D: Chồi cây chuyển gen sau 3 tuần trên môi trường tạo rễ;
A. Dòng cây chuyển genT 0-5 kháng virus; B: Dòng cây chuyển gen T0 12 nhiễm nhẹ virus;
C: Dòng cây chuyển gen T0-9 nhiễm nặng virus; D: Cây đối chứng không chuyển gen nhiễm nặng virus.
Những cây đối chứng và các dòng cây chuyển gen nhiễm bệnh do nhiễm hai loài SMV và BYMV đều biểu hiện có lá bị khảm và xoăn, còi cọc và sinh trưởng kém. Trong khi đó, các dòng cây kháng hoàn toàn vẫn sinh trưởng và phát triển bình thường, lá xanh tốt. Như vậy, phương pháp lây nhiễm nhân tạo SMV và BYMV bằng nguồn lá nhiễm bệnh khảm có thể áp dụng tốt để đánh giá khả năng kháng cho các dòng thuốc lá chuyển cấu trúc CPi (SMV-BYMV).
A B
Bảng 3.9. Kết quả lây nhiễm nhân tạo và khả năng kháng SMV, BYMV của các dòng thuốc lá chuyển gen T0 và cây đối chứng không chuyển gen
Các dòng cây chuyển gen Đối chứng không chuyển gen Lần lây nhiễm Số cây được lây nhiễm Số cây kháng hoàn toàn Số cây có biểu hiện bệnh Tỷ lệ kháng (%) Số cây được lây nhiễm Số cây không biểu hiện bệnh Số cây có biểu hiện nhiễm bệnh Tỷ lệ kháng (%) 1 26 22 4 (++) 84,62 10 3 7 (+++) 30,33 2 22 22 0 100 3 0 3 (+++) 0 3 22 19 3 (+) 86,36 0 0 Tổng 26 19 7 73,08 10 10 0
Ghi chú: Các ký hiệu tương ứng với (+); (++); (+++) mức độ biểu hiện bệnh nhẹ, trung bình và nặng.
Năm 2007, Yan và đtg đã sử dụng gen mã hóa protein vỏ của TMV (virus khảm thuốc lá) để thiết kế các vector mang cấu trúc RNAi. Các giống thuốc lá K326 và Longjiang 911 được chuyển gen thông qua A. tumefaciens. Kết quả phân tích biểu hiện tính kháng bằng kỹ thuật real-time PCR cho thấy TMV đã bị mất dần trong các dòng cây chuyển gen và các dòng thuốc lá chuyển gen tạo ra từ giống K326 và Longjiang 911 có khả năng kháng TMV tương ứng là 83% và 90% [173]. Thông báo của Zhang và đtg (2012) đề cập
đến thiết kế cấu trúc RNA kẹp tóc chứa đoạn lặp lại đảo chiều của cDNA gen CP của virus Y ở khoai tây (PVY) và chuyển vào cây thuốc lá và khả năng kháng PVY của các dòng thuốc lá chuyển gen tới 83,54% [177]. Tính hiệu
được chứng minh trong một số công trình khác [129], [131]… Ở Việt Nam,
thành công đầu tiên ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây chuyển gen kháng virus là công trình nghiên cứu tạo các dòng cây thuốc lá chuyển gen có khả năng kháng CMV (Cucumber mosaic virus) là 70,9%, kháng PVY là 84,1%, kháng TMV (Tobacco mosaic virus) là 74,5% và khả năng kháng đồng thời hai loại virus TMV và CMV lên tới 70,8% [19], [20], [21]. Tuy nhiên, các nhóm tác giả cũng thấy rằng tỷ lệ kháng bệnh của các dòng cây chuyển gen phụ thuộc nhiều vào đoạn gen được lựa chọn để thiết kế vector. Trong nghiên
cứu này, chúng tôi đã sử dụng đoạn gen CPi của hai loại SMV và BYMV thiết kế vector mang cấu trúc RNAi chuyển vào cây thuốc lá và thu được kết quả khả quan, với 73,08% dòng cây chuyển gen kháng hoàn toàn đối với
SMV và BYMV, phù hợp và thuộc nhóm cây chuyển gen có tính kháng cao đối với virus. Kết quả thu được trong nghiên cứu này càng củng cố thêm quan điểm của Kumar và Sarin (2013) rằng, việc sử dụng các can thiệp bằng kỹ thuật RNAi đã cung cấp một cách tiếp cận thân thiện với môi trường để tạo ra
cây trồng kháng virus và côn trùng, mà cho đến nay khó có kỹ thuật nào thay thế [110].
Kết quả đánh giá tính kháng SMV và BYMV ở cây thuốc lá là cơ sở để chúng tôi ứng dụng chuyển cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào cây đậu tương, đánh giá tính kháng và chọn lọc các dòng đậu tương chuyển gen kháng SMV và kháng đồng thời SMV và BYMV.
3.4. KẾT QUẢ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG MANG CẤU TRÚC RNAi
3.4.1. Kết quả chuyển cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào cây đậu tương
Thí nghiệm chuyển cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào mô đậu tương của hai giống ĐT12 và DT2008 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens bằng kỹ thuật lây nhiễm qua nách lá mầm hạt chín tiến hành theo quy trình chuyển gen ở
đậu tương đã được tối ưu [7]. Kết quả tạo mảnh lá mầm hạt chín làm nguyên liệu phục vụ lây nhiễm của A. tumefaciens tái tổ hợp. Nách lá mầm hạt chín được gây tổn thương, lây nhiễm và đồng nuôi cấy với A. tumefaciens chứa vector pK7GW-CPi (SMV-BYMV) nhằm biến nạp cấu trúc CPi (SMV- BYMV) vào đậu tương, sau đó chuyển sang môi trường cảm ứng tạo đa chồi, chọn lọc trên môi trường bằng kháng sinh kanamycin, ra rễ và tạo cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc CPi (SMV-BYMV) (Hình 3.28).
Hình 3.28. Kết quả tạo cây đậu tương chuyển gen từ giống DT2008 bằng kỹ
thuật lây nhiễm A. tumefaciens tái tổ hợp qua nách lá mầm hạt chín
A – Nách lá mầm hạt chín; B - Gây tổn thương nách lá mầm trong dịch khuẩn và lây nhiễm 30 – 40 phút; C - Đồng nuôi cấy trên CCM ở điều kiện tối trong 5 ngày; D - Cảm nhiễm 30 – 40 phút; C - Đồng nuôi cấy trên CCM ở điều kiện tối trong 5 ngày; D - Cảm ứng tạo đa chồi trên SIM lần 1 trong 2 tuần (bổ sung BAP 2 mg/l + kanamycin 50 mg/l);