3. Nội dung nghiên cứu
2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh học - khoa Khoa học Sự Sống - Trường Đại học Khoa Học - Đại học Thái Nguyên, Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào khoa Sinh học - Trường Đại học Sư Phạm Thái Nguyên.
Thời gian nghiên cứu từ 20/8/2013 đến 20/3/2015
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Trong quá trình nghiên cứu sử dụng các phương pháp thường quy của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật như khử trùng mẫu, tái sinh cây trực tiếp từ phôi non. Kỹ thuật chuyển gen bằng phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumefaciens theo nghiên cứu của Paz và cs (2009) [43]. Có một số cải tiến cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
2.2.1.
Đ
của hai giống ngô LVN 99, LVN 885
3/2015. Các cây ngô mẹ được treo thẻ đánh dấu giống và khi cây ra hoa, ụ phấ
các độ tuổi từ 5-15 ngày để làm thí nghiệm.
Hình 2.1. Cây ngô mẹ đƣợc trồng ngoài đồng ruộng
1
v 70%
70%
, gây tổn thương trên phôi ngô rồi ngâm trong môi trường ½ MS lỏng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
2.2.3. Tạo dịch huyền phù
Nuôi cấy tạo khuẩn lạc: Nuôi chủng vi khuẩn A.tumefaciens mang plasmid tái tổ hợp pPhaso-Cys2 trên môi trường LB đặc có bổ sung kanamycin (50 mg/l) và rifamycin (25 mg/l) trong tủ ổn nhiệt 280 C, 48 giờ.
Nuôi lỏng lần 1, 2: chọn khuẩn lạc đã mọc ở trên tiếp tục nuôi cấy trên LB lỏng. Nuôi lắc 2000 v/p ở 280C trong 16 giờ. Tiếp tục lấy dung dịch nuôi lỏng lần 1 (1 ml dung dịch khuẩn) nuôi trong 10 ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh kanamycin và rifamycin.
Tạo dung dịch khuẩn huyền phù: li tâm dung dịch nuôi lỏng lần 2, loại bỏ dịch nổi, hòa tan cặn trong MS lỏng (bổ sung 100 µM acetosyringone ) và pha loãng dịch đến OD660nm đạt 0,6 – 0,8.
2.2.4. Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy
Phôi non sau khi tách khỏi hạt, gây tổn thương được ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn trong 20 - 30 phút sau đó thấm khô và cấy trên môi trường H1: N6 + 2 mg/l 2,4-D; 10 mg/l AgNO3; 2,3 g/l L-proline; 100 mg/l casein hydrolysate; 20 g/l sucrose; 10 g/l glucose; 100 µM acetosyringone. Nuôi trong tối 3 ngày.
2.2.5. Diệt khuẩn, nuôi cấy và chọn lọc mô sẹo chuyển gen
Phôi sau khi gây nhiễm được rửa bằng dung dịch cefotaxim 500 mg/l, cấy trên môi trường H2: N6 + 2 mg/l 2,4-D; 10 mg/l AgNO3; 2,3 g/l L- proline; 100 mg/l casein hydrolysate; 20 g/l sucrose, 10 g/l glucose; 500 mg/l cefotaxim; 50 mg/l kanamycin.
Sau 2 tuần, chuyển phôi sang môi trường H3: N6 + 3 mg/l 2,4-D; 0 - 20 mg/l AgNO3; 2,3 g/l L-proline; 100 mg/l casein hydrolysate; 20 g/l sucrose; 10 g/l glucose; 200 mg/l cefotaxim, 30 mg/l kanamycin để chọn lọc mô sẹo chuyển gen.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Sau 1 tuần tiếp theo, cấy mô sẹo sang môi trường H4: N6 + 2 mg/l 2,4- D; 15 mg/l AgNO3; 1,15 g/l L-proline; 100 mg/l casein hydrolysate; 20 g/l sucrose; 10 g/l glucose. Nuôi cấy trong tối để mô sẹo đạt kích thước lớn hơn.
Hình 2.3. Mô sẹo sau khi chọn lọc kháng sinh
2.2.6. Phương pháp tái sinh cây từ mô sẹo, tạo rễ và cho cây ra đất
Các mô sẹo sau khi xử lý chuyển gen và chọn lọc được đưa vào môi trường tái sinh là môi trường H5 có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BAP hoặc kinetin ( MS + 2 mg/l BAP (hoặc kinetin) + 30 g/l đường sucrose) Đặt trong điều kiện 280C, ánh sáng 8 giờ/ngày trong phòng nuôi cấy.
Sau khi chồi được tái sinh sẽ chuyển sang môi trường tạo rễ gồm môi trường H6: MS + 1 mg/l NAA+ 30 g đường sucrose bổ sung chất điều hòa sinh trưởng NAA hoặc IBA từ 1,5 mg/l; 7,5 g/l agar; pH 5,8. Đặt trong điều kiện 280C, ánh sáng 8 giờ/ngày trong phòng nuôi cấy.
Cây con hoàn chỉnh sẽ được cho ra đất qua hai đợt huấn luyện: huấn luyện giá thể và huấn luyện điều kiện khí hậu. Giá thể sử dụng là đất màu pha cát có bổ sung dinh dưỡng, muối khoáng cần thiết cho sự sinh trưởng, phát triển của cây. Cây trong bình tam giác được đưa ra ngoài, rửa hết thạch bám
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
trên rễ, trồng vào giá thể đất màu pha cát và tưới nước đủ ẩm và đặt trong điều kiện 280C, ánh sáng 8 giờ/ngày trong phòng nuôi cấy. Tạo điều kiện thuận lợi cho rễ thích nghi với giá thể mới. Giai đoạn huấn luyện điều kiện khí hậu được tiến hành sau khi cây con được huấn luyện giá thể 5 - 7 ngày. Cây con được đưa ra điều kiện khí hậu bên ngoài, và tưới đủ nước mỗi ngày. Cây con cứng cáp được đưa ra trồng ra đất ruộng.
2.2.7. Phương pháp bố trí thí nghiệm thử các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng chuyển gen của ngô năng chuyển gen của ngô
Nghiên cứu chuyển gen Cystatin2 liên quan đến khả năng kháng mọt
vào 2 giống ngô thông qua vi khuẩn A.tumefaciens.
- Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của thời gian gây nhiễm A.tumefaciens đến việc tạo mô sẹo từ phôi non.
Phôi ngô sau khi được tách khỏi hạt, gây tổn thương được ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn A.tumefaciens để biến nạp với các mốc thời gian khác nhau. Sau đó nuôi cấy trên môi trường đồng nuôi cấy H1 nuôi tối 3 ngày và chuyển sang môi trường H2 không có kháng sinh, tiếp tục cấy chuyển 1 tuần/1 lần với môi trường H2 không có kháng sinh. Thí nghiệm được tiến hành theo các công thức:
CT1: Ngâm phôi của 2 giống ngô trong dịch huyền phù trong 5 phút CT2: Ngâm phôi của 2 giống ngô trong dịch huyền phù trong 10 phút CT3: Ngâm phôi của 2 giống ngô trong dịch huyền phù trong 20 phút CT4: Ngâm phôi của 2 giống ngô trong dịch huyền phù trong 30 phút
CT5: Ngâm phôi của 2 giống ngô trong dịch huyền phù trong 40 phút + Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn
toàn, 5 công thức, thực hiện 3 lần nhắc lại, mỗi công thức theo dõi 3 đĩa, mỗi đĩa 10 phôi.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
+ Chỉ tiêu theo dõi: số phôi sống sót và hình thành mô sẹo sau biến nạp
- Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của chất kháng sinh kanamycin đến khả năng tạo mô sẹo từ phôi non.
Các phôi có chứa gen Cystatin2 sau quá trình chuyển gen có khả năng kháng với chất chọn lọc kháng sinh kanamycin, vì vậy khi bổ sung kanamycin thích hợp vào môi trường thì sẽ chọn lọc được mẫu mang gen cần chuyển. Các phôi sau khi cấy trên môi trường đồng nuôi cấy được cấy sang môi trường chọn lọc có bổ sung lượng kanamycin thích hợp để chọn lọc. Từ đó chúng tôi đưa ra thí nghiệm ảnh của chất kháng sinh đến sự sống sót và hình thành mô sẹo của phôi không chứa gen chuyển để đưa ra nồng độ thích hợp nhất nhằm chọn lọc phôi sau khi chuyển gen. Thí nghiệm được tiến hành theo các công thức sau:
CT1: Môi trường có nồng độ kanamycin là 20 mg/l CT2: Môi trường có nồng độ kanamycin là 30 mg/l
CT3: Môi trường có nồng độ kanamycin là 40 mg/l CT4: Môi trường có nồng độ kanamycin là 50 mg/l
CT5: Môi trường có nồng độ kanamycin là 60 mg/l CT6: Môi trường có nồng độ kanamycin là 70 mg/l
+ Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, 6 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần theo dõi 3 đĩa, 10 mẫu/ đĩa.
+ Chỉ tiêu theo dõi: Số phôi sống sót và hình thành mô sẹo sau chọn lọc kháng sinh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
2.2.8. Đánh giá, phân tích kết quả chuyển gen
2.2.8.1. Phương pháp tách DNA từ cây ngô
Quy trình tách DNA tổng số từ lá cây ngô
Cân 200g mẫu lá cây và nghiền trong nitơ lỏng bằng cối, chày sứ cho đến khi thành dạng bột mịn, sau đó cho vào ống eppendorf 2ml.
Bổ sung thêm 700µl dung dịch đệm tách chiết DNA và trộn đều bằng cách đảo nhẹ.
Bảng 2.3. Thành phần dung dịch đệm tách chiết DNA
STT Thành phần Nồng độ
1 Tris- HCl, pH=8,0 0,1M
2 NaCl 1,4M
3 EDTA 0,02M
4 CTAB 4%
Ủ ở nhiệt độ 65°C khoảng 1 giờ (cứ 5 phút đảo nhẹ 1 lần).
Thêm 600µl dung dịch chloroform: isoamyl alcohol (24:1) đảo đều và để 5 phút ở nhiệt độ phòng.
Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000v/p ở 4°C, trong 15 phút. Dùng pipet hút lấy 500µl dịch nổi chuyển sang ống eppendorf 1,5ml.
Thêm 500µl isopropanol lạnh, để ở nhiệt độ khoảng -20°C, trong 30 phút.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Loại bỏ phần dịch nổi phía trên rửa DNA kết tủa dưới đáy ống bằng cồn 70% (1 lần). Ly tâm 13000v/p và làm khô DNA kết tủa ở đáy ống eppendorf.
Bổ sung 50µl nước khử ion và 2µl RNAse, ủ ở 37°C trong 30 phút.
2.2.8.2. PCR kiểm tra sự có mặt của gen biểu hiện
Chúng tôi tiến hành phản ứng PCR để kiểm tra sự có mặt của gen quan tâm với cặp mồi như trong bảng 2.2 với thành phần phản ứng theo bảng 2.4:
Bảng 2.4. Thành phần chạy phản ứng PCR nhân gen Cys2
ngô STT Thành phần Thể tích (µl) 1 H2O 12,5 2 Buffer (10X) 2,5 3 dNTP(25mM) 2,5 4 Mg2+(25mM) 2,5 5 CYS-F(10pM/µl) 1 6 CYS-R (10pM/µl) 1 7 Taq polymerase 1 8 DNA 2 Tổng thể tích 25
Bảng 2.5. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR nhân gen Cys2
Bước Phản ứng Nhiệt độ ( ºC) Thời gian Chu kì
1 Biến tính 95 4 phút 1
2 Biến tính 95 30 giây
35
3 Gắn mồi 58 30 giây
4 Kéo dài chuỗi 72 30 giây
5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Kết quả kiểm tra PCR bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
2.2.8.3. Phương pháp điện di trên gel agarose
Quy trình: Hòa tan agarose 0,8% để nhiệt độ hạ xuống khoảng 50- 600C. Đổ dung dịch vào khay gel có cài sẵn răng lược thích hợp, trong quá trình đổ hạn chế tạo bọt khí. Sau 30-60 phút, khi gel đó đông cứng, tháo răng lược, đặt khay gel vào bể điện di. Đổ đệm TAE 1X ngập cách mặt gel một khoảng 2mm
Lấy 8µl DNA trộn cùng với 2µl đệm tra mẫu (Loading dye 6X), tra mẫu vào các giếng trên bản gel. Tiến hành điện di với hiệu điện thế 100v, cường độ dòng điện vào khoảng 60-80mA. Theo dõi sự di chuyển của vệt màu bromophenol blue để ngừng thời gian phù hợp (sau khoảng 30 phút).
Gel sau khi chạy điện di được ngâm trong dung dịch EtBr 5 đến 10 phút. Sau đó gel được chuyển sang máy UV để soi gel. Gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại, DNA được hiện lên dưới dạng các vạch sáng, ảnh điện di được chụp trên máy Bio-Rad với tia UV có bước sóng 312 -365nm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Chuyển vector mang gen Cystatin2 vào 2 giống ngô nghiên cứu
3.1.1. Ảnh hưởng của thời gian gây nhiễm A.tumefaciens đến khả năng tạo mô sẹo từ phôi non
Thời gian gây nhiễm (thời gian ngâm phôi trong dịch huyền phù khuẩn
A.tumefaciens) có ảnh hưởng rất lớn tới sự thành công của việc chuyển gen cũng đồng thời ảnh hưởng đến việc tạo mô sẹo, tái sinh của cây. Do đó, chúng tôi tiến hành đánh giá ảnh hưởng của thời gian gây nhiễm vi khuẩn
A.tumefaciens đến khả năng tạo mô sẹo từ phôi non.
Phôi của 2 dòng ngô LVN 99, LVN 885 được gây nhiễm ở các thời gian khác nhau trong dung dịch khuẩn 5 phút, 10 phút, 20 phút, 30 phút và 40 phút. Sau đó phôi đã lây nhiễm khuẩn được nuôi cấy trong tối 3 ngày ở môi trường H1 (N6 + 2 mg/l 2,4-D, 10 mg/l AgNO3, 2,3 g/l L-proline, 100 mg/l casein hydrolysate, 20 mg/l sucrose, 10 g/l glucose, 100 µM acetosyringone) có chứa acetosyringone để tạo điều kiện cho vi khuẩn A.tumefaciens xâm nhập vào tế bào. Sau 3 ngày phôi được chuyển sang môi trường H2 (N6 + 2 mg/l 2,4-D; 10 mg/l AgNO3; 2,3 g/l L-proline; 100 mg/l casein hydrolysate; 20 g/l sucrose, 10 g/l glucose) không có kháng sinh. Phôi cấy trên môi trường H2 không có kháng sinh được cấy chuyển sau 1 tuần. Thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần, mỗi lần thí nghiệm 30 phôi với mỗi giống và mỗi khung thời gian là 30 phôi, tổng phôi đã thực hiện với mỗi mẫu với một khung thời gian là 90 phôi. Sau 2 tuần nuôi cấy, kết quả được thể hiện ở bảng 3.1, hình 3.1.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của thời gian gây nhiễm A.tumefaciensđến khả năng tạo mô sẹo từ phôi non của 2 giống ngô LVN 99 và LVN 885
Tên giống Số lƣợng mô sẹo hình thành 5' 10' 20' 30' 40’ Số lƣợng Tỉ lệ (%) Số lƣợng Tỉ lệ (%) Số lƣợng Tỉ lệ (%) Số lƣợng Tỉ lệ (%) Số lƣợng Tỉ lệ (%) LVN 99 90 100 90 100 88 98 86 96 80 89 LVN 885 90 100 89 99 89 99 87 97 79 88
Hình 3.1. Ảnh hƣởng của thời gian gây nhiễm A.tumefaciens đến sự hình thành mô sẹo của 2 giống ngô LVN 99 và LVN 885
Kết quả ở bảng 3.1 và hình 3.1 cho thấy ở các mức thời gian ngâm phôi
trong dịch huyền phù vi khuẩn A.tumefaciens khác nhau thì có sự khác biệt về tỉ lệ hình thành mô sẹo của 2 giống ngô LVN99 và LVN885. Như vậy, thời gian gây nhiễm A.tumefaciens có ảnh hưởng tới sự hình thành mô sẹo của cả 2 giống ngô nghiên cứu theo hướng thời gian ngâm phôi càng lâu thì số lượng mô sẹo hình thành càng giảm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Đối với giống ngô LVN99, với thời gian ngâm phôi từ 5 phút đến 10 phút tỉ lệ hình thành mô sẹo sau 2 tuần nuôi cấy là cao nhất, đạt 100%. Tuy nhiên, khi tăng thời gian xử lý ngâm phôi trong dịch huyền phù vi khuẩn A.tumefaciens thì tỉ lệ hình thành mô sẹo giảm rõ rệt. Cụ thể khi ngâm ở mức thời gian là 20 – 30 – 40 phút thì khả năng hình thành mô sẹo giảm tương ứng còn 98% - 96% - 89%. Đối với giống ngô LVN885, tỉ lệ hình thành mô sẹo đạt 100% khi gây nhiễm ở mức thời gian là 5 phút, ở mức thời gian gây nhiễm là 10 phút – 20 phút thì tỉ lệ hình thành mô sẹo đạt 99% và tỉ lệ này giảm tương ứng còn 97% sau 30 phút gây nhiễm và 88% sau 40 phút gây nhiễm. Như vậy, rõ ràng việc kéo dài thời gian xử lý ngâm phôi trong dịch huyền phù vi khuẩn A.tumefaciens sẽ làm giảm tỉ lệ tỉ lệ hình thành mô sẹo của phôi sau 2 tuần nuôi cấy. Tuy nhiên, thực tế cho thấy nếu thời gian gây nhiễm quá ngắn sẽ có thể ảnh hưởng tới khả năng xâm nhập của vi khuẩn A.tumefaciens vào tế bào phôi. Theo bảng 3.1, tỉ lệ phôi sống sót và hình thành mô sẹo sau khoảng thời gian 20 – 30 phút gây nhiễm đạt trên 95% đối với cả 2 giống ngô nghiên cứu - đây là tỉ lệ tin cậy để sử dụng cho quá trình gây nhiễm A.tumefaciens. Vì vậy, để thuận lợi cho vi khuẩn lây nhiễm vào phôi, đồng thời vẫn cho tỉ lệ tỉ lệ hình thành mô sẹo của phôi cao, chúng tôi lựa chọn thời gian ngâm phôi trong dịch huyền phù vi khuẩn A.tumefaciens là từ 20 -