l )+ GA3(0,25 mg/l) + BAP Cảm ứng tạo đa chồi (Shoot induction medium)
SIM Muối B5 (3,052 g/l) + MES (0,59 g/l) + sucrose (30 g/l), pH = 5,6. Bổ sung: vitamin B5 (1 mg/l )+ BAP Kéo dài chồi
(Shoot elongation medium)
SEM MS (4,3 g/l) + MES( 0,59 g/l )+ sucrose (30 g/l) + agar (6 g/l), pH = 5,6. Bổ sung: vitamin B5 1 mg/l + L-asparagine (50 mg/l) + L-pyroglutamic acid (100 mg/l )+ IAA+GA3
Ra rễ
(Rooting medium)
RM MS (1,58 g/l) + MES (0,59 g/l )+ sucrose (20 g/l) + agar (6 g/l), pH = 5,6. Bổ sung: IBA + vitamin B5 (1 mg/l )
Quy trình chuyển gen vào giống thuốc lá C9-1 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens CV58C1 được tiến hành theo phương pháp của Topping (1998) [155], bao gồm các bước:
(1) Chuẩn bị chủng A. tumefaciens CV58C1 mang cấu trúc pGW-CPi (SMV- BYMV) một ngày trước khi biến nạp, nuôi một khuẩn lạc vào 20 ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh Streptomycin 40 mg/l, Spectinomycin100 mg/l và Chloramphenicol 50 mg/l, nuôi lắc 200 v/p ở 28oC trong 16 giờ.
(2) Bổ sung thêm 30ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh như trên nuôi lắc 200 v/p ở 28oC trong 3 – 4 giờ.
(3) Chuẩn bị mảnh lá thuốc lá có kích thước 1cm2 được làm tổn thương bằng lưỡi dao cắt bốn cạnh xung quanh, đặt trên môi trường MS trong 2 ngày. (4) Lấy khoảng 1,5 – 2,0ml dịch khuẩn và môi trường LB lỏng dùng để nuôi khuẩn như trên đo OD nếu OD600 = 0,5 - 1 (tốt nhất khoảng 0,7) là có thể được sử dụng cho biến nạp.
(5) Ly tâm toàn bộ dịch khuẩn 4500 v/p trong 1 phút ở 40C. Sau đó thu cặn hòa tan dưới đáy ống nghiệm và hòa tan với thể tích tương đương bằng dung dịch ½ MS dùng để biến nạp.
(6) Các mảnh lá sau 2 ngày nuôi cảm ứng trên môi trường MS được dùng biến nạp. Sau 30 phút lây nhiễm trong dịch khuẩn, chuyển các mảnh lá lên giấy thấm đã khử trùng, thấm khô và cấy lên môi trường MS. Sau 2 ngày chuyển sang môi trường MS có bổ sung kháng sinh cefotaxim 500 mg/l và kanamycin 50 mg/l.
(7) Sau 2 - 3 tuần từ các mảnh cấy xuất hiện các chồi nhỏ. Tách các chồi và chuyển sang môi trường MS có bổ sung kháng sinh cefotaxim 500mg/l và kanamycin 50mg/l.
(8)Sau 1 - 2 tuần tiếp theo, những chồi sống sót và phát triển được thành cây hoàn chỉnh được cấy lên môi trường MS có bổ sung kháng sinh cefotaxim 500mg/l và kanamycin 50mg/l.
(9)Ra cây ở phòng thí nghiệm trên giá thể đất sau 4 – 5 tuần. (10)Sau 2 - 3 tuần, chuyển cây ra môi trường nhà lưới.