Nghiên cứu chuyển nạp gen HIV 1 p24 tạo protein kháng nguyên vào lục lạp cây thuốc lá (nicotiana tabacum l ) bằng phương pháp bắn gen

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Phan Tường Lộc NGHIÊN CỨU CHUYỂN NẠP GEN HIV-1 p24 TẠO PROTEIN KHÁNG NGUYÊN VÀO LỤC LẠP CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana tabacum L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP BẮN GEN LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Tp Hồ Chí Minh – Năm 2013 ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Phan Tường Lộc NGHIÊN CỨU CHUYỂN NẠP GEN HIV-1 p24 TẠO PROTEIN KHÁNG NGUYÊN VÀO LỤC LẠP CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana tabacum L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP BẮN GEN Chuyên ngành: Hóa Sinh học Mã số chuyên ngành: 62 42 30 15 Phản biện 1: PGS.TS Trần Văn Minh Phản biện 2: PGS.TS Bùi Văn Lệ Phản biện 3: TS Vương Đình Tuấn Phản biện độc lập 1: PGS.TS Phạm Xuân Hội Phản biện độc lập 2: PGS.TS Chu Hoàng Hà NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS Nguyễn Thị Thanh TS Nguyễn Hữu Hổ Tp Hồ Chí Minh – Năm 2013 TRÂN TRỌNG CẢM ƠN - TS Nguyễn Thị Thanh TS Nguyễn Hữu Hổ tận tình hướng dẫn, giúp đỡ suốt trình học tập hoàn thành luận văn - Chương trình KHCN Trọng điểm cấp Nhà nước, đề tài KC.04.10/06 -10 (do TS Nguyễn Thị Thanh làm chủ nhiệm) hỗ trợ kinh phí thực - Quý Thầy, Cô Hội đồng báo cáo chuyên đề phản biện đóng góp ý kiến quý báu giúp hoàn chỉnh luận văn - Quý Thầy, Cô Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Ban Lãnh đạo Viện Sinh học Nhiệt đới, Phòng Thí nghiệm Trọng điểm, Phòng Công nghệ Gen tạo điều kiện thuận lợi cho trình thực luận văn - Các Anh, Chị đồng nghiệp Phòng Công nghệ Gen Bộ phận khác hỗ trợ thực nghiệm thu thập tư liệu - Gia đình Bạn chỗ dựa giúp vượt qua khó khăn công việc LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu thực hiện, hướng dẫn TS Nguyễn Thị Thanh TS Nguyễn Hữu Hổ, phòng Công nghệ Gen, Phòng Thí nghiệm Trọng điểm phía Nam Công nghệ Tế bào Thực vật - Viện Sinh học Nhiệt đới Các kết luận án trung thực chưa công bố tác giả khác Phan Tường Lộc MỤC LỤC Trang MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU - CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH ẢNH DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU - SƠ ĐỒ CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1.1 Mục đích nghiên cứu 1.2 Nội dung phạm vi vấn đề nghiên cứu 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn CHƯƠNG TỔNG QUAN 2.1 HIV - AIDS vấn đề liên quan đến phòng trị bệnh 2.2 Lạp thể (plastid) thực vật 12 2.3 Biến nạp gen lạp thể 21 2.4 Cây thuốc ứng dụng biểu gen lục lạp 34 2.5 Các công trình biểu protein HIV-1 p24 thuốc 39 2.6 Triển vọng phát triển thị trường protein tái tổ hợp dược liệu có nguồn gốc thực vật 46 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 48 3.1 SƠ ĐỒ BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 49 3.2 VẬT LIỆU 50 3.2.1 Cây thuốc 50 3.2.2 Vector chuyển gen 50 3.2.3 Môi trường nuôi cấy mô thực vật vi khuẩn 51 3.3 PHƯƠNG PHÁP 52 3.3.1 Xây dựng hệ thống tái sinh từ mô thuốc in vitro 52 3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng kháng sinh chọn lọc streptomycin spectinomycin tái sinh chồi từ mô phát triển điều kiện in vitro 52 3.3.3 Phương pháp chuyển gen vào lục lạp thuốc 53 3.3.4 Chọn lọc thể chuyển gen 55 3.3.5 Điện di DNA 56 3.3.6 Phân tích Polymerase Chain Reaction (PCR) 57 3.3.7 Phân tích Southern blot 58 3.3.8 Phương pháp trồng thuốc in vitro vườn ươm 62 3.3.9 Phân tích Western blot 63 3.3.10 Phân tích enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 67 3.3.11 Thống kê 70 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 71 4.1 Xây dựng hệ thống tái sinh từ mảnh thuốc giống V2 72 4.2 Khảo sát ảnh hưởng kháng sinh chọn lọc streptomycin spectinomycin lên tái sinh mảnh phát triển từ đoạn thân giống thuốc V2 74 4.3 Bắn gen vào mô thuốc V2 chọn lọc chuyển gen 79 4.4 Phân tích di truyền dòng thuốc V2 chuyển gen phương pháp PCR 84 4.5 Phân tích di truyền dòng thuốc V2 chuyển gen phương pháp Southern blot 88 4.6 Quy trình chuyển gen 90 4.7 Đặc điểm hình thái dòng thuốc V2 chuyển gen 91 4.8 Phân tích biểu protein p24 phương pháp Western blot dòng thuốc V2 chuyển gen 97 4.9 Phân tích hàm lượng protein p24 tích lũy dòng thuốc V2 chuyển gen phương pháp ELISA 100 4.10 Tóm lược đặc điểm dòng thuốc chuyển gen nguyên 106 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 107 5.1 Kết luận 108 5.2 Đề nghị 108 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ 110 TÀI LIỆU THAM KHẢO 111 PHỤ LỤC 126 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU - CHỮ VIẾT TẮT aadA Gen mã hóa aminoglycoside-3’-adenylyltransferase BADH Betain aldehyde dehydrogenase BAP Benzylaminopurine BSA Bovine serum albumin bp Base pair CaMV 35S Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter cp Chloroplast (lục lạp) cs cộng CTB Cholera toxin B subunit CTL Cytotoxic T lymphocyte - Tế bào lympho T giết tế bào nhiễm bệnh DIG Dioxygenin ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay Gag Group-specific antigen GOI Gene of interest - Gen quan tâm GFP Green fluorescent protein GUS glucoronidase HIV-1 p24 protein p24 HIV-1 IR Inverted repeat - Lặp lại đảo ngược LB Luria Bertani broth LD Lethal dose - Liều gây chết NAA Naphthalene acetic acid Nef Negative Regulatory Factor - Protein điều hòa âm nos gen mã hóa nopaline synthase promoter NT Nghiệm thức ORF Open reading frame - Khung đọc mở P Promoter p24-cco Chloroplast-codon-optimized HIV-1 p24 gene PBS Phosphate buffered saline PBST Phosphate buffered saline + Tween PCR Polymerase Chain Reaction PEG Polyethylene glycol PEPCase phosphoenolpyruvate-carboxylase PSI Pounds per inch RBS Ribosome binding site - vị trí kết hợp ribosome rrn Gen mã hóa rRNA rbcL Gen mã hóa RUBISCO tiểu đơn vị lớn Rubisco Enzyme ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase SDS PAGE SDS polyacrylamide gel electrophoresis T Terminator TBE Tris-borate buffer trnfM Gen mã hóa tRNA-Methionin trnG Gen mã hóa tRNA-Glycin T7g10 Gen 10 phage T7 E.coli TSP Total soluble protein - protein hòa tan tổng số UTR Untranslated region - Vùng không dịch mã V2 Giống thuốc Virginia TBE2 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1.1 Mô hình HIV .6 Hình 2.2.1 Mô hình cấu trúc lục lạp 14 Hình 2.2.2 Mô hình phát triển lục lạp 15 Hình 2.2.3 Bộ gen lạp thể Nicotiana tabacum .17 Hình 2.2.4 Cấu trúc DNA lục lạp chép DNA phụ thuộc tái tổ hợp 18 Hình 2.2.5 Khái niệm truyền tín hiệu anterograde retrograde 21 Hình 2.3.1 Mô hình cấu trúc tổ hợp gen biến nạp vào lạp thể .24 Hình 2.3.2 Quá trình hòa nhập gen thông qua tái tổ hợp đồng dạng 27 Hình 2.3.3 Dịch mã đa cistron lạp thể 29 Hình 2.3.4 Quá trình đồng lạp thể chuyển gen tế bào chuyển gen 30 Hình 2.4.1 Cây thuốc Nicotiana tabacum .35 Hình 3.3.1 Ladder DNA 56 Hình 3.3.2 Protein marker GE Rainbow 66 Hình 4.1.1 Sự tái sinh chồi mô thuốc V2 tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng khác .73 Hình 4.2.1 Ảnh hưởng streptomycin nồng độ khác lên tái sinh chồi từ mảnh thuốc V2 76 Hình 4.2.2 Ảnh hưởng streptomycin nồng độ khác lên phát triển đoạn thân thuốc V2 .76 Hình 4.2.3 Ảnh hưởng spectinomycin nồng độ khác lên tái sinh chồi từ mảnh thuốc V2 .77 Hình 4.2.4 Ảnh hưởng spectinomycin nồng độ khác lên phát triển đoạn thân thuốc V2 78 Hình 4.3.1 Chọn lọc chồi từ mô bắn gen môi trường có 3819-3824 Tài liệu internet 186 Apelex, semidry blotting, tanks for bloting (http://www.apelex.fr/media/file/ semidryUK.pdf) 187 Fermantas (http://www.fermentas.com/en/products/all/conventional-restriction -enzymes) 188 Nông nghiệp Việt Nam (http://nongnghiep.vn/nongnghiepvn/72/45/45/ 70411/ Cay-thuoc-la-bi-benh-gi.aspx) 189 Nông nghiệp Việt Nam (http://nongnghiep.vn/nongnghiepvn/vi-vn/72/45/45/ 75510/Lo-trinh-phu-hop-cho-cay-thuoc-la.aspx) 190 WHO (2011), Epidemic update and health sector progress towards Universal Access, progress report (http://www.who.int/hiv/ pub/progress_report2011/ hiv_full_report_ 2011.pdf) 125 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP Kit ly trích DNA plasmid: QIAGEN Midi, Plasmid Kit (25), Catalog no 12143 Thành phần - QIAGEN-tip 100, Buffer P1 110 ml, Buffer P2 110 ml, Buffer P3 110 ml, Buffer QBT 110 ml, Buffer QC x 190 ml, Buffer QF 170 ml, RNase A* 11 mg, LyseBlue 110 μl, Handbook Các bước thực Lấy khuẩn lạc mọc từ đĩa nuôi vi khuẩn có chọn lọc cấy vào 2-5 ml môi trường LB chứa kháng sinh chọn lọc thích hợp Ủ 37oC điều kiện lắc mạnh (khoảng 300 rpm) Dùng bình chứa tích gấp lần thể tích môi trường Pha loảng môi trường thứ theo tỉ lệ 1/500 đến 1/1000 với môi trường LB có chất chọn lọc, cách lấy 100-200 l môi trường ban đầu cho vào 100 ml môi trường Nuôi 37oC 12 đến 16 điều kiện lắc mạnh (khoảng 300 rpm) Thu tế bào vi khuẩn ly tâm 6000 x g 15 phút 4oC Hoà cặn vi khuẩn ml Buffer P1thành thể dịch huyền phù Thêm 125 ml Buffer P2, trộn cách đảo ngược ống mạnh 4-6 lần, ủ nhiệt độ phòng phút Thêm 125 ml dung dịch Buffer làm lạnh sẵn, trộn nhanh cách đảo ngược ống nhiều lần ủ đá 30 phút Ly tâm ống ≥ 20.000 x g 30 phút 4oC Thu nhanh lấy phần chứa DNA plasmid Ly tâm phần lập lại ≥ 20.000 x g 15 phút 4oC Thu nhanh lấy phần chứa DNA plasmid Cân cột QIAGEN-tip 100 với ml Buffer QBT, dịch chảy tự nhiên hết cột 126 10 Cho phần dịch bước vào cột QIAGEN tip cho dịch qua resin nhờ lực chảy tự nhiên 11 Rửa cột QIAGEN-tip với x 10 ml Buffer QC 12 Rửa DNA với ml Buffer QF Kit ly trích DNA thực vật: DNeasy® Plant Mini Kit, Catalog No 69103 Thành phần Dùng cho 20 lần, gồm: DNeasy spin columns 20 (colorless),QIAshredder™ 20 spin columns (lilac), Collection tubes (2 ml) 20, Collection tubes 50 ml, Buffer AP1 15 ml, Buffer AP2 10 ml, Buffer AP3/E* 12 ml, Buffer AW ml, Buffer AE 12 ml, RNase A (100 mg/ml) 110 μl, Handbook Các bước thực Nghiền 100 mg nitrogen lỏng thành bột mịn với chày cối Chuyển bột sang ống thí nghiệm kèm theo kit trước bột tan chảy Thêm 400 μl Buffer AP1 μl dung dịch stock RNase A (100 mg/ml) cho tối đa 100 mg hỗn hợp nghiền vortex mạnh không khối đóng cục Ủ hỗn hợp 10 phút 65°C Trộn 2-3 lần lúc ủ cách đảo ngược ống để ly giải tế bào Thêm 130 μl of Buffer AP2 vào dịch ly giải, trộn đều, ủ phút đá Giai đoạn nhằm tủa chất tẩy, protein polysaccharides Ly tâm dịch ly giải phút tốc độ tối đa Cho dịch ly giải vào cột lắng QIAshredder đặt ống thu nhận ml ly tâm hai phút tốc độ tối đa Chuyển phần dịch chảy qua cột bước sang ống mà không khuấy trộn cặn Thông thường thể tích thu khoảng từ 450 μl Thêm 1,5 thể tích Buffer AP3/E vào dịch ly giải trộn pippette 127 Lấy 650 μl hỗn hợp từ bước bao gồm phần tủa có tạo thành cho vào cột lắng mini DNeasy đặt ống thu ml kèm theo kit Ly tâm phút ≥6000 x g (tương đương khoảng ≥8000 rpm) bỏ phần dịch chảy qua Sử dụng lại ống thu cho bước 9 Lập lại bước với mẫu lại Bỏ phần dịch chảy qua ống thu 10 Gắn cột DNeasy vào ống thu ml mới, thêm 500 μl Buffer AW vào cột DNeasy ly tâm phút ≥6000 x g (≥8000 rpm) Loại bỏ phần dịch chảy qua, dùng lại ống thu cho bước 11 11 Cho 500 μl Buffer AW vào cột DNeasy ly tâm phút tốc độ tối đa để làm khô màng 12 Chuyển cột DNeasy gắn sang ống dùng pipette hút 100 μl Buffer AE làm nóng trước (65°C) cho trực tiếp lên màng cột DNeasy Ủ phút nhiệt độ phòng sau ly tâm phút ≥6000 x g (≥8000 rpm) để rửa DNA Có thể dùng thể tích Buffer AE 50 μl 200 μl để tăng giảm nồng độ DNA thu nhận 13 Lập lại rửa bước 12 với ống thu ống thu để nhận lượng DNA tối đa Phân tích PCR Thành phần tham gia phản ứng PCR + Taq polymerase: Go Taq (Promega, Mỹ), accu Taq (Sigma) + dNTP (Sigma, Mỹ) + DNA template + Primer + Buffer, MgCl2 kèm theo taq polymerase Khuếch đại đoạn trình tự 1000 bp - Thành phần phản ứng: + Nước cất vô trùng 13,8 µl 128 + X Go taq flexi buffer µl + MgCl2, 2.5M µl + Mồi xuôi 10 pm µl + Mồi ngược 10 pm µl + dNTP’s 10 mM µl + GoTaq Polymerase 0,2 µl + DNA template µl + Thể tích cuối: 25 µl - Phản ứng luân nhiệt: 30 chu kỳ theo bước sau: 95 oC/ phút [95 oC/ phút; 50-52 oC/ phút; 72 oC/ phút] 72 oC/ phút Khuếch đại đoạn trình tự đặc hiệu 1000 bp - Thành phần phản ứng: + H2O cất vô trùng 38 µl + 10 x buffer µl + dNTPs (20 mM) µl + AccuTaq µl + DNA µl + Mồi xuôi (10 pmol) µl + Mồi ngược (10 pmol) µl + DMSO µl + Thể tích cuối 50 µl - Phản ứng luân nhiệt: 30 chu kỳ theo bước sau: 98 oC/ 30 giây [ 94 oC/ 30 giây ; 50-60 oC/ 30 giây ; 68 oC /4 phút] 68 oC 10 phút Sản phẩm PCR bảo quản oC sử dụng Kết PCR điện di gel dùng thang DNA chuẩn kb (Biolabs) [32, 173] Điện di DNA 129 - Agarose: 0,8% - Dung dịch đệm chạy điện di TBE 5X: 0,45 M Tris-borate; 0,01 M EDTA - 6X gel loading dye (Promega, Mỹ) - Ethidium bromide 10 mg/ml (Sigma, Mỹ) Phân tích Southern blot Phản ứng PCR đánh dấu DIG - Các thành phần phản ứng PCR đánh dấu DIG: mM dATP ; mM dCTP, mM dGTP, 1,3 mM dTTP, 0,7 DIG-11-dUTP Taq polymerase, 10X PCR dung dịch đệm, MgCl2, nước cất lần vô trùng (Cat No 11 585 550 910, Roche, Thụy Sĩ) - Chuẩn bị thành phần ống phản ứng PCR theo thể tích gồm: l 10X dung dịch đệm PCR ; mM MgCl2; l 10X hỗn hợp PCR đánh dấu DIG ; 0,5 mM mồi xuôi ; 0,5 mM mồi ngược ; U Taq polymerase ; 1-2 l khuôn mẫu DNA, nước cất vừa đủ 50 l - Phản ứng luân nhiệt (PCR): 95 oC : phút (30 chu kỳ) [95 oC/ phút; 52 oC/ phút; 72 oC/ phút] 72 oC/ phút - Dung dịch đệm TE: 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, mM EDTA, pH 8,0 - Dung dịch tủa DNA: M Sodium acetate, điều chỉnh pH 5,2 100% glacial acetic acid - Isopropanol, ethanol tuyệt đối, ethanol 70% Xử lý gel sau chạy điện di - Dung dịch khử purine (depurinating solution): HCl 0,25 M - Dung dịch biến tính (denaturation solution): 1,5 M NaCl/0,5 M NaOH (giữ nhiệt độ phòng) - Dung dịch trung hòa (neutralization solution): 1,5 M NaCl/0,5 M Tris-Cl, pH 7,0 (giữ nhiệt độ phòng) Chuyển thấm mao dẫn DNA từ gel sang màng - Dung dịch SSC (saline-sodium citrate) 20X (Cat No 11 666 681 001, Roche, 130 Thụy Sĩ): M sodium chloride 300 mM trisodium citrate, điều chỉnh đến pH 7,0 HCl - Màng nylon, tích điện dương (Cat No 11 209 272 001, Roche, Thụy Sĩ) - Giấy thấm Whatman 3MM lớn, phim trong, giấy thấm Tiền lai Lai Dung dịch DIG Easy hyb (Cat No 11 603 558 910, Roche, Thụy Sĩ), gồm thành phần: - 5× SSC - 0,1% (w/v) N-lauroylsarcosine - 0,02% (w/v) SDS - 1% Blocking Reagent Rửa sau lai (Bộ dung dịch đệm cố định rửa, Cat No 11 585 762 001, Roche, Thụy Sĩ) - Dung dịch rửa A: 2X SSC, 0,1% sodium dedocyl sulphate (SDS) - Dung dịch rửa B: 0,5X SSC, 0,1% SDS - Dung dịch đệm 1A: 0,1 M maleic acid, M NaCl, 0,3% Tween-20, pH 8,0 Điều chỉnh NaOH - Dung dịch đệm 1B: Giống 1A, ngoại trừ 0,15 M NaCl - Dung dịch mẹ blocking (thành phần cung cấp kèm theo hệ thống DIG): Hòa tan 10 g hóa chất blocking 100 ml dung dịch 1B đến tan hoàn toàn chỉnh pH đến 7,5 - Dung dịch đệm 2: Dung dịch blocking 1% Phản ứng quang hóa phát băng lai - Anti DIG-AP, Fab: anti digoxigenin Fab fragment cừu đa dòng, kết hợp alkaline phosphatase, 750 U/ml (Cat No 11 093 274 001, Roche, Thụy Sĩ) - Dung dịch đệm chất 3: 0,1 M Tris base, 0,1 M NaCl pH 9,5, thêm 50 mM MgCl2 131 - Dung dịch chất CDP Star (Cat No 11 759 051 001, Roche, Thụy Sĩ): hòa 100 l CDP Star 10 ml dung dịch đệm chất Ghi nhận kết phim âm - Phim X quang Amersham Hyperfilm TM ECL - Dung dịch rửa (developer) phim Kodak - Dung dịch cố định (fixer) phim Kodak Phân tích Western blot Ly trích protein tổng tan - Dung dịch ly trích protein: 50 mM Hepes/KOH pH 7,5, mM EDTA, 10mM potassium acetate, mM Magnessium acetate, 30 mM β- mercaptoethanol, mM PMSF - Quick Start™ Bradford Protein Assay SDS PAGE - Bộ hộp điện di Mini Protean® Cell (Bio-rad) - Dung dịch acrylamide/Bis 30% 37,5:1 (Bio-rad) - Dung dịch SDS 10%: Hòa 10 g SDS vào nước cất để dung dịch đạt 100 ml - Dung dịch Tris HCl 1,5 M, pH 8,8: Hòa tan 27,33 g Tris base vào 80 ml nước cất, điều chỉnh đến pH 8,8 HCl N, bổ sung thêm nước cất đến 100 ml - Dung dịch Tris HCl 0,5 M pH 6,8: Hòa tan g Tris base vào 60 ml nước cất, điều chỉnh pH 6,8 HCl N - Dung dịch ammonium persulfate (APS) 10%: cân 100 mg APS, thêm nước cất lần cho đủ 1ml - TEMED - Dung dịch đệm nạp mẫu: 3,55 ml nước cất 1,25 ml Tris HCl 0,5 M pH 6,8, 2,5 ml glycerol, 2,0 ml SDS 10%, 0,2 ml bromophenol blue 0,5% Thể tích tổng dung dịch đến 9,5 ml, bảo quản nhiệt độ phòng Khi dùng cho thêm 50 l mecarptoethanol vào 950 l dung dịch đệm nạp mẫu 132 - Marker protein GE Rainbow RPN800E - Dung dịch đệm 10X chạy điện di protein pH 8,3: Hòa tan 30,3 g Tris base 144,0 g Glycine, 10,0 g SDS nước khử ion thành l Không chỉnh pH acid base Bảo quản oC - Dung dịch nhuộm protein điện di gel: Bio Safe Coomassie Stain (Bio-rad, Mini-PROTEAN® Cell Instruction Manual) Chuyển protein từ gel qua màng Dung dịch đệm chuyển protein sang màng (1 lít) 5,82 g Trizma Base, 2,93 g Glycine, 200 ml Methanol, nước cất vừa đủ lít Phát protein mục tiêu màng - Dung dịch đệm PBS: Phosphat buffer saline (PBS): g NaCl , 0,2 g KCl , 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4, nước cất vừa đủ lít, pH 7,4 - Dung dịch cố định (5% skimmed milk PBS): 5g skimmed milk (Marvel) pha PBS vừa đủ 100 ml - Dung dịch đệm rửa: Dung dịch đệm PBS chứa 0,1% Tween 20 - Kháng thể thứ từ cừu kháng HIV-1 p24 - Kháng thể thứ hai từ dê kháng kháng thể cừu có kết hợp horseradish peroxidase - 3,3'-diaminobenzidine (SIGMA FAST, dạng viên): Hòa tan viên vào 15 ml nước cất Ghi nhận kết phim âm - Phim X quang Amersham Hyperfilm TM ECL - Dung dịch rửa (developer) phim Kodak - Dung dịch cố định (fixer) phim Kodak Phân tích ELISA - Dung dịch ly trích protein: 2,5 g bovine serum albumin (BSA); 0,1 ml Tween 20; 0,03 g mM PMSF; 0,239 ml -mercaptoethanol; pha 100 ml 133 - Kháng thể đa dòng kháng HIV-1 p24 cừu (Aalto Bioreagents, Ireland): pha loãng nồng độ 7,5 μg/ml dung dịch đệm sodium cacbonat/bicarbonate 100 mM, pH 9,6 - Dung dịch rửa (dung dịch 0,1% Tween 20 PBS) - Dung dịch cố định (2,5% BSA PBS) - Cơ chất phosphate p-nitrophenyl nồng độ 1,0 mg/ml (SIGMA FAST, dạng viên, Sigma, Mỹ) PHỤ LỤC KẾT QUẢ TÁI SINH CHỒI THUỐC LÁ Thống kê số liệu Function: ANOVA-1 Data case no to 27 One way ANOVA grouped over variable (NT) with values from to Variable (SOCHOI) ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 14398.296 1799.787 25.562 0.0000 Within 18 1267.333 70.407 Total 26 15665.630 Coefficient of Variation = 12.58% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 106.000 35.333 2.52 4.84 3.00 170.000 56.667 8.02 4.84 3.00 157.000 52.333 8.08 4.84 3.00 340.000 113.333 8.02 4.84 134 3.00 199.000 66.333 3.06 4.84 3.00 265.000 88.333 19.50 4.84 3.00 154.000 51.333 5.13 4.84 3.00 152.000 50.667 2.08 4.84 3.00 258.000 86.000 3.61 4.84 -Total 27.00 1801.000 66.704 24.55 4.72 Within 8.39 Bartlett's test Chi-square = 14.274 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.075Data File : Function : RANGE Error Mean Square = 70.41 Error Degrees of Freedom = 18 No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 19.72 s_ = 4.844 at alpha = 0.010 x  Original Order Ranked Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 1= 2= 3= 4= 5= 6= 7= 8= 9= 35.33 E Mean 56.67 DE Mean 52.33 DE Mean 113.3 A Mean 66.33 CD Mean 88.33 B Mean 51.33 DE Mean 50.67 DE Mean 86.00 BC Mean 4= 6= 9= 5= 2= 3= 7= 8= 1= 113.3 A 88.33 B 86.00 BC 66.33 CD 56.67 DE 52.33 DE 51.33 DE 50.67 DE 35.33 E 135 Đặc điểm hình thái chồi hình thành nghiệm thức - Nghiệm thức 1: Chồi hình thành có kích thước to, nhỏ không đều, số chồi có to Mô sẹo tập trung nhiều, xốp, kích thước to - Nghiện thức 2: Chồi đồng Mô sẹo mọc chen cụm chồi, mô sẹo xốp trắng - Nghiệm thức 3: Chồi có kích thước không đều, số chồi to Mô sẹo mọc rải rác - Nghiệm thức 4: Chồi tạo thành nhiều, tập trung mép, kích thước đồng Mô sẹo ít, - Nghiệm thức 5: Chồi hình thành nhỏ, xoăn Mô sẹo ít, mọc rải rác - Nghiệm thức 6: Chồi hình thành nhiều, đồng Mô sẹo chắc, mọc xen lẫn gốc chồi - Nghiệm thức 7: Cụm chồi hình thành to, to xoắn bất thường Mô sẹo trắng gốc, cuống - Nghiệm thức 8: Cụm chồi không đồng đều, xoăn, mọc rải rác mép mô Các cụm chồi to, có hình thành mô sẹo gốc - Nghiệm thức 9: Chồi hình thành có phát triển to, không đều, xoăn, số cụm chồi phát triển Mô sẹo ít, mọc gốc 136 Giá trị OD PHỤ LỤC KẾT QUẢ PHÂN TÍCH WESTERN BLOT Nồng độ BSA mg/ml Đồ thị đường chuẩn BSA Giá trị OD PHỤ LỤC 4: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ELISA Kết phân tích in vitro Nồng độ BSA mg/ml Đồ thị đường chuẩn BSA 137 Giá trị OD Nồng độ p24 μg/ml Đồ thị đường chuẩn protein p24 Giá trị OD Kết phân tích ex vitro Nồng độ BSA mg/ml Đồ thị đường chuẩn BSA 138 Giá trị OD Nồng độ p24 μg/ml Đồ thị đường chuẩn protein p24 139 [...]... các yếu tố chọn l c đối với mô, cây thuốc l - Xây dựng qui trình chuyển gen vào l c l p cây thuốc l bằng phương pháp bắn gen - Chọn l c, tái sinh và thu nhận cây chuyển gen - Phân tích sinh học phân tử về di truyển cây thuốc l chuyển gen l c l p - Phân tích biểu hiện protein HIV- 1 p24 tái tổ hợp trong cây thuốc l chuyển gen l c l p 1. 3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn - Protein HIV- 1 p24 tái tổ hợp... cụ thể, bao gồm: l c l p (chloroplast), sắc l p (chromoplast), vô sắc l p (leucoplast), gerontoplast, etioplast Vô sắc l p l i có các dạng đặc biệt như amyloplast, elaioplast aleuroplast Tất cả các dạng l p thể được phát triển từ tiền l p thể (proplastid) hoặc do chuyển hóa giữa các dạng [ 31, 45, 60, 62, 66, 72, 75, 92, 10 6, 11 6, 12 9, 17 3, 17 8, 17 9] 2.2.2 L c l p (Chloroplast) L c l p l bào quan thực... l chuyển gen 10 3 Bảng 4 .10 .1 Tóm l ợc đặc điểm các dòng thuốc l chuyển gen và nguyên bản 10 6 CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1 Để tài Nghiên cứu chuyển nạp gen HIV- 1 p24 tạo protein kháng nguyên vào l c l p cây thuốc l (Nicotiana tabacum L. ) bằng phương pháp bắn gen đã được thực hiện tại Phòng Công nghệ Gen, Viện Sinh học Nhiệt đới 1. 1 Mục đích nghiên cứu Tính cấp thiết HIV l một đại dịch mà cho đến... Việt Nam - Chuyển thành công gen HIV- 1 p24 vào l c l p cây thuốc l Virgnia - Cây thuốc l Virginia chuyển gen HIV- 1 p24 biểu hiện protein p24 ổn định và có kiểu hình bình thường 2 1. 2 Nội dung và phạm vi của vấn đề nghiên cứu - Chuẩn bị nguồn plasmid dùng để chuyển gen l c l p thuốc l - Ứng dụng các phương pháp nuôi cấy mô để tạo nguồn nguyên liệu in vitro phục vụ chuyển gen, xây dựng hệ thống tái... tài l nghiên cứu chuyển gen HIV- 1 p24 vào l c l p giống thuốc l Virginia có năng suất cao, được thuần hóa và trồng phổ biến ở Việt Nam; kiểm tra, đánh giá sự sinh trưởng và phát triển của cây chuyển gen, sự biểu hiện của protein tái tổ hợp HIV- 1 p24 Tính mới của đề tài - Xây dựng quy trình chuyển gen vào l c l p bằng phương pháp bắn gen trên giống thuốc l Virginia đã được thuần hóa tại Việt Nam - Chuyển. .. V2 nguyên bản và chuyển gen trồng trong vườn ươm 95 Bảng 4.8 .1 Hàm l ợng protein tổng tan ở các dòng phân tích 97 Bảng 4.9 .1 Hàm l ợng protein tổng tan ở các dòng thuốc l phân tích 10 1 Bảng 4.9.2 Hàm l ợng protein p24 ở các dòng thuốc l chuyển gen 10 1 Bảng 4.9.3 Hàm l ợng protein tổng tan ở các dòng thuốc l phân tích 10 2 Bảng 4.9.4 Hàm l ợng protein p24 ở các dòng thuốc l chuyển gen 10 3... vững từ biến đổi gen nhân hoặc l c l p [11 0] Trong nghiên cứu của luận văn này, gen HIV- 1 p24 được biến nạp vào giống thuốc l Virginia TBE2 (gọi tắt l V 2) và bước đầu khảo sát khả năng biểu hiện protein trong cây Đây l giống thuốc l vàng thương mại đã được nội địa hóa, có 11 năng suất cao và đã được trồng trên nhiều vùng nguyên liệu của Việt Nam 2.2 L p thể (plastid) ở thực vật 2.2 .1 Giới thiệu về... hiện diện trong mỗi l p thể của tế bào trưởng thành [10 0] Ở một chiếc l trưởng thành, các tế bào thịt l chứa hàng trăm l c l p dẫn tới kết quả l chỉ riêng bộ gen này có thể chiếm tới 20% của hàm l ợng DNA tổng số trong tế bào [12 , 13 7] Chúng ổn định ở tất cả các loại biệt hóa của l p thể: tiền l p thể mô phân sinh, các l c l p, các sắc l p vàng hoặc đỏ, các vô sắc l p Bộ gen l p thể di truyền theo... CO2 vào ribulose -1, 5 biphosphate trong chu trình Calvin Đây không chỉ l thành phần protein chủ yếu trong stroma l c l p, mà còn được cho l protein dồi dào nhất trên trái đất, do đó thật đáng l u ý l một tiểu đơn vị của nó l i được mã hóa bởi bộ gen l c l p [ 31] Bảng 2.2 .1 Các gen l p thể đã được xác định Gen được mã hóa trong l p thể Chức năng Số l ợng gen Gen cho bộ máy di truyền rRNA (23S, 16 S,... trong l c l p của các tế bào thịt l ở mép l của cây thuốc l nguyên vẹn dẫn tới sự biểu hiện tạm thời GFP trong l c l p Sự thuận l i của phương pháp này rất rõ ràng l : các tế bào vẫn sống được sau khi tiêm, tế bào chuyển gen có thể được ghi nhận dễ dàng, hiện trạng tế bào vẫn tồn tại nguyên vẹn Bất l i của phương pháp này l thao tác thực hiện rất khó khăn và hiệu quả rất thấp Phương pháp polyethylene ... KHOA HỌC TỰ NHIÊN Phan Tường L c NGHIÊN CỨU CHUYỂN NẠP GEN HIV- 1 p24 TẠO PROTEIN KHÁNG NGUYÊN VÀO L C L P CÂY THUỐC L (Nicotiana tabacum L. ) BẰNG PHƯƠNG PHÁP BẮN GEN Chuyên ngành: Hóa Sinh học... dòng thuốc chuyển gen nguyên 10 6 CHƯƠNG MỞ ĐẦU Để tài Nghiên cứu chuyển nạp gen HIV- 1 p24 tạo protein kháng nguyên vào l c l p thuốc (Nicotiana tabacum L. ) phương pháp bắn gen thực... thể, bao gồm: l c l p (chloroplast), sắc l p (chromoplast), vô sắc l p (leucoplast), gerontoplast, etioplast Vô sắc l p l i có dạng đặc biệt amyloplast, elaioplast aleuroplast Tất dạng l p thể phát