Nghiến cứu biến nạp gen ZmNAC vào một số dòng ngô thông qua vi khuẩn grobacterium tumefaciens

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN TIẾN NAM Tên đề tài: NGHIÊN CỨU BIẾN NẠP GEN ZmNAC VÀO MỘT SỐ DÒNG NGÔ THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : Công nghệ Sinh học - Công nghệ Thực phẩm Khóa học : 2010 - 2014 Thái Nguyên - 2014 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN TIẾN NAM Tên đề tài: NGHIÊN CỨU BIẾN NẠP GEN ZmNAC VÀO MỘT SỐ DÒNG NGÔ THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : Công nghệ Sinh học - Công nghệ Thực phẩm Khóa học : 2010 - 2014 Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Văn Đồng (Viện Di truyền Nông nghiệp) T.S Nguyễn Văn Duy (Khoa CNSH-CNTP - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên) Thái Nguyên - 2014 LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực để tài nghiên cứu khóa luận tốt nghiệp Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam, nhận nhiều giúp đỡ từ phía gia đình nhà trường, đặc biệt PGS TS Nguyễn Văn Đồng anh chị cán bộ, nhân viên làm việc Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ suốt trình thực khóa luận Trước hết, xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến PGS TS Nguyễn Văn Đồng – Giám đốc Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật tạo điều kiện giúp đỡ thực tập hoàn thành đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Thầy giáo Nguyễn Văn Duy công tác Khoa Công Nghệ Sinh Học – Công Nghệ Thực Phẩm, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, thầy động viên bảo, giúp đỡ hoàn thành đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn K.S Trần Duy Hưng tận tình hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho hoàn thành khóa luận suốt thời gian thực tập phòng thí nghiệm Cuối xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè người động viên, giúp đỡ điểm tựa vững cho trình thực đề tài Do trình độ thời gian thực đề tài có giới hạn nên tránh khỏi sai sót Em mong nhận đóng góp thầy cô bạn để đề tài em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Thái nguyên, 25 tháng năm 2014 Sinh viên thực tập Nguyễn Tiến Nam DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT AS : Acetosyrinegone (3,5-dimethoxy-4-hydroxy Actophenone) A.tumefaciens : Agrobacteriumtumefaciens CTAB : Cetyltrimethyl ammonium bromide cs : cộng DNA : Deoxyribonucleic acid FAO : Food and Agriculture Organization EDTA : Ethylene diamine tetra acetate NAC : NAM-no apical meristem, ATAF-Arabidopsis transcription activation factor, CUC-cup-shaped cotyledon PCR : Polymerase Chain Reaction PPT : Phosphinothricin Ti-plasmid : Tumor Icluding Plasmid T-DNA : Transfer-DNA Vir : Virulence (vùng gây độc) MỤC LỤC Trang PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu nghiên cứu 1.3 Ý nghĩa đề tài PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1 Nguồn gốc, vai trò vị trí ngô hệ thống trồng 2.1.1 Nguồn gốc phân loại 2.1.2 Vai trò ngô kinh tế 2.2 Đặc điểm sinh học ngô 2.2.1 Rễ ngô 2.2.2 Thân ngô 2.2.3 Lá ngô, hạt ngô 2.2.4 Sinh trưởng phát triển ngô 2.3 Tình hình sản xuất ngô giới Việt Nam 2.3.1 Tình hình sản xuất ngô giới 2.3.2 Tình hình sản xuất ngô Việt Nam 2.4 Các phương pháp chuyển gen thực vật 2.4.1 Phương pháp chuyển gen trực tiếp 2.4.2 Phương pháp chuyển gen gián tiếp 10 2.4.3 Các phương pháp kiểm tra có mặt gen chuyển chuyển gen sinh học phân tử 15 2.5 Giới thiệu gen NAC 17 2.5.1 Nghiên cứu gen NAC Arabidopsis 18 2.5.2 Nghiên cứu gen NAC ngô 19 2.6 Tình hình nghiên cứu đặc tính chịu hạn ngô 20 PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 Đối tượng (vật liệu) phạm vi nghiên cứu 21 3.1.1 Đối tượng (vật liệu) nghiên cứu 21 3.1.2 Hóa chất dụng cụ thí nghiệm 21 3.1.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu 22 3.2 Nội dung nghiên cứu 22 3.3 Phương pháp nghiên cứu 22 3.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm, theo dõi, đánh giá xử lý kết 27 3.4.1 Nghiên cứu biến nạp gen ZmNAC vào dòng ngô CM8, VH1, C8H9 27 3.4.2 Các tiêu theo dõi đánh giá 28 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1 Kết nghiên cứu biến nạp gen ZmNAC vào dòng ngô thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 29 4.1.1 Kết theo dõi đánh giá khả sống sót phôi non sau giai đoạn nuôi phục hồi REM 29 4.1.2 Kết theo dõi đánh giá khả tạo mô sẹo (callus) dòng ngô môi trường chọn lọc ECM 30 4.1.3 Kết theo dõi đánh giá khả tái sinh chồi dòng ngô môi trường chọn lọc SeM 31 4.2 Kết kiểm tra có mặt gen ZmNAC dòng ngô chuyển gen 32 4.2.1 Kết tách chiết DNA tổng số dòng ngô chuyển gen 32 4.2.2 Kết kiểm tra có mặt gen bar dòng ngô chuyển gen 35 4.2.3 Kết kiểm tra có mặt gen ZmNAC dòng ngô chuyển gen 36 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 5.1 Kết luận 38 5.2 Kiến nghị 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Thành phần hóa học phận hạt Bảng 2.2 Tình hình sản xuất ngô giới năm gần Bảng 2.3 Tình hình sản xuất ngô nước đứng đầu giới Bảng 2.4 Tình hình sản xuất ngô Việt Nam năm gần Bảng 3.1 Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu 21 Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR kiểm tra có mặt gen ZmNAC dòng ngô chuyển gen 26 Bảng 4.1 Kết theo dõi đánh giá khả sống sót phôi non sau giai đoạn nuôi phục hồi REM 29 Bảng 4.2 Kết theo dõi, đánh giá khả tạo mô sẹo tạo chồi mẫu môi trường chọn lọc 30 Bảng 4.3 Kết theo dõi đánh giá khả tái sinh chồi mẫu môi trường chọn lọc 31 Bảng 4.4 Kết tách chiết DNA tổng số dòng ngô chuyển gen đo quang phổ nanodrop 34 Bảng 4.5 Kết kiểm tra có mặt gen ZmNAC dòng ngô chuyển gen 36 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Hình ảnh rễ mầm ngô Hình 2.2 Lá ngô Hình 2.3 Hạt ngô bổ đôi Hình 2.4 Cấu trúc Ti-plasmid 12 Hình 2.5 Sơ đồ cấu trúc vector nhị thể 14 Hình 2.6 Sơ đồ cấu trúc vector liên hợp 15 Hình 3.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình biến nạp gen vào ngô (Zea mays L) 23 Hình 4.1 Hình ảnh phôi non sống sót sau lây nhiễm dòng ngô 30 Hình 4.2 Hình ảnh tạo mô sẹo mẫu thuộc dòng CM8, VH1, C8H9 31 Hình 4.3 Hình ảnh tái sinh chồi dòng ngô 32 Hình 4.4 Kết điện di DNA tổng số dòng ngô chuyển gen 33 Hình 4.5 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi bar dòng ngô chuyển gen 35 Hình 4.6 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại gen ZmNAC dòng ngô chuyển gen 37 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ngô (Zea mays L.) ba lương thực quan trọng giới So với lúa mì lúa gạo ngô đứng thứ ba diện tích, thứ hai suất thứ sản lượng Với giá trị kinh tế cao khả thích ứng rộng, ngô trồng hầu hết vùng giới Năm 2012, diện tích trồng ngô giới đạt 174,64 triệu với tổng sản lượng đạt 838 triệu Trong Mỹ nước có diện tích lớn với 35,5 triệu ha, sản lượng đạt 274 triệu [26] Nhu cầu ngô giới dự báo tăng lên 50% với 852 triệu vào năm 2020 vượt qua gạo lúa mì [20] Tại Việt Nam, ngô lương thực quan trọng thứ hai sau lúa, đối tượng chủ lực công xóa đói giảm nghèo, đặc biệt tỉnh vùng núi Năm 2012, diện tích gieo trồng ngô nước đạt gần 1,2 triệu với sản lượng 4,6 triệu tấn, suất đạt 40,09 tạ/ha Tuy nhiên hàng năm nước ta phải nhập ngô với lượng lớn, 1,614 triệu năm 2012 với trị giá 500 triệu USD [14] Theo chiến lược Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn đến năm 2020, sản lượng ngô Việt Nam cần đạt - triệu tấn/năm để đảm bảo cung cấp đủ nhu cầu nước bước tham gia xuất Hiện việc chọn tạo giống ngô cho suất cao, phẩm chất tốt, chống chịu điều kiện ngoại cảnh khắc nghiệt vấn đề đáng quan tâm đặt hàng đầu Bên cạnh phương pháp chọn lọc truyền thống, với phát triển vượt bậc công nghệ sinh học tạo thực vật chuyển gen nói chung, dòng ngô chuyển gen nói riêng mang đặc tính quý mà phương pháp truyền thống không tạo Kĩ thuật chuyển gen vào ngô nghiên cứu trở thành công cụ quan trọng từ năm 90 Cây ngô chuyển gen thương mại hóa vào năm 1996, đến năm 2012 diện tích trồng ngô biến đổi gen đạt 55,1 triệu chiếm 31,6% tổng diện tích trồng ngô toàn giới Hai phương pháp thường áp dụng vào chuyển gen ngô chuyển gen trực tiếp súng bắn gene chuyển gen gián tiếp vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Chuyển gen thông qua vi khuẩn có ưu điểm dễ tiến hành, tần số biến nạp cao có tính ổn định qua hệ sau, tiết kiệm chi phí tiến hành hầu hết phòng thí nghiệm [25] Hạn yếu tố bất thuận làm giảm sinh khối thân, suất ngô giới Việt Nam, vùng trồng ngô dựa vào nước tự nhiên Theo Viện khoa học Nông nghiệp Việt Nam diện tích trồng ngô phụ thuộc vào nước mưa chiếm khoảng 70%, diện tích chủ động nước tưới chiếm khoảng gần 30% Ở nước ta lượng mưa hàng năm phổ biến từ 1700 2000 mm đủ cho nhu cầu phát triển ngô, nhiên lượng mưa tập trung theo mùa nên mùa khô ngô không đủ nước để phát triển Vì cần tập trung nghiên cứu để tạo giống ngô có khả chống chịu hạn cho suất cao [1] 1.2 Mục đích yêu cầu nghiên cứu 1.2.1 Mục đích - Biến nạp gen ZmNAC vào số dòng ngô chọn lọc thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens - Kiểm tra có mặt gen ZmNAC dòng ngô chuyển gen phương pháp PCR 1.2.2 Yêu cầu Biến nạp gen thành công ZmNAC vào số dòng ngô chọn lọc thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 1.3 Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học Kết nghiên cứu đề tài góp phần hoàn thiện quy trình chuyển gen vào dòng ngô trồng Phục vụ cho công trình nghiên cứu khoa học trồng chuyển gen 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn Qua kết nghiên cứu đề tài đưa quy trình hoàn thiện chuyển gen số dòng ngô nói riêng trồng nông nghiệp nói chung Bước đầu phục vụ cho sản xuất dòng ngô có đặc tính ưu việt đặc biệt khả chống chịu hạn góp phần làm tăng suất chất lượng trồng 30 a b c Hình 4.1 Hình ảnh phôi non sống sót sau lây nhiễm dòng ngô Ghi chú: a- dòng CM8 b- dòng VH1 c- dòng C8H9 4.1.2 Kết theo dõi đánh giá khả tạo mô sẹo (callus) dòng ngô môi trường chọn lọc ECM Tiếp theo, áp dụng hoàn toàn quy trình Phạm Thị Lý Thu cs năm 2005, phôi sau nuôi cấy phục hồi chuyển sang môi trường chọn lọc mô sẹo ECM có bổ sung kháng sinh chọn lọc tương ứng 20 ngày Bảng 4.2 Kết theo dõi, đánh giá khả tạo mô sẹo tạo chồi mẫu môi trường chọn lọc Số mẫu sau nuôi Số mẫu sau cấy phục hồi chọn lọc (ECM) (REM) STT Các dòng ngô Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) CM8 253 178 70,5 VH1 236 162 68,8 C8H9 266 148 55,5 Kết bảng 4.2 cho thấy tỷ lệ tạo mô sẹo dòng ngô có chênh lệch, dòng CM8 VH1 cho tỷ lệ tương đối cao, 70,5% 68,8%, với dòng C8H9 lại cho tỷ lệ thấp đáng kể so với dòng lại với 55,7% Kết cho thấy tỷ lệ tạo mô sẹo mẫu biến nạp không phụ thuộc vào thành phần môi trường chọn lọc mà phụ thuộc vào dòng ngô lấy phôi biến nạp Kết tương đối xác so với kết nghiên cứu Phạm Thị 31 Lý Thu cs (2005) [13] khoảng 53-71% Do quy trình thành phần môi trường sử dụng cho thí nghiệm biến nạp a b c Hình 4.2 Hình ảnh tạo mô sẹo mẫu thuộc dòng CM8, VH1, C8H9 Ghi chú: a- dòng CM8 b- dòng VH1 c- dòng C8H9 4.1.3 Kết theo dõi đánh giá khả tái sinh chồi dòng ngô môi trường chọn lọc SeM Bảng 4.3 Kết theo dõi đánh giá khả tái sinh chồi mẫu môi trường chọn lọc STT Các dòng ngô Số mẫu sau chọn lọc (ECM) Số mẫu sau chọn lọc (SeM) Tỉ lệ tái sinh chồi (%) CM8 178 52 29,4 VH1 162 59 36,7 C8H9 148 51 34,5 Kết bảng 4.3 cho thấy khác tỷ lệ tái sinh chồi dòng ngô CM8, VH1, C8H9 Tỷ lệ tái sinh chồi dao động khoảng 29%-35% cụ thể dòng CM8 29,4%, dòng VH1 cho tỷ lệ cao 36,7%, dòng C8H9 34,5% Căn vào kết thí nghiệm ta thấy dòng C8H9 cho tỷ lệ tạo mô sẹo thấp dòng CM8 tỷ lệ tái sinh chồi lại cao hẳn Do thấy tỷ lệ tái sinh chồi tỷ lệ tạo callus mẫu phần phụ thuộc vào nguồn gốc dòng nguồn gốc dòng ngô, phụ thuộc vào khả tái sinh chúng Kết phù hợp với nghiên cứu Phạm Thị Lý Thu cs (2005) 32 [13], tỷ lệ tái sinh dòng ngô khoảng 29-37% Dựa vào kết cho thấy tiến hành chọn lọc tái sinh chồi theo quy trình với thành phần môi trường kháng sinh chọn lọc thích hợp để đạt tỷ lệ tái sinh cao, sở cho nghiên cứu biến nạp gen a b c Hình 4.3 Hình ảnh tái sinh chồi dòng ngô Ghi chú: a- dòng CM8 b- dòng VH1 c- dòng C8H9 4.2 Kết kiểm tra có mặt gen ZmNAC dòng ngô chuyển gen 4.2.1 Kết tách chiết DNA tổng số dòng ngô chuyển gen Chúng tiến hành thu mẫu dòng ngô chuyển gen để tách chiết DNA tổng số theo phương pháp CTAB Saghai Maroof (1984) cải tiến để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm Thu toàn mẫu đất sau biến nạp gồm 26 với dòng khác nhau, CM8 có kí hiệu theo thứ tự: CM8.NA.1- CM8.NA.5, dòng VH1 có 12 cây: VH1.NA.1- VH1.NA.12, dòng C8H9 có cây: C8H9.NA.1- C8H9.NA.9 Mẫu DNA sau tách chiết kiểm tra chất lượng phương pháp điện di agarose 1% (Hình 4.4) 33 18 19 20 21 22 10 11 23 24 12 13 14 15 16 17 25 26 Hình 4.4 Kết điện di DNA tổng số dòng ngô chuyển gen Ghi chú: giếng 1-5 tương ứng với CM8.NA.1, CM8.NA.2, CM8.NA.3, CM8.NA.4, CM8.NA.5;giếng 6-17 tương ứng với VH1.NA.1, VH1.NA 2, VH1.NA 3, VH1.NA 4, VH1.NA 5, VH1.NA 6, VH1.NA 7, VH1.NA 8, VH1.NA 9, VH1.NA.10, VH1.NA.11, VH1.NA.12;giếng 18-26 C8H9.NA.1, C8H9.NA.2, C8H9.NA.3, C8H9.NA.4, C8H9.NA.5, C8H9.NA.6, C8H9.NA.7, C8H9.NA.8, C8H9.NA.9 Qua phân tích hình ảnh điện di cho thấy đường chạy xuất băng DNA rõ nét nằm gần vị trí giếng điện di, chứng tỏ băng DNA tổng số mẫu nghiên cứu Kết điện di cho thấy không xuất băng RNA tổng số phía cuối đường chạy chứng tỏ RNA tổng số bị 34 phân hủy hoàn toàn enzyme RNaes trình tách chiết Kết cho phép khẳng định DNA tổng số 26 mẫu hoàn toàn tinh sạch, không đứt gãy đủ điều kiện thực nghiên cứu sinh học phân tử Ngoài ra, DNA tổng số 26 mẫu phân tích xác định nồng độ phương pháp định lượng phương pháp đo quang phổ nanodrop, nồng độ DNA tổng số 26 mẫu thể bảng 4.4 Bảng 4.4 Kết tách chiết DNA tổng số dòng ngô chuyển gen đo quang phổ nanodrop STT Dòng ngô chuyển gen Tỷ số OD260/280 Hàm lượng DNA tổng số (ng/µl) CM8.NA.1 1,84 835,4 CM8.NA.2 1,87 1021,7 CM8.NA.3 1,82 904,4 CM8.NA.4 1,85 945,7 CM8.NA.5 1,84 1076,2 VH1.NA.1 1,93 932,4 VH1.NA.2 1,92 1034,5 VH1.NA.3 1,89 1215,2 VH1.NA.4 1,88 877,3 10 VH1.NA.5 1,88 1278,6 11 VH1.NA.6 1,89 1233,2 12 VH1.NA.7 1,91 1143,9 13 VH1.NA.8 1,86 1132,5 14 VH1.NA.9 1,89 1322,6 15 VH1.NA.10 1,90 1435,8 16 VH1.NA.11 1,88 1221,4 17 VH1.NA.12 1,89 1327,4 18 C8H9.NA.1 1,81 1012,8 19 C8H9.NA.2 1,88 1439,1 20 C8H9.NA.3 1,89 1229,7 35 21 C8H9.NA.4 1,85 1376,5 22 C8H9.NA.5 1,85 1244,4 23 C8H9.NA.6 1,87 1188,3 24 C8H9.NA.7 1,88 1205,5 25 C8H9.NA.8 1,82 1198,9 26 C8H9.NA.9 1,81 1466,1 Qua kết bảng 4.2 cho thấy DNA tổng số có tỷ số OD260/280 nằm khoảng 1,8-2,0 cho thấy DNA tổng số tương đối không bị lẫn tạp Dựa giá trị OD cho thấy hàm lượng DNA thu cao Sản phẩm DNA tổng số dòng ngô chuyển gen sử dụng để tiến hành phân tích 4.2.2 Kết kiểm tra có mặt gen bar dòng ngô chuyển gen DNA tổng số sau tách chiết tiến hành kiểm tra diện gen bar Kết PCR kiểm tra gel agarose 1% Kết điện di thể hình 4.5 M 500bp 408bp Hình 4.5 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi bar dòng ngô chuyển gen Ghi M: thang chuẩn DNA 1kb (fermentas), giếng từ đến là: đối chứng dương (plasmid), CM8.NA.1, CM8.NA.2, VH1.NA.1, VH1.NA.2, VH1.NA.3, VH1.NA.4, C8H9.NA.2, C8H9.NA.3 Hình ảnh điện di cho thấy đường chạy số 3, 6, 7, 8, có xuất băng DNA với kích thước 408bp tương ứng với kích thước plasmid điều chứng tỏ 36 mẫu CM8.NA.2, VH1.NA.3, VH1.NA.4, C8H9.NA.2, C8H9.NA.3 có mang gen bar Các đường chạy lại 2, 4, không xuất băng DNA chứng tỏ dòng CM8.NA.1, VH1.NA.1, VH1.NA.2 không mang gen gen bar Kết sở để tiến hành thí nghiệm phân tích 4.2.3 Kết kiểm tra có mặt gen ZmNAC dòng ngô chuyển gen Sau thu được DNA tổng số, tiến hành kiểm tra có mặt gen ZmNAC dòng ngô phương pháp PCR Kết PCR kiểm tra gel agarose 1% Bảng 4.5 Kết kiểm tra có mặt gen ZmNAC dòng ngô chuyển gen STT Dòng ngô chuyển gen Sự có mặt gen ZmNAC CM8.NA.1 - CM8.NA.2 - CM8.NA.3 - CM8.NA.4 - CM8.NA.5 - VH1.NA.1 - VH1.NA.2 - VH1.NA.3 - VH1.NA.4 + 10 VH1.NA.5 - 11 VH1.NA.6 - 12 VH1.NA.7 - 13 VH1.NA.8 - 14 VH1.NA.9 - 15 VH1.NA.10 - 16 VH1.NA.11 - 17 VH1.NA.12 - 18 C8H9.NA.1 - 19 C8H9.NA.2 - 37 20 C8H9.NA.3 + 21 C8H9.NA.4 - 22 C8H9.NA.5 - 23 C8H9.NA.6 - 24 C8H9.NA.7 - 25 C8H9.NA.8 - 26 C8H9.NA.9 - Ghi chú: + có mặt gen ZmNAC; - mặt gen ZmNAC M 10 500bp 11 840bp Hình 4.6 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại gen ZmNAC dòng ngô chuyển gen Ghi chú: M: thang chuẩn DNA 1kb (fermentas); 1: đối chứng dương (plasmid; 11: đối chứng âm 2: VH1.NA.1, 3: VH1.NA.2, 4: C8H9.NA.2, 5: C8H9.NA.3, 6: VH1.NA.4, 7: C8H9.NA.3, 8: CM8.NA.1, 9: CM8.NA.2, 10: CM8.NA.3 Kết điện di hình 4.6 cho thấy có giếng số giếng số hiển thị băng rõ nét có kích thước 840bp tương ứng với kích thước sản phẩm PCR DNA plasmid mang gen ZmNAC Điều cho thấy dòng ngô VH1.NA.4 C8H9.NA.3 có mang gen ZmNAC Các giếng lại băng DNA nghĩa gene chưa chuyển vào chuyển vào không ổn định bị đào thải qua chế tự sửa sai Đây sở để tiến hành thí nghiệm để khẳng định biểu gen chuyển dòng ngô 38 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Qua kết tiến hành nghiên cứu biến nạp gen ZmNAC vào dòng ngô CM8, VH1, C8H9 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens xin đưa số kết luận sau: - Quy trình biến nạp Phạm Thị Lý Thu cs (2005) [13] phù hợp với dòng ngô CM8 cho hiệu sống sót cao sau nuôi cấy phục hồi môi trường REM cho hiệu tạo mô sẹo cao môi trường ECM Đối với dòng VH1 cho tỷ lệ tái sinh chồi cao môi trường SeM - Phân tích sản phẩm PCR dòng VH1.NA.4 C8H9.NA.3 cho kết dương tính với gen ZmNAC 5.2 Kiến nghị - Tiếp tục thử nghiệm đánh giá với nhân tố ảnh hưởng hiệu biến nạp cao - Tiếp tục nghiên cứu giống ngô khác dựa vào kết đạt dòng CM8, VH1, C8H9 - Tiến hành nghiên cứu chuyển gen quan tâm khác vào dòng ngô để tạo dòng ngô có đặc tính quý cho suất cao 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Báo cáo khoa học Hội nghị khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc, Quyển 2: Công nghệ sinh học Vi sinh, Công nghệ sinh học Thực vật, NXB Khoa học tự nhiên Công nghệ, 2013 Lê Trần Bình, 2008 Phát triển trồng chuyển gen Việt Nam Nhà Xuất Bản Khoa học Công nghệ Nguyễn Tiến Dũng (2010), “Nghiên cứu biến nạp gen vào đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”, Luận văn Thạc sĩ công nghệ sinh học, Thái Nguyên Lê Tấn Đức, Phạm Đức Trí, Nguyễn Hữu Hổ, Hà Trần Minh Dũng, Dương Thị Ngọc Thi, Nghiên cứu chuyển gen kháng sâu cryIAb vào cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.) phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 205-211 Lê Thị Thu Hiền, (2003), Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang gen kháng côn trùng để chuyển vào trồng, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Trương Thu Hằng, Chọn tạo dòng ngô chuyển gen kháng sâu (CryIAc) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 29, Số (2013) 17-29 Lê Thị Ánh Hồng (2000), Cơ sở khoa học công nghệ chuyển gen thực vật, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Đức Lương, Dương Văn Sơn, Lương Văn Hinh (2000), Giáo trình ngô, NXB Nông ngiệp, tr:14-32 Phạm Thị Thanh Nhàn (2007), Nghiên cứu đặc tính chịu hạn môi trường nuôi cấy in vitro số giống ngô địa phương miền núi, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên 10 Ngô Hữu Tình, Trần Hồng Uy, Bùi Mạnh Cường, Lê Quý Kha, Nguyễn Thế Hùng, (1997), “Cây ngô - nguồn gốc đa dạng di truyền trình phát triển”, tr 43 - 56 40 11 Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Nguyễn Văn Tường, Phạm Thanh Tùng, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Mậu (2013) Tách dòng gen ZmNAC1 từ mẫu ngô địa phương Vị Xuyên – Hà Giang, Việt Nam, Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 107(07): 63 – 68 12 Nguyễn Đức Thành (2003), Chuyển gen thực vật, NXB KHKT, Hà Nội 13 Phạm Thị Lý Thu, Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh (2005), “Ảnh hưởng số yếu tố đến hiệu chuyển gen ngô thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí Nông nghiệp Phát triển Nông thôn, Số 12, tr 517 520 14 Tổng cục thống kê (2011), Niên giám thống kê 2010, Nxb Thống kê, Hà Nội Tài liệu Tiếng Anh 15 Clough SJ, Bent AF (1998) Floral dip: a simplified method for Agrobacterium mediated transformation of Arabidopsis thaliana Plant J 16:735–743 16 Deacon J., Robertson A and Isbister A., 2005 The Microbial World: Biology and Control of Crown Gall (Agrobacterium tumefaciens) Institute of Cell and Molecular Biology, The University of Edinburgh 17 FAOSTAT (2012) Agricultural data, available from: http://faostat.fao.org/ 18 Fromm, M., Taylor, L.P., and Walbot, V (1985), “Expression of gene transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation” Proc.Natl.Acad Sci.USA 82: 5824-5828 19 Galinat W.C., (1995), “ The origin of maize”, Econ Bot (44), pp 3-12 20 Gelvin S.B., 2003 Agrobacterium and plant genes involved in T-DNA transfer and integration Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Bology 51: 223-256 21 Gustavo A., Cabrera J., (1998), “The Agrobacterium tumefaciens: a natural tool for plant transformation”, Plant Cell Report (26), pp 1-11 22 Hansen G and Chilton M.D., 1999 Lessons in gen transfer to plants by a gifted microbe Current Topics Microbiology Immunology 240: 21-57 23 Hao YJ, Song QX, Chen HW, Zou HF, Wei W, Kang XS, Ma B, Zhang WK, 41 Zhang JS, Chen SY (2010) Plant NAC-type transcription factor proteins contain a NARD domain for repression of transcriptional activation Planta.,232(5):1033-1043 24 Hooykass P.J.J., Schilperoort, R.A (1992), “Agrobacterium and plant genetic engineering”, Plant Molecular Biology (35), pp 205-218 25 Ishiada Y, Saito H, Ohta S, Hiei Y, Komari T, Ku-mashiro T (1996) High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens Nature Biotechnology 14: 745-750 26 James C., (2013), “Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2012”, ISAAA Brief 44: Executive Summary 27 Liu ZJ, Shao FX, Tang GY, Shan L, Bi YP (2009) Cloning and characterization of a transcription factor ZmNAC1 in maize (Zea mays)] Yi Chuan., 31(2):199-205 28 Lu M, Ying S, Zhang DF, Shi YS, Song YC, Wang TY, Li Y (2012) A maize stress-responsive NAC transcription factor, ZmSNAC1, confers enhanced tolerance to dehydration in transgenic Arabidopsis Plant Cell Rep.31(9):1701-1711 29 M Duval, T.F Hsieh, S.Y Kim, T.L Thomas, Molecular characterization of AtNAM: a member of the Arabidopsis NAC domain superfamily, Plant Mol Biol 50 (2002) 237–248 30 McCabe, D.E., Swain, W.F., Martinell, B.J., and Christou, P (1988), “Stable transformation of soybean (Glycine max Merrill) by particle acceleration” Bio/Technol 6: 923-926 31 Min Lu, Sheng Ying, Deng-Feng Zhang, Yun-Su Shi, Yan-Chun Song, TianYu Wang, Yu L A maize stress-responsive NAC transcription factor, ZmSNAC1, confers enhanced tolerance to dehydration in transgenic Arabidopsis Plant Cell Rep (2012) 31:1701–1711 32 Murashige T, Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture Physiol Plant 15:473–497 33 Nakashima K, Takasaki H, Mizoi J, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K (2012) NAC transcription factors in plant abiotic stress responses Biochim Biophys Acta., 1819(2):97-103 42 34 Q Xie, A.P Sanz-Burgos, H Guo, J.A García, C Gutiérrez, GRAB proteins, novel members of the NAC domain family, isolated by their interaction with a geminivirus protein, Plant Mol Biol 39 (1999) 647–656 35 Saghai Maroof M,A,,et al (1984), “Ribosomal DNA spacer leght polymorphism in barley, Mendelian inheritance, chromosomal location DNA population dynamics”, proc Natl Acad, Sic, USA 81 36 Zhu J., Oger P.M., Schrammeijer B., Hooykaas P.J.J, Farrand S.K and Winans S C., 2000 The Bases of Crown Gall Tumorigensis Journal of Bacteriology 182: 3885- 3895 43 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Bảng môi trường nuôi cấy ngô Thành phần IM CCM ReM EcM SeM RM N6 salts + + + + + - MS salts - - - - - + Sucrose 68,5 g 30 g 30 g 30 g 30 g 60 g Glucose 36 g L-proline 0,7 g 0,7 g 0,7 g 0,7 g 0,7 g MES 0,5 g 0,5 g 0,5 g 0,5 g 0,5 g 2,4-D, 1mg/ml 1,5 ml 1,5 ml 1,5 ml 1,5 ml 1,5 ml 5,2 5,8 5,8 5,8 5,8 5,5-6 5,5-6 5,5-6 5,5-6 pH w/KOH Gellan-gum (g/l) Agar (g/l) N6 vitamin, 1000 X 8-9 ml ml ml ml ml MS vitamin, 1000 X ml Silver nitrate, 8.5 mg/ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml Glycine, mg/ml ml L-cysteine 0,4 g DTT Acetosyringone, 100 mM Cefotaxime (dissolve freshly) PPT (Phosphinothricin) 5,6 0,154 g ml ml 250 mg 250 mg 250 mg mg/l mg/l 250 mg 44 Phụ lục 2: Bảng môi trường nuôi khuẩn YEB (pH=7) Thành phần Khối lượng (500ml) Bacto-peptone 5g Yeast-extract 2,5g NaCl 2,5g Agar 6g [...]... ngô bằng phương pháp PCR 3.3 Phương pháp nghiên cứu Nội dung 1: Nghiên cứu biến nạp gen ZmNAC vào một số dòng ngô thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Phương pháp nghiên cứu dựa trên phương pháp biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (theo quy trình biến nạp của Phạm Thị Lý Thu và cs) [13] 23 Khử trùng bề mặt bắp ngô Vi khuẩn A tumefaciens Tách phôi non Nuôi lỏng tạo huyền... – Vi n Di truyền Nông nghiệp 3.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu Địa điểm: Phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia Công nghệ tế bào thực vật – Vi n Di Truyền Nông Nghiệp Thời gian: 23/12/2013 đến 17/5/2014 3.2 Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Nghiên cứu biến nạp gen ZmNAC vào một số dòng ngô thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Nội dung 2: Kiểm tra sự có mặt của gen ZmNAC trong một số dòng ngô. .. pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A .tumefaciens vào các đối tượng cây trồng như ngô, đậu tương cà chua…Trương Thu Hằng (2013) đã sử dụng phương pháp chuyển gen thông qua A .tumefaciens để chọn lọc các dòng ngô chuyển gen kháng sâu và đã chuyển gen thành công gen CryIAc vào dòng ngô HR9 nhập nội [6] Lê Tấn Đức và cs (2012) cũng đã sử dụng phương pháp này để biến nạp gen kháng sâu CryIAb vào cây cà chua... nay vi c chuyển gen nhờ virus rất ít được sử dụng Do về nguyên tắc virus không truyền qua hạt cho nên vi c nhân giống cây chuyển gen nhờ virut phải được tiến hành bằng phương pháp vô tính Điều này không phải được thực hiện ở tất cả các loài cây Vì vậy đây chính là nhược điểm lớn của phương pháp chuyển gen nhờ virus [7] 2.4.2.2 Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens. .. chủ và chuyển T- ADN vào tế bào thực vật [12], [24] Quá trình này được sự trợ giúp đặc biệt của các gen vir và RB, LB Cũng chính các hợp chất này, với vai trò cảm ứng, giúp cho các gen vùng vir hoạt động và tăng cường biểu hiện [21] Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens sống phổ biến ở xung quanh và trên bề mặt rễ cây Vùng mà vi khuẩn sống gọi là vùng rễ, nơi mà vi khuẩn tồn tại nhờ vi c sử dụng chất dinh... tái sinh chồi của 3 dòng CM8, VH1, C8H9 3.4.2 Các chỉ tiêu theo dõi và đánh giá Các thông số sau được quan tâm để đánh giá hiệu quả của quá trình nuôi cấy và biến nạp gen: Số mẫu sau nuôi cấy phục hồi Tỷ lệ tạo mẫu sống sau nuôi phục hồi = x100(%) Tổng số phôi biến nạp Số mô sẹo chuyển gen tạo thành Tỷ lệ tạo mô sẹo chuyển gen = x 100 (%) Tổng số phôi sau nuôi phục hồi Số cây chuyển gen tái sinh Tỷ lệ... phun râu, các gen quy định tính chịu hạn…[9] 21 PHẦN 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng (vật liệu) và phạm vi nghiên cứu 3.1.1 Đối tượng (vật liệu) nghiên cứu - Một số dòng ngô Vi t Nam gồm CM8, CH9, VH1 do Vi n Di truyền Nông Nghiệp cung cấp - Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens được sử dụng là chủng EHA101chứa hệ thống vector pZY10135S và gen chọn lọc PPT do Vi n Di truyền... phôi tách từ 3 bắp Biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens - Lây nhiễm vi khuẩn với phôi Bắp non được thu từ các cây ngô mẹ trồng trong nhà lưới Ngay sau khi thu, phôi non được tách trong điều kiện vô trùng Phôi non sau đó được đưa vào môi trường IM có bổ sung AS và dịch huyền phù vi khuẩn trong 30-60 phút, lắc nhẹ - Đồng nuôi cấy Phôi sau khi lây nhiễm với vi khuẩn được chuyển sang... chuyển DNA vào tế bào cây [22] Khi rễ cây xuất hiện vết thương, tế bào vi khuẩn sẽ di chuyển về phía vết thương và xâm nhập vào cây qua vết thương đó Vi khuẩn độc mang một hoặc nhiều plasmid, một trong số đó có mang gen tạo khối u và được biết đến với tên gọi là pTi Plasmid Ti cũng mang các 11 gen để xác định kí chủ và triệu chứng khi nhiễm vào cây Những vi khuẩn không mang pTi được xem như là vi khuẩn. .. với kích thước của gen ZmNAC, khi đó kết luận dòng đó có thể mang gen chuyển ZmNAC, và ngược lại 3.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm, theo dõi, đánh giá và xử lý kết quả 3.4.1 Nghiên cứu biến nạp gen ZmNAC vào các dòng ngô CM8, VH1, C8H9 - Thí nghiệm 1: Theo dõi và đánh giá khả năng sống sót của phôi non sau giai đoạn nuôi cấy cộng sinh CCM và nuôi cấy phục hồi REM Ngô non thuộc 3 dòng CM8, VH1, C8H9