3. Nội dung nghiên cứu
2.2.7. Phương pháp bố trí thí nghiệm thử các yếu tố ảnh hưởng tới khả
năng chuyển gen của ngô
Nghiên cứu chuyển gen Cystatin2 liên quan đến khả năng kháng mọt
vào 2 giống ngô thông qua vi khuẩn A.tumefaciens.
- Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của thời gian gây nhiễm A.tumefaciens đến việc tạo mô sẹo từ phôi non.
Phôi ngô sau khi được tách khỏi hạt, gây tổn thương được ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn A.tumefaciens để biến nạp với các mốc thời gian khác nhau. Sau đó nuôi cấy trên môi trường đồng nuôi cấy H1 nuôi tối 3 ngày và chuyển sang môi trường H2 không có kháng sinh, tiếp tục cấy chuyển 1 tuần/1 lần với môi trường H2 không có kháng sinh. Thí nghiệm được tiến hành theo các công thức:
CT1: Ngâm phôi của 2 giống ngô trong dịch huyền phù trong 5 phút CT2: Ngâm phôi của 2 giống ngô trong dịch huyền phù trong 10 phút CT3: Ngâm phôi của 2 giống ngô trong dịch huyền phù trong 20 phút CT4: Ngâm phôi của 2 giống ngô trong dịch huyền phù trong 30 phút
CT5: Ngâm phôi của 2 giống ngô trong dịch huyền phù trong 40 phút + Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn
toàn, 5 công thức, thực hiện 3 lần nhắc lại, mỗi công thức theo dõi 3 đĩa, mỗi đĩa 10 phôi.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
+ Chỉ tiêu theo dõi: số phôi sống sót và hình thành mô sẹo sau biến nạp
- Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của chất kháng sinh kanamycin đến khả năng tạo mô sẹo từ phôi non.
Các phôi có chứa gen Cystatin2 sau quá trình chuyển gen có khả năng kháng với chất chọn lọc kháng sinh kanamycin, vì vậy khi bổ sung kanamycin thích hợp vào môi trường thì sẽ chọn lọc được mẫu mang gen cần chuyển. Các phôi sau khi cấy trên môi trường đồng nuôi cấy được cấy sang môi trường chọn lọc có bổ sung lượng kanamycin thích hợp để chọn lọc. Từ đó chúng tôi đưa ra thí nghiệm ảnh của chất kháng sinh đến sự sống sót và hình thành mô sẹo của phôi không chứa gen chuyển để đưa ra nồng độ thích hợp nhất nhằm chọn lọc phôi sau khi chuyển gen. Thí nghiệm được tiến hành theo các công thức sau:
CT1: Môi trường có nồng độ kanamycin là 20 mg/l CT2: Môi trường có nồng độ kanamycin là 30 mg/l
CT3: Môi trường có nồng độ kanamycin là 40 mg/l CT4: Môi trường có nồng độ kanamycin là 50 mg/l
CT5: Môi trường có nồng độ kanamycin là 60 mg/l CT6: Môi trường có nồng độ kanamycin là 70 mg/l
+ Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, 6 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần theo dõi 3 đĩa, 10 mẫu/ đĩa.
+ Chỉ tiêu theo dõi: Số phôi sống sót và hình thành mô sẹo sau chọn lọc kháng sinh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/