A: Mẫu lá nghi nhiễm SMV; B: Mẫu lá nghi nhiễm BYMV; C: Mẫu lá nghi nhiễm đồng thời cả hai loài SMV và BYMV; D: Rệp ở mặt dưới lá đậu tương của cây bị bệnh khảm
2.2.3.3. Chuyển cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào giống đậu tương ĐT12 và DT
Kỹ thuật tái sinh đa chồi ở cây đậu tương qua nách lá mầm hạt chín được tiến hành dựa trên phương pháp của Olhoft và cộng sự (2006) có cải tiến [122]. Thành phần các loại môi trường sử dụng cho tái sinh cây qua đa chồi từ nách lá mầm hạt chín được chỉ ra trong bảng 2.7.
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. Các thí nghiệm của phần nuôi cấy mô tế bào thực vật được thực hiện trong phòng nuôi cây với điều kiện chiếu sáng theo quang chu kì 16 giờ sáng và 8 giờ tối, nhiệt độ phòng 250C ± 2, cường độ chiếu sáng 2000 lux.
i) Tạo nguyên liệu và cảm ứng tạo đa chồi
Hạt chín được loại bỏ các hạt kém chất lượng và tiến hành khử trùng bằng khí clo trong bình kín có tủ hốt. Sau khi khử trùng, cho hạt nảy mầm trên môi trường GM, sau 4-5 ngày cắt lấy phần lá mầm, tách đôi hai lá mầm, loại đỉnh sinh trưởng. Phần lá mầm còn lại được đặt lên môi trường cảm ứng tạo đa chồi (SIM). Theo dõi tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi, số chồi trung bình /cụm sau thời gian cảm ứng là 4 tuần để đánh giá khả năng tạo đa chồi của giống đậu tương cũng như mức độ phù hợp của môi trường.
ii) Kéo dài chồi và tạo cây hoàn chỉnh
Các cụm chồi được tạo ra từ quá trình nuôi cấy trên môi trường SIM được chuyển sang môi trường kéo dài chồi SEM. Đánh giá khả năng kéo dài của chồi sau 2 tuần dựa trên việc theo dõi và thống kê số chồi kéo dài/cụm nuôi cấy cũng như chất lượng chồi.
Khi các chồi đạt chiều cao từ 4-5 cm, chọn những chồi khỏe chuyển sang môi trường ra rễ RM. Khi cây in vitro có 3 lá, có bộ rễ đảm bảo (thường sau 2 tuần nuôi cấy) sẽ thực hiện việc ra cây. Cây được lấy ra khỏi bình nuôi cấy một cách nhẹ nhàng, rửa sạch phần agar bám quanh gốc và rễ, sau đó cây được trồng trên giá thể . Cây sống sót trên giá thể được đưa ra trồng trên chậu đất có bổ sung phân bón và trồng trong điều kiện nhà lưới.
iii) Chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens qua nách lá mầm hạt chín
Phương pháp chuyển gen qua nách lá mầm tiến hành theo Olhoft và cộng sự (2006) có cải tiến [122] và theo Nguyễn Thu Hiền (2011) [6], [7]) (Hình 2.4).
Hình 2.4. Sơ đồ thí nghiệm tái sinh và chuyển gen vào giống đậu tương ĐT12 và DT2008 Khử trùng bề mặt Nảy mầm A. tumefaciens/CPi (SMV-BYMV) Nuôi lỏng khuẩn
Tạo huyền phù khuẩn
Kéo dài chồi
Ra rễ
Ra cây
Thu lá mầm, gây tổn thương nách lá mầm và lây nhiễm A. tumefaciens/CPi (SMV-BYMV);
Đồng nuôi cấy
Cảm ứng tạo đa chồi
Hạt đậu tương ĐT12 và DT2008
Hạt đậu tương chín sau khi được khử trùng, nảy mầm, tách và thu phần nách lá mầm (tương tự như tạo nguyên liệu nuôi cấy in vitro trong quy trình tái sinh cây) sẽ được gây tổn thương bằng mũi dao và kim nhọn từ 7-8 lần vào phần nách lá mầm. Lá mầm đã bị tổn thương được nhiễm khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp.
Mẫu được ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn có OD600 đạt 0,6-1 trong thời gian 30 phút. Sau thời gian nhiễm khuẩn, mẫu được chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy CCM đặc. Quá trình đồng nuôi cấy diễn ra trong tối, ở 250C trong thời gian là 5 ngày.
Sau thời gian đồng nuôi cấy, mẫu biến nạp được lắc trong môi trường cảm ứng tạo chồi (SIM) có bổ sung 500 mg/l cefotaxim với thời gian là 10 phút, sau đó thấm khô bằng giấy thấm khử trùng. Cắt bỏ chồi chính trên các mảnh lá mầm và cấy mẫu lên môi trường tạo cụm chồi có bổ sung 500 mg/l cefotaxim. Sau thời gian 2 tuần, mẫu được chuyển sang môi trường SIM đặc có bổ sung 500 mg/l cefotaxim và kanamycin 50 mg/l. Các cụm chồi sống được trên môi trường chọn lọc sẽ được chuyển sang môi trường phát triển chồi (SEM) có bổ sung 500 mg/l cefotaxim và kanamycin 50 mg/l. Chồi phát đạt kích thước từ 3-5 cm được chuyển sang môi trường ra rễ (RM) có bổ sung 250 mg/l cefotaxim để tạo cây hoàn chỉnh.
iv) Phương pháp xác định hiệu suất chuyển gen
Mỗi mẫu biến nạp là mảnh lá mầm được tái sinh chồi và qua hai lần chọn lọc bằng kháng sinh. Các chồi sống sót sau chọn lọc được chuyển sang môi trường ra rễ và đưa ra trồng trên giá thể. Số cây sống trên giá thể của mỗi mẫu biến nạp dương tính với PCR lập thành một dòng cây chuyển gen. Hiệu suất chuyển gen được tính theo công thức:
Hiệu suất chuyển gen =
Số dòng cây chuyển gen dương tính với PCR
Tổng số mẫu biến nạp