Nghiên cứu chuyển cấu trúc gen cystatin 2 vào một số giống ngô thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC LÊ ĐỨC HUẤN NGHIÊN CỨU CHUYỂN CẤU TRÚC GEN CYSTATIN2 VÀO MỘT SỐ GIỐNG NGÔ THÔNG QUA VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2015 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC LÊ ĐỨC HUẤN NGHIÊN CỨU CHUYỂN CẤU TRÚC GEN CYSTATIN2 VÀO MỘT SỐ GIỐNG NGÔ THÔNG QUA VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh THÁI NGUYÊN - 2015 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn công trình nghiên cứu hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh, giúp đỡ cán Khoa Khoa học sống - Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên; Khoa Sinh – Đại học Sư Phạm Thái Nguyên; Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Các số liệu, kết luận văn trung thực chưa công bố công trình khác Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm số liệu luận văn Thái Nguyên, ngày 01 tháng 05 năm 2015 Tác giả luận văn LÊ ĐỨC HUẤN Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh, người hướng dẫn, bảo tận tình giúp đỡ suốt trình thực đề tài hoàn chỉnh luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, anh chị em Khoa Khoa học sống - Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi có góp ý sâu sắc cho thời gian học tập thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, anh chị em Khoa Sinh họcĐại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi sở vật chất giúp thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn TS Lê Văn Sơn cán bộ, kỹ thuật viên phòng Công nghệ ADN ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện giúp đỡ tốt để hoàn thành đề tài nghiên cứu Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình, đồng nghiệp bạn bè động viên, khích lệ, chia sẻ khó khăn suốt trình học tập nghiên cứu Thái Nguyên, ngày tháng 05 năm 2015 Tác giả luận văn Lê Đức Huấn Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ii LỜI CẢM ƠN iii MỞ ĐẦU Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY NGÔ (ZEA MAYS L.) 1.2 ĐẶC ĐIỂM MỌT HẠI NGÔ Sitophyllus zeamais 10 1.2.1 Sơ lược mọt hại ngô 10 1.2.2 Đặc điểm hình thái mọt ngô 11 1.3 PROTEINASE VÀ CYSTATIN 13 1.3.1 Proteinase loại proteinase 13 1.3.2 Proteinase inhibitor Cystatin 15 1.4 CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT 18 1.4.1 Phương pháp chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 18 22 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ 25 2.1.1 Vật liệu 25 2.1.2 Hóa chất, thiết bị sử dụng 26 2.1.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu 27 2.2 Phương pháp nghiên cứu 27 2.2.1 29 2.2.2 29 2.2.3 Tạo dịch huyền phù 30 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ v 2.2.4 Nhiễm khuẩn đồng nuôi cấy 30 2.2.5 Diệt khuẩn, nuôi cấy chọn lọc mô sẹo chuyển gen 30 2.2.6 Phương pháp tái sinh từ mô sẹo, tạo rễ cho đất 31 2.2.7 Phương pháp bố trí thí nghiệm thử yếu tố ảnh hưởng tới khả chuyển gen ngô 32 2.2.8 Đánh giá, phân tích kết chuyển gen 34 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 Chuyển vector mang gen Cystatin2 vào giống ngô nghiên cứu 37 3.2 Kết kiểm tra ngô mang gen Cys2 sau chuyển gen 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 Kết luận 47 4.2 Kiến nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC 55 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Anh BAP 6- benzyl amino purine bp Base pair cDNA Complementary DNA CS Cys2 Cystatin2 DNA Deoxyribose nucleic acid dNTP Deoxynucleoside triphosphate EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid Cặp bazơ Cộng IPTG Isopropyl β-D-1thiogalactopyranoside 12 kb kilo base 13 LB Luria Bertani 10 Nghĩa tiếng Việt MS Môi trường nuôi cấy mô theo Murashige Skoog 15 NXB Nhà xuất 16 mRNA messenger ribonucleic acid 17 OD Optical density PCR Polymerase chain reaction 20 RNA Ribonucleic acid 21 TAE Tris – acetate- EDTA 22 Taq Thermus aquaticus 14 19 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN Phản ứng chuỗi trùng hợp http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vii DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN Bảng 1.1 Sản xuất ngô giới giai đoạn 1961 – 2012…………………8 Bảng 1.2 Thống kê diện tích, suất, sản lượng ngô Việt Nam từ năm 2007 - 2013 Bảng 2.1 Đặc điểm giống ngô nghiên cứu 25 Bảng 2.2 Trình tự cặp mồi sử dụng nghiên cứu 26 Bảng 2.3 Thành phần dung dịch đệm tách chiết DNA 34 Bảng 2.4 Thành phần chạy phản ứng PCR nhân gen Cys2 t 35 Bảng 2.5 Chu trình nhiệt phản ứng PCR nhân gen Cys2 35 Bảng 3.1 Ảnh hưởng thời gian gây nhiễm A.tumefaciens đến khả tạo mô sẹo từ phôi non dòng ngô LVN99 LVN885 38 Bảng 3.2 Ảnh hưởng nồng độ chất kháng sinh kanamycin đến khả tạo mô sẹo từ phôi non giống ngô LVN99 LVN885 40 Bảng 3.3 Kết tạo ngô chuyển gen Cys2 42 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ viii DANH MỤC CÁC HÌNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN Hình 2.1 Cây ngô mẹ trồng đồng ruộng 29 Hình 2.2 Phôi ngô tách khỏi hạt 29 Hình 3.1 Ảnh hưởng thời gian gây nhiễm đến khả tạo mô sẹo giống ngô LVN 99 LVN885 38 Hình 3.2 Ảnh hưởng chất kháng sinh kanamycin đến khả tạo mô sẹo giống ngô LVN99 LVN885 41 Hình 3.3 Ảnh hưởng chất kháng sinh kanamycin đến khả tạo mô sẹo từ phôi non giống ngô LVN99 LVN885 41 Hình 3.4 Dòng ngô chuyển gen tái sinh từ phôi non (A) dòng chuyển gen đưa môi trường đất pha cát (B) từ giống ngô LVN9943 Hình 3.5 Ảnh điện di kiểm tra DNA tổng số tách từ ngô 44 Hình 3.6 Hình điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen Cys2 45 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỞ ĐẦU Cây ngô (Zea mays L.) lương thực giàu dinh dưỡng có vai trò cung cấp lương thực cho loài người, - - hàng nông sản xuất có giá trị Cây ngô gieo Theo thống kê FAO, năm 2012 ngô với diện tích 177,38 triệu ha, [57 t Nam, ngô lương thực Ở nước ta nay, ngô trồng coi trọng để phát triển diện tích suất chất lượng Tuy nhiên, điều kiện khí hậu, thời tiết nước ta phức tạp, vấn đề bảo quản ngô sau thu hoạ để đưa vào sản xuất Hiện nay, có nhiều công trình nghiên cứu khả kháng mọt ngô như: nghiên cứu thành phần sâu mọt hại ngô trình bảo quản, đặc điểm sinh thái học loài mọt ngô, đánh giá giống ngô nhiệt đới kháng mọt Sitophilus zeamais [42], [45], nghiên cứu đánh giá cải thiện giống ngô lai với mức độ kháng khác với mọt ngô [49], đánh giá biểu gen Cystatin lúa mạch ngô tăng cường Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 43 Kết bảng 3.3 cho thấy số lượng phôi sống sót hình thành mô sẹo môi trường chọn lọc giảm dần theo thời gian, điều cho thấy khả tồn phát triển phôi mang tế bào chuyển gen Sau - tuần, giống LVN 99 có 68 phôi sống sót giống LVN 885 có 56 phôi sống môi trường chọn lọc sau biến nạp Sau - tuần, giống LVN 99 tạo ngô chuyển gen hoàn chỉnh giống LVN 885 không tạo ngô Giống LVN 885 có mô sẹo tạo thành phát triển thành tỉ lệ chuyển gen giống LVN 885 thí nghiệm 0% Còn tỉ lệ chuyển gen sau chọn lọc kháng sinh giống LVN 99 0,4% Như qua chọn lọc kháng sinh kanamycin khả giống LVN 99 chấp nhận cấu trúc gen Cys2, giống LVN 885 không chấp nhận cấu trúc gen Tuy nhiên để chắn tiếp tục tiến hành kiểm tra phương pháp PCR dòng ngô LVN99 chuyển gen sống sót sau chọn lọc A B Hình 3.4 Dòng ngô chuyển gen đƣợc tái sinh từ phôi non (A) dòng chuyển gen đƣợc đƣa môi trƣờng đất pha cát (B) từ giống ngô LVN99 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 44 Để kiểm tra có mặt gen chuyển ngô chuyển gen, tiến hành tách DNA tổng số từ mẫu dòng ngô chuyển gen Cys2 từ giống ngô LVN99 (hình 3.4) mẫu ngô đối chứng không chuyển gen (3 mẫu thuộc giống LVN 99, mẫu thuộc giống LVN 885) Kết tách DNA tổng số thể hình 3.5 Hình 3.5 Ảnh điện di kiểm tra DNA tổng số tách từ ngô Kết tách DNA tổng số cho thấy tách chiết thành công mẫu DNA, tỷ lệ đứt gãy thấp đảm bảo đủ yêu cầu để sử dụng làm mẫu cho phản ứng PCR Sau tách chiết DNA tổng số, tiếp tục PCR với cặp mồi CYS -F/R để kiểm tra có mặt gen Cystatin2 ngô Vì số gen thường so với mẫu vi khuẩn nên phản ứng PCR phải kéo dài hơn, thí nghiệm cho lặp lại phản ứng 35 chu kỳ Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR thể hình 3.5 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 45 Hình 3.6 Hình điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen Cys2 từ dòng ngô LVN99 chuyển gen, giếng 6,7, giếng marker 100bp, giếng sản phẩm PCR từ plasmid, giếng 3,4,5 8,9,10 mẫu ngô đối chứng Kết thể hình 3.6 cho thấy, sản phẩm PCR điện di có mẫu mẫu đối chứng dương nhân gen từ plasmid dòng ngô LVN99 chuyển gen có sản phẩm PCR, kích thước khoảng 400bp Kích thước hoàn toàn phù hợp với chiều dài gen Cys2 chuyển Như vậy, số ngô mang gen Cys2 2/2 thu sau chọn lọc Vì vậy, khẳng định gen Cys2 chuyển vào ngô Như vậy, qua kiểm tra sơ bước đầu thu dòng ngô chuyển gen mang cấu trúc Cys2 Theo nghiên cứu kết chuyển gen thông qua A tumefaciens đạt 0,4%, với 100% ngô sau chọn lọc có chứa Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 46 gen chuyển So sánh với kết chuyển gen công bố Việt Nam giới, nhận thấy tỉ lệ chuyển gen thành công tương đối cao so với công bố trước Việt Nam, nhiên so với nước tỉ lệ chuyển thành công 0,4% thấp Cụ thể, theo công bố tác giả Đinh Văn Trình cộng sự, chuyển thành công vào ngô gen chịu hạn - ZmDREB2A tỉ lệ đạt 0,023% Trương Thu Hằng cộng công bố chuyển gen kháng sâu CryIAci vào dòng ngô HR9 với tỉ lệ 0,22% Năm 2008, Vega cs công bố tỉ lệ chuyển gen sử dụng vector pCABIA3301 pZY101 vào phôi non dòng ngô Hi-II đạt tới 12% có dòng ngô chuyển đạt tỉ lệ 18% Qua kết thu từ kết chuyển gen ngô trước thông qua A.tumefaciens nhận thấy việc chuyển gen phụ thuộc lớn vào giống ngô chuyển gen Vì theo nghiên cứu nghiên cứu trước, với hệ thống vector chuyển vào giống ngô khác cho tỉ lệ chuyển gen khác với độ chênh lệch tương đối lớn Vì vậy, theo đánh giá để chuyển gen vào ngô cho tỉ lệ thành công cao nên chọn nhiều giống có đặc điểm tốt để dùng làm mẫu chuyển Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Qua kết thử nghiệm chuyển gen Cys2 vào giống ngô LVN99 giống ngô LVN 885 thông qua vi khuẩn A.tumefaciens xin rút số kết luận sau: Thời gian gây nhiễm vi khuẩn A.tumefaciens cho tỉ lệ hình thành mô sẹo cao mà đảm bảo cho vi khuẩn A.tumefaciens lây nhiễm vào phôi khoảng từ 20 - 30 phút giống ngô LVN99 LVN885 Nồng độ kháng sinh kanamycin môi trường thích hợp cho chọn lọc 50 mg/l giống ngô LVN99 LVN885 Đã chuyển gen thành công gen Cystain2 vào giống ngô LVN99 với tỉ lệ 0,4%, theo nghiên cứu tỉ lệ chuyển gen thành công giống ngô LVN99 cao giống LVN885 4.2 Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố khác đến quy trình chuyển gen Cystain2 vào giống ngô LVN99 để hoàn thiện quy trình - Tiếp tục nghiên cứu chuyển gen Cystain2 giống ngô khác dựa vào kết đạt giống LVN99 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Trương Văn Đích (2000), Kỹ thuật trồng ngô suất cao, NXB Nông nghiệp Hà Nội Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển (2007), ―Cấu trúc vector plasmid mang gen kháng sâu ứng dụng tạo trồng chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefacien‖, Hội nghị khoa học công nghệ, tr 345- 350 Phạm Thị Hạnh, Phan Tường Lộc, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ (2007), ―Tạo thuốc kháng thuốc trừ cỏ côn trùng‖, phòng Công nghệ gen thực vật, Viện Sinh học nhiệt đới Hội nghị Khoa học Công nghệ Lê Huy Hàm (2006), ―Sử dụng kỹ thuật biến nạp di truyền cải tạo số đặc tính nông sinh học ngô lúa mỳ‖, Báo cáo Viện di truyền nông nghiệp (CryIAc Agrobacterium tumefaciens‖, , Đại học Quốc gia Hà Nội , 29(3), tr 17-29 Bùi Công Hiển (1995), Côn trùng hại kho, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội Nguyễn Xuân Hiển (1972), Một số kết nghiên cứu ngô, NXB Khoa Học Kỹ Thuật, Hà Nội (2005), (Zea mays L.) suất cao, Tạp chí Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 49 Khoa học Công nghệ - Đại Học Thái Nguyên, trang 69, tập 132, số 02 Nguyễn Đức Lương, Dương Văn Sơn, Lương Văn Hinh (2002), Giáo trình lương thực (dành cho sinh viên cao học), NXB Nông nghiệp 10 Nguyễn Đức Lương, Dương Văn Sơn, Lương Văn Hinh (2000), Giáo trình ngô, NXB Nông nghiệp Tr 14-32 11 Chu Hoàng Mậu (2008), Phương pháp phân tích di truyền đại chọn giống trồng, NXB Đại học Thái Nguyên 12 Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Thúy Hường, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Hà (2011), Gen đặc tính chịu hạn đậu tương, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội 13 TS Ngô Hữu Tình (2009), Giáo trình Cây ngô, NXB Nghệ An 14 Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh (2005), Công nghệ sinh học nông nghiệp, NXB Đại học Sư phạm 15 Phạm Thị Lý Thu (2007), ―Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh từ phôi non xác định phương pháp chuyển gen thích hợp ngô‖, Luận án tiến sĩ sinh học (146 tr) 16 Vũ Thị Thu Thủy (2011), ―Tạo dòng chịu hạn phân lập gen Cystatin liên quan đến tính chịu hạn lạc‖, Luận án tiến sĩ sinh học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên 17 Vì Thị Xuân Thủy, Hồ Mạnh Tường, Lê Văn Sơn, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Mậu (2014), Tách dòng gen Cystatin2 phân lập từ số mẫu ngô địa phương Việt Nam, Tạp chí sinh học, 36(1): 110117 18 , Lê ngô‖, Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN , 7(2), tr 221-227 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 50 19 Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2007), Công nghệ sinh học (tập 2)- Công nghệ sinh học tế bào, NXB Giáo dục p 91- 95 20 Abe K., Emori Y., Kondo H., Susuki K., Aria S (1987), "Molecular cloning of a cystein proteinase inhibitor of rice (Oryzacystatin) Homology with animal cystatin and transient expression in the ripening process of rice seeds", J Biol Chem, 262 (35), 16793-16797 21 Adeniala S O., José X F., Sales M P (2003), "Cysteine proteinases and cystatins", Braz arch biol technol, 46 (1), 99-104 22 Anima S E., Mgutu A J., Taracha C., Coussens G., Karimi M., Hilson P., Lijsebettens M V., Machuka J (2010), ―Somatic embryogenesis and plant regeneration of tropical maize genotypes‖, Plant Cell Tiss Organ Cult , 2, pp 285-295 23 Barrett, A J (1994) "Classification of peptidases", Methods Enzymol 244, pp 1–15 24 Bode W., Engh R., Musil D., Thiele U., Huber R.,Karshnikov A., Brzin J., Kos J & Turk V (1990), " Mechanism of interaction oF cysteine ptoteinases and their protein inhibitors as compared to the serine proteinase inhibitor interaction", Biol Chem Hoppe-Seyler, 371, pp 111118 25 Carrillo L., Martinez M., Ramessar K., Cambra I., Castanera P., Ortego F., I D (2011), "Expression of a barley cystatin gene in maize enhances resistance", Plant Cell Reports, 101-112 26 Chan M T., Lee T M., Chang H H (1992), ―Transformation of indica rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens‖, Plant Cell Physiol, 33, pp 577- 583 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 51 27 Chan M T., Chang H H., Ho S L., Tong W F., Yu S M (1993), ―Agrobacterium-mediated production of transgenic rice plants expressing a chimeric a-amylas promoter / P-glucuronidase gene‖, Plant Mo1 Biol, 22, pp 491-506 28 Cheng M., Fry J E., Pang S., et al (1997), ―Genetic transformation of wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens‖, Plant Physiology, 115(3), pp 971-980 29 David R (2004), Insects stored products CSIRO Australia 30 Frame B R., Shou H., Chikwamba R., Zhang Z., Xiang C., Fonger T M., Pegg S E K., Li B., Nettleton , Pei D & Wang K (2002), ―Agrobacterium tumefaciens -mediated Transformation of Maize Embryos Using a Standard Binary Vector System‖, Plant Physiol, 129, pp 12-22 31 Frame B R., McMurray J M., Fonger T N., Main M L., Taylor K W., Torney F J., Paz M M , Wang K (2006), ―Improved Agrobacterium-mediated transformation of three maize inbred lines using MS salts‖, Plant Cell Rep, 25(10), pp 1024-1034 32 Hiei Y., Ohta S., Komari T., Kumashiro T (1994), ―Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA‖, Plant J, 6(2), pp 271-82 33 Ishida Y., Saito H., Ohta S., Hiei Y., Komari T., and Kumashiro T (1996), ―High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens‖, Nature Biotechnology, 14(6), pp 745–750 34 Ishida Y., Hiei Y., Komari T (2007), ―Agrobacteium-mediated transformation of maize‖, Nature Protocol, 12(7), pp 1614-1621 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 52 35 James A O., Adebayo A O (2012), "Rearing the Maize Weevil, Sitophilus zeamais, on an Artificial Maize—Cassava Diet", J Insect Sci, 12 36 Kim H A., Utomo S D., Kwon S Y., Min S R., Kim J S., Yoo H S and Choi P S (2009), ―The development of herbicide-resistant maize: stable Agrobacterium-mediated ransformation of maize using explants of type II embryogenic calli‖, Plant Biotechnol Rep, 3(4), pp 277-283 37 Kuschel G (1961), "On problem of synonymy in the Sitophyllus oryzae complex (30th contribution, Col Curculionidea)", Annals and Magazine of Nature History, 13(4), pp 241-244 38 Li N., Zhang S., Zhao Y., Li B., Zhang J (2011), ―Over-expression of AGPase genes enhances seed weight and starch content in transgenic maize‖, Planta, 233, pp 241-250 39 Massonneau A., Condamine P., Wisniewski J P., Zivy M., Rogowsky P M (2005), "Maize cystatins respond to developmental cues, cold stress and drought", Biochim Biophys Acta, 1729(3), PP 99-186 40 Mikami A Y., Carpentieri P V., Ventura M U (2012), "Resistance of maize landraces to the maize weevil Sitophilus zeamais Motsch.(Coleoptera: Curculionidae)." Neotrop Entomol, 41 (5), 404-8 41 Mwololo J K., Mugo S., Okori P., T Tefera, Otim M., S W M (2012), "Sources of Resistance to the Maize Weevil Sitophilus zeamais in Tropical Maize", Journal of Agricultural Science, (11) 42 Ombori O., Muoma J V O., Machuka J (2012), ―Agrobacteriummediated genetic transformation of selected tropical inbred and hybrid maize (Zea mays L.) lines‖, Plant Cell Tiss Org, DOI 10.1007/s11240012-0247-1 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 53 43 Paz, Margie Margarita M.(Ames, IA, US) Wang, Kan (Ames, IA, US) (2009) ―Soybean transformation and regeneration using half-seed explants‖ Theoretical and Applied Genetics, vol, 107 Pp 439-447 44 Rawlings, N D & Barrett, A J (1999) "MEROPS:The peptidase database", Nucleic Acids Res, 27, pp 325–331 45 Sambrook J., Russell D W., eds (2001), ―Molecular Cloning: laboratory Manual, 1st ed Cold Spring Harbor laboratory Press‖, Cold Spring Harbor, NY 46 Shu-Guo FAN, WU G J (2005), "Characteristics of plant proteinase inhibitors and their applications in combating phytophagous insects", Bot Bull Acad Sin, 46, 273-92 47 Sidorov V., Gilbertson L., Addae P., Duncan D (2006), ―Agrobacterium-mediated transformation of seedling-derived maize callus‖, Plant Cell Rep, 25, pp 320-328 48 Takava S., Rahnama H., Rahimian H., and Kazemitabar K (2010), ―Agrobacterium Mediated Transformation of Maize (Zea mays L.)‖, Journal of Sciences, Islamic Republic of Iran, 21(1), pp 21-29 49 Tefera T., Demissie G., Mugo S., Y B (2013), "Yield and agronomic performance of maize hybrids resistant to the maize weevil Sitophilus zeamais Motschulsky (Coleoptera: Curculionidae)", pp 91-99 50 Turk B., Turk V., Turk D (1997), "Structural and functional aspects of papain-like cysteine proteinase and their protein inhibitor", Biol Chem Hopp seyler , 378, pp 141-150 51 Vega J M., Yu W., Kennon A R., Chen X., Zhang Z J (2008), ―Improvement of Agrobacterium-mediated transformation in Hi-II maize (Zea mays L.) using standard binary vectors‖, Plant Cell Rep, 27, pp 297305 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 54 52 Wang Z., Chen X., Wang J., Liu T., Liu Y., Zhao L., Wang G (2007), ―Inreasing maize seed weight by enhancing the cytoplasmic DPglucose pyrophosphorylase activity in transgenic maize plants‖, Plant Cell Tiss Organ, 88, pp 83-92 53 Wang T T., Ji J., Wang G., Guan C F., Zhang L., Jin C (2012), ―Study on Agrobacterium-mediated transformation of psy gene into shoot meristem of maize‖, China Biol, 32(8), pp 36-40 54 http://www.ctu.edu.vn 55 http://faostat.fao.org/ 56 http://www.gso.gov.vn 57 http: //www.ncbi.nlm.nih.gov./sites/nuccore/AF45439 58 http: //www.ncbi.nlm.nih.gov./sites/nuccore/D63342 59 http: //www.ncbi.nlm.nih.gov./sites/nuccore/D64115 60 http://old.padil.gov.au/pbt/index.php?q=node/70&pbtID=217 61 http://www.vietrade.gov.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 55 PHỤ LỤC Cấu trúc vector sử dụng nghiên cứu Sơ đồ cấu trúc vector sử dụng nghiên cứu A Vector tách dòng pBT; B Vector tách dòng pENTRTM/D-TOPO®; C Vector chuyển gen pPhaso-dest Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 56 Thành phần môi trƣờng sử dụng nghiên cứu Bảng Thành phần môi trƣờng MS, N6 THÀNH PHẦN Murashige & Chu’s N6 Skoog (g/l) (g/l) Ammonium Nitrate 1,650000 Ammonium Sulfate 0,463000 Calcium Chloride Anhydrous 0,332020 0,125330 Magnesium sulfate Anhydrous 0,180700 0,090370 Potassium Nitrate 1,900000 2,830000 Boric Acid 0,006200 0,001600 Potassium Phosphate monobasic 0,170000 0,400000 Cobalt Chloride Anhydrous 0,000025 Cupric Sulfate Anhydrous 0,000025 Ferrous Sulftate - H2O 0,027800 0,027850 Manganese Sulfate - H2O 0,016900 0,003330 Molybdic Acid Sodium Salf - 2H2O 0,000250 Na2-EDTA-2H2O 0,037260 0,037250 Potassium Iodide 0,000830 0,000800 Zinc Sulfate-7H2O 0,008600 0,001500 4,331 g/l 3,981 g/l Glycerine 0,002000 0,002000 Myo-Inositol 0,100000 Nicotinic Acid 0,000500 0,000500 Pyridoxine-HCl 0,000500 0,000500 Thiamine-HCl 0,000100 0,001000 0,1031 g/l 0,004 g/l Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 57 Bảng Thành phần môi trƣờng LB Thành phần Hàm lƣợng Agar 20g Pepton 10g Cao nấm men 5g NaCl 10g Nước cất vừa đủ 1000 ml pH Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ [...].. .2 sức đề kháng [25 ] Các nghiên cứu đều chỉ ra rằng đặc tính kháng mọt của cây ngô do nhiều gen quyết định, trong đó có gen Cystatin [19] Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn của vi c chọn tạo giống ngô theo hướng nâng cao khả năng kháng mọt, chúng tôi đã tiến hành đề tài "Nghiên cứu chuyển cấu trúc gen Cystatin2 vào một số giống ngô thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 2 Mục tiêu nghiên cứu Chuyển. .. Chuyển cấu trúc gen Cystatin2 liên quan đến khả năng kháng mọt vào giống ngô LVN99 và LVN885 3 Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian gây nhiễm A .tumefaciens đến khả năng tạo mô sẹo từ phôi non của hai giống ngô LVN99 và LVN885 - Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh đến khả năng tạo mô sẹo từ phôi non của hai giống ngô LVN99 và LVN885 - Chuyển cấu trúc gen Cystatin2 vào giống ngô. .. http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 22 Đối với cây ngô, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu chuyển gen thông qua A .tumefaciens vào mô sẹo dạng I từ đoạn cây con, phôi non [30], [31], [34], [51], [ 52] và phôi từ mô sẹo [ 42] Phôi ngô được sử dụng nhiều và cho hiệu quả chuyển nạp gen khá cao Nghiên cứu chuyển gen thành công vào phôi non các dòng ngô A634, H99, W117 sử dụng vi khuẩn A tumefaciens với tỷ lệ... thuật chuyển gen được ưa chuộng nhất vì có nhiều ưu điểm so với chuyển gen bằng phương pháp bắn gen, như cho nhiều sự kiện chuyển gen ổn định, ít bản sao, thể hiện đúng, tăng tần số đồng biểu hiện và ít có sự tái sắp xếp gen chuyển nạp Đến nay, các quy trình chuyển gen hiệu quả đã được xây dựng cho các cây một lá mầm như lúa, lúa mì [26 ], [28 ], [ 32] Chuyển gen vào phôi non ngô dòng A188 thông qua vi khuẩn. .. phương pháp chuyển gen đơn giản Năm 20 09, Kim và cs đã sử dụng phương pháp chuyển gen thông qua A .tumefaciens vào phôi non để tạo cây ngô chuyển gen kháng chất điệt cỏ [36] Takava và cs (20 10) đã chuyển vector pCABIA3301 vào 4 dòng ngô thuần S61, B73, Mo17, A188 và 2 dòng ngô lai HiIIB và HiIIC thông qua vi khuẩn A .tumefaciens LBA4404 Các tác giả đã lấy phôi có kích thước trung bình từ 1,5 đến 2 mm đồng... được 18% [51] Li và cs (20 10) đã nghiên cứu chuyển gen Bt2 và Sh2 vào mô phân sinh cây ngô non của dòng ngô DH4866 sử dụng vi khuẩn A .tumefaciens đã đem lại hiệu quả khá cao, khoảng 10% các cây non xử lý được chuyển gen [38] Năm 20 12, Wang và cs đã sử dụng mô phân sinh chồi của hai dòng ngô cận giao Tian Tawu và 7 922 để chuyển gen mã hóa phytoene synthase (psy) thông qua A.tumefsciens [53] Phương pháp... So với gen Cystatin phân lập từ DNA hệ gen, gen Cystatin phân lập từ mRNA chiếm số lượng lớn hơn Kết quả nghiên cứu ở ngô cho thấy, có 10 gen Cystatin của ngô, các gen ký hiệu là CC gồm có CC1, CC2, CC3, CC4, CC5, CC6, CC7, CC8, CC9, và CC10 [39] Trong 10 gen Cystatin ở ngô, có 9 gen được phân lập từ mRNA, chỉ có gen CC1 phân lập từ DNA Kích thước gen CC1 chứa 20 24bp, trong đó có 3 exon và 2 intron,... Anima và cs cũng chuyển hai vector pXBb7-SI-UBIL và pBbm42GW7_GUS vào phôi non của 3 dòng ngô TL26, CML216 và CML244 với môi trường đồng nuôi cấy có nồng độ cao hơn các nghiên cứu khác (20 0 µM acetosyringone) và cũng tạo ra được cây chuyển và và đời con lai của các dòng chuyển gen trên [22 ] Ở Vi t Nam hiện nay đã sử dụng rộng rãi phương pháp biến nạp gen vào vi khuẩn A .tumefaciens để chuyển vào cây trồng... rất nhiều và đem lại các thành tựu đáng kể như: đã chuyển được gen cryIA kháng sâu xanh Heliothis armigera vào cây hông và cây cải ngọt thông qua vi khuẩn A .tumefaciens EHA 105 đã chuyển được gen kháng thuốc diệt cỏ và kháng côn trùng chích hút vào cây thuốc lá nhờ vi khuẩn A .tumefaciens LBA 4404 [2] , [3] Các nghiên cứu về chuyển gen ngô nhờ vi khuẩn A .tumefaciens đã được thực hiện chủ yếu với mục đích... 99 và LVN 885 có do Vi n Nghiên cứu ngô cung cấp[8] Bảng 2. 1 Đặc điểm 2 giống ngô nghiên cứu Năng suất Tính chống chịu LVN 99 LVN 885 95 - 120 ngày 95 - 110 ngày 9 - 12 (tấn/ha) 8 - 10 (tấn/ha) Chịu hạn khá, chống đổ tốt, ít nhiễm bệnh, độ đồng đều cao Chịu hạn tốt, kháng bệnh, thích ứng rộng 2. 1.1 .2 Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và vector chuyển gen Chủng vi khuẩn A .tumefaciens mang plasmid ... "Nghiên cứu chuyển cấu trúc gen Cystatin2 vào số giống ngô thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Mục tiêu nghiên cứu Chuyển cấu trúc gen Cystatin2 liên quan đến khả kháng mọt vào giống ngô. .. KHOA HỌC LÊ ĐỨC HUẤN NGHIÊN CỨU CHUYỂN CẤU TRÚC GEN CYSTATIN2 VÀO MỘT SỐ GIỐNG NGÔ THÔNG QUA VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60. 42. 02. 01 LUẬN VĂN THẠC... 25 2. 1.1 Vật liệu 25 2. 1 .2 Hóa chất, thiết bị sử dụng 26 2. 1.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu 27 2. 2 Phương pháp nghiên cứu 27 2. 2.1 29 2. 2 .2