3. Nội dung nghiên cứu
3.2. Kết quả kiểm tra cây ngô mang gen Cys2 sau khi chuyển gen
Sau quá trình biến nạp, cấy chuyển chọn lọc chúng tôi thu được kết quả chọn lọc cũng như số cây ra rễ sau chọn lọc sơ bộ được thể hiện ở Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả tạo cây ngô chuyển gen Cys2
Tên
giống Số phôi biến nạp môi trƣờng H2 Số mô sẹo sau môi trƣờng H3 Số mô sẹo sau Số cây tạo thành Số lƣợng Tỉ lệ (%) Số lƣợng Tỉ lệ (%) Số lƣợng Tỉ lệ (%) Số lƣợng Tỉ lệ (%) LVN 99 500 100 207 41,4 68 13,6 2 0,4 LVN 885 500 100 220 44 56 11,2 0 0
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Kết quả ở bảng 3.3 cho thấy số lượng phôi sống sót và hình thành mô sẹo trên môi trường chọn lọc giảm dần theo thời gian, điều này cho thấy khả năng những cây tồn tại và phát triển được là những phôi mang các tế bào đã được chuyển gen. Sau 3 - 4 tuần, giống LVN 99 có 68 phôi sống sót và giống LVN 885 có 56 phôi sống trên môi trường chọn lọc sau biến nạp. Sau 4 - 8 tuần, giống LVN 99 tạo được 2 cây ngô chuyển gen hoàn chỉnh giống LVN 885 không tạo được cây ngô nào. Giống LVN 885 có mô sẹo được tạo thành nhưng không thể phát triển thành cây như vậy là tỉ lệ chuyển gen của giống LVN 885 ở thí nghiệm này là 0%. Còn tỉ lệ chuyển gen sau khi chọn lọc bằng kháng sinh ở giống LVN 99 là 0,4%. Như vậy qua chọn lọc bằng kháng sinh kanamycin khả năng giống LVN 99 chấp nhận cấu trúc gen Cys2, còn giống LVN 885 không chấp nhận cấu trúc gen này. Tuy nhiên để chắc chắn hơn chúng tôi tiếp tục tiến hành kiểm tra bằng phương pháp PCR đối với 2 dòng ngô LVN99 chuyển gen đã sống sót sau khi chọn lọc.
A B
Hình 3.4. Dòng cây ngô chuyển gen đƣợc tái sinh từ phôi non (A) và dòng cây chuyển gen đƣợc đƣa ra môi trƣờng đất pha cát (B)
từ giống ngô LVN99
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong cây ngô chuyển gen, chúng tôi tiến hành tách DNA tổng số từ mẫu lá của 2 dòng ngô chuyển gen Cys2 từ giống ngô LVN99 (hình 3.4) và 6 mẫu cây ngô đối chứng không chuyển gen (3 mẫu thuộc giống LVN 99, 3 mẫu thuộc giống LVN 885). Kết quả tách DNA tổng số được thể hiện trong hình 3.5.
Hình 3.5. Ảnh điện di kiểm tra DNA tổng số tách từ lá cây ngô
Kết quả tách DNA tổng số cho thấy đã tách chiết thành công mẫu DNA, tỷ lệ đứt gãy thấp và đảm bảo đủ các yêu cầu để sử dụng làm mẫu cho phản ứng PCR
tiếp theo.
Sau khi tách chiết DNA tổng số, chúng tôi tiếp tục PCR với cặp mồi CYS
-F/R để kiểm tra sự có mặt của gen Cystatin2 trong cây ngô. Vì số bản sao gen trong lá cây thường ít hơn so với trong các mẫu vi khuẩn nên phản ứng PCR phải kéo dài hơn, trong thí nghiệm này chúng tôi cho lặp lại phản ứng 35 chu kỳ. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR được thể hiện trên hình 3.5.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.6. Hình điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen Cys2 từ 2 dòng ngô LVN99 chuyển gen, giếng 6,7, giếng 1 marker 100bp, giếng 2 sản
phẩm PCR từ plasmid, giếng 3,4,5 và 8,9,10 là mẫu ngô đối chứng
Kết quả thể hiện ở hình 3.6 cho thấy, sản phẩm PCR khi điện di có 9 mẫu trong đó mẫu đối chứng dương là nhân gen từ plasmid và 2 dòng ngô LVN99 chuyển gen có sản phẩm PCR, kích thước khoảng 400bp. Kích thước này hoàn toàn phù hợp với chiều dài của gen Cys2 đã chuyển. Như vậy, số cây ngô mang gen Cys2 là 2/2 cây thu được sau chọn lọc. Vì vậy, có thể khẳng định gen Cys2 đã được chuyển vào cây ngô. Như vậy, qua kiểm tra sơ bộ bước đầu chúng tôi đã thu được dòng cây ngô chuyển gen mang cấu trúc
Cys2.
Theo như nghiên cứu của chúng tôi kết quả chuyển gen thông qua A. tumefaciens đã đạt được là 0,4%, với 100% cây ngô sau khi chọn lọc có chứa
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
gen chuyển. So sánh với những kết quả chuyển gen đã công bố ở Việt Nam và trên thế giới, chúng tôi nhận thấy tỉ lệ chuyển gen thành công của chúng tôi tương đối cao so với các công bố trước ở Việt Nam, tuy nhiên so với ở nước ngoài thì tỉ lệ chuyển thành công 0,4% vẫn là khá thấp. Cụ thể, theo công bố của tác giả Đinh Văn Trình và cộng sự, chuyển thành công vào ngô gen chịu hạn - ZmDREB2A tỉ lệ đạt 0,023%. Trương Thu Hằng và cộng sự cũng công bố chuyển gen kháng sâu CryIAci vào dòng ngô HR9 với tỉ lệ 0,22%. Năm 2008, Vega và cs đã công bố tỉ lệ chuyển gen sử dụng vector pCABIA3301 và
pZY101 vào phôi non dòng ngô Hi-II đạt tới 12% và có những dòng ngô đã chuyển đạt tỉ lệ 18%.
Qua kết quả chúng tôi thu được và từ các kết quả chuyển gen ở ngô trước đây thông qua A.tumefaciens tôi nhận thấy việc chuyển gen phụ thuộc rất lớn vào các giống ngô chuyển gen. Vì theo nghiên cứu của chúng tôi và các nghiên cứu trước, với cùng một hệ thống vector chuyển vào các giống ngô khác nhau cho ra được tỉ lệ chuyển gen khác nhau với độ chênh lệch tương đối lớn. Vì vậy, theo đánh giá của chúng tôi để có thể chuyển được gen vào ngô cho tỉ lệ thành công cao chúng ta nên chọn nhiều giống có các đặc điểm tốt để dùng làm mẫu chuyển.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4. 1. Kết luận
Qua kết quả thử nghiệm chuyển gen Cys2 vào giống ngô LVN99 và giống ngô LVN 885 thông qua vi khuẩn A.tumefaciens chúng tôi xin rút ra một số kết luận sau:
1. Thời gian gây nhiễm vi khuẩn A.tumefaciens cho tỉ lệ hình thành mô sẹo cao mà vẫn đảm bảo cho vi khuẩn A.tumefaciens lây nhiễm vào phôi là trong khoảng từ 20 - 30 phút đối với cả 2 giống ngô LVN99 và LVN885. 2. Nồng độ kháng sinh kanamycin trong môi trường thích hợp nhất cho chọn lọc là 50 mg/l đối với cả 2 giống ngô LVN99 và LVN885.
3. Đã chuyển gen thành công gen Cystain2 vào giống ngô LVN99 với tỉ lệ 0,4%, và theo nghiên cứu này thì tỉ lệ chuyển gen thành công ở giống ngô LVN99 cao hơn giống LVN885.
4.2. Kiến nghị
- Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố khác đến quy trình chuyển gen Cystain2 vào giống ngô LVN99 để hoàn thiện quy trình.
- Tiếp tục nghiên cứu chuyển gen Cystain2 trên các giống ngô khác dựa vào các kết quả đã đạt được ở giống LVN99.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Trương Văn Đích (2000), Kỹ thuật trồng ngô năng suất cao, NXB Nông nghiệp Hà Nội.
2. Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển (2007), ―Cấu trúc vector plasmid mang gen kháng sâu và ứng dụng trong tạo cây trồng chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefacien‖, Hội nghị khoa học công nghệ, tr. 345- 350.
3. Phạm Thị Hạnh, Phan Tường Lộc, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ (2007), ―Tạo cây thuốc lá kháng thuốc trừ cỏ và côn trùng‖, phòng Công nghệ gen thực vật, Viện Sinh học nhiệt đới Hội nghị Khoa học và Công nghệ.
4. Lê Huy Hàm (2006), ―Sử dụng kỹ thuật biến nạp di truyền cải tạo một số đặc tính nông sinh học ở ngô và lúa mỳ‖, Báo cáo Viện di truyền nông nghiệp.
5.
(CryIAc Agrobacterium tumefaciens‖,
, Đại học Quốc gia Hà Nội , 29(3), tr. 17-29.
6. Bùi Công Hiển (1995), Côn trùng hại kho, NXB Khoa học và kỹ thuật Hà Nội.
7. Nguyễn Xuân Hiển (1972), Một số kết quả nghiên cứu về cây ngô, NXB Khoa Học và Kỹ Thuật, Hà Nội.
8.
(2005),
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Khoa học và Công nghệ - Đại Học Thái Nguyên, trang 69, tập 132, số 02.
9. Nguyễn Đức Lương, Dương Văn Sơn, Lương Văn Hinh (2002), Giáo trình cây lương thực (dành cho sinh viên cao học), NXB Nông nghiệp. 10. Nguyễn Đức Lương, Dương Văn Sơn, Lương Văn Hinh (2000), Giáo
trình cây ngô, NXB Nông nghiệp. Tr. 14-32.
11. Chu Hoàng Mậu (2008), Phương pháp phân tích di truyền hiện đại trong chọn giống cây trồng, NXB Đại học Thái Nguyên.
12. Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Thúy Hường, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Hà (2011), Gen và đặc tính chịu hạn của cây đậu tương, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội.
13. TS Ngô Hữu Tình (2009), Giáo trìnhCây ngô, NXB Nghệ An.
14. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh (2005), Công nghệ sinh học nông nghiệp, NXB Đại học Sư phạm.
15. Phạm Thị Lý Thu (2007), ―Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh từ phôi non và xác định phương pháp chuyển gen thích hợp ở ngô‖, Luận án tiến sĩ sinh học (146 tr).
16. Vũ Thị Thu Thủy (2011), ―Tạo dòng chịu hạn và phân lập gen Cystatin liên quan đến tính chịu hạn ở cây lạc‖, Luận án tiến sĩ sinh học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên.
17. Vì Thị Xuân Thủy, Hồ Mạnh Tường, Lê Văn Sơn, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Mậu (2014), Tách dòng gen Cystatin2 phân lập từ một số mẫu ngô địa phương Việt Nam, Tạp chí sinh học, 36(1): 110- 117.
18. , Lê
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
19. Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2007), Công nghệ sinh học (tập 2)- Công nghệ sinh học tế bào, NXB Giáo dục. p. 91- 95.
20. Abe K., Emori Y., Kondo H., Susuki K., Aria S. (1987), "Molecular cloning of a cystein proteinase inhibitor of rice (Oryzacystatin) - Homology with animal cystatin and transient expression in the ripening process of rice seeds", J Biol Chem, 262 (35), 16793-16797.
21. Adeniala S. O., José X. F., Sales M. P. (2003), "Cysteine proteinases and cystatins", Braz. arch. biol. technol, 46 (1), 99-104.
22. Anima S. E., Mgutu A. J., Taracha C., Coussens G., Karimi M., Hilson P., Lijsebettens M. V., Machuka J. (2010), ―Somatic embryogenesis and plant regeneration of tropical maize genotypes‖, Plant Cell Tiss Organ Cult , 2, pp. 285-295.
23. Barrett, A. J. (1994) "Classification of peptidases", Methods Enzymol.
244, pp. 1–15.
24. Bode W., Engh R., Musil D., Thiele U., Huber R.,Karshnikov A., Brzin J., Kos J. & Turk V. (1990), " Mechanism of interaction oF cysteine ptoteinases and their protein inhibitors as compared to the serine proteinase inhibitor interaction", Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 371, pp. 111- 118.
25. Carrillo L., Martinez M., Ramessar K., Cambra I., Castanera P., Ortego F., I. D. (2011), "Expression of a barley cystatin gene in maize enhances resistance", Plant Cell Reports, 101-112.
26. Chan M. T., Lee T. M., Chang H. H. (1992), ―Transformation of indica rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens‖, Plant Cell Physiol, 33, pp. 577- 583.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
27. Chan M. T., Chang H. H., Ho S. L., Tong W. F., Yu S. M. (1993), ―Agrobacterium-mediated production of transgenic rice plants expressing a chimeric a-amylas promoter / P-glucuronidase gene‖, Plant Mo1 Biol, 22, pp. 491-506.
28. Cheng M., Fry J. E., Pang S., et al. (1997), ―Genetic transformation of wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens‖, Plant Physiology, 115(3), pp. 971-980.
29. David R. (2004), Insects stored products. CSIRO Australia.
30. Frame B. R., Shou H., Chikwamba R., Zhang Z., Xiang C., Fonger T. M., Pegg S. E. K., Li B., Nettleton , Pei D. & Wang K. (2002), ―Agrobacterium tumefaciens -mediated Transformation of Maize Embryos Using a Standard Binary Vector System‖, Plant Physiol, 129, pp. 12-22.
31. Frame B. R., McMurray J. M., Fonger T. N., Main M. L., Taylor K. W., Torney F. J., Paz M. M.., Wang K. (2006), ―Improved
Agrobacterium-mediated transformation of three maize inbred lines using MS salts‖, Plant Cell Rep, 25(10), pp. 1024-1034.
32. Hiei Y., Ohta S., Komari T., Kumashiro T. (1994), ―Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium
and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA‖, Plant J, 6(2), pp. 271-82.
33. Ishida Y., Saito H., Ohta S., Hiei Y., Komari T., and Kumashiro T. (1996), ―High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens‖, Nature Biotechnology, 14(6), pp. 745–750.
34. Ishida Y., Hiei Y., Komari T. (2007), ―Agrobacteium-mediated transformation of maize‖, Nature Protocol, 12(7), pp. 1614-1621.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
35. James A. O., Adebayo A. O (2012), "Rearing the Maize Weevil,
Sitophilus zeamais, on an Artificial Maize—Cassava Diet", J Insect Sci, 12.
36. Kim H. A., Utomo S. D., Kwon S. Y., Min S. R., Kim J. S., Yoo H. S. and Choi P. S. (2009), ―The development of herbicide-resistant maize: stable Agrobacterium-mediated ransformation of maize using explants of type II embryogenic calli‖, Plant Biotechnol Rep, 3(4), pp. 277-283. 37. Kuschel G. (1961), "On problem of synonymy in the Sitophyllus oryzae
complex (30th contribution, Col. Curculionidea)", Annals and Magazine of Nature History, 13(4), pp. 241-244.
38. Li N., Zhang S., Zhao Y., Li B., Zhang J. (2011), ―Over-expression of AGPase genes enhances seed weight and starch content in transgenic maize‖, Planta, 233, pp. 241-250.
39. Massonneau A., Condamine P., Wisniewski J. P., Zivy M., Rogowsky P. M. (2005), "Maize cystatins respond to developmental cues, cold stress and drought", Biochim Biophys Acta, 1729(3), PP. 99-186.
40. Mikami A. Y., Carpentieri P. V., Ventura M. U. (2012), "Resistance of maize landraces to the maize weevil Sitophilus zeamais Motsch.(Coleoptera: Curculionidae)." Neotrop Entomol, 41 (5), 404-8. 41. Mwololo J. K., Mugo S., Okori P., T. Tefera, Otim M., S. W. M.
(2012), "Sources of Resistance to the Maize Weevil Sitophilus zeamais
in Tropical Maize", Journal of Agricultural Science, 4 (11).
42. Ombori O., Muoma J. V. O., Machuka J. (2012), ―Agrobacterium-
mediated genetic transformation of selected tropical inbred and hybrid maize (Zea mays L.) lines‖, Plant Cell Tiss Org, DOI 10.1007/s11240- 012-0247-1.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
43. Paz, Margie Margarita M.(Ames, IA, US) Wang, Kan (Ames, IA, US)
(2009) ―Soybean transformation and regeneration using half-seed explants‖.
Theoretical and Applied Genetics, vol, 107. Pp 439-447
44. Rawlings, N. D. & Barrett, A. J. (1999) "MEROPS:The peptidase database", Nucleic Acids Res, 27, pp. 325–331.
45. Sambrook J., Russell D. W., eds (2001), ―Molecular Cloning: laboratory Manual, 1st ed. Cold Spring Harbor laboratory Press‖, Cold Spring Harbor, NY.
46. Shu-Guo FAN, WU G. J. (2005), "Characteristics of plant proteinase inhibitors and their applications in combating phytophagous insects",
Bot. Bull. Acad Sin, 46, 273-92.
47. Sidorov V., Gilbertson L., Addae P., Duncan D. (2006), ―Agrobacterium-mediated transformation of seedling-derived maize callus‖, Plant Cell Rep, 25, pp. 320-328.
48. Takava S., Rahnama H., Rahimian H., and Kazemitabar K. (2010), ―Agrobacterium Mediated Transformation of Maize (Zea mays L.)‖,
Journal of Sciences, Islamic Republic of Iran, 21(1), pp. 21-29.
49. Tefera T., Demissie G., Mugo S., Y. B. (2013), "Yield and agronomic performance of maize hybrids resistant to the maize weevil Sitophilus zeamais Motschulsky (Coleoptera: Curculionidae)", pp. 91-99.
50. Turk B., Turk V., Turk D. (1997), "Structural and functional aspects of papain-like cysteine proteinase and their protein inhibitor", Biol. Chem. Hopp seyler , 378, pp. 141-150.
51. Vega J. M., Yu W., Kennon A. R., Chen X., Zhang Z. J. (2008), ―Improvement of Agrobacterium-mediated transformation in Hi-II maize (Zea mays L.) using standard binary vectors‖, Plant Cell Rep, 27, pp. 297- 305.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
52. Wang Z., Chen X., Wang J., Liu T., Liu Y., Zhao L., Wang G. (2007), ―Inreasing maize seed weight by enhancing the cytoplasmic DP- glucose pyrophosphorylase activity in transgenic maize plants‖, Plant Cell Tiss Organ, 88, pp. 83-92.
53. Wang T. T., Ji J., Wang G., Guan C. F., Zhang L., Jin C. (2012), ―Study on Agrobacterium-mediated transformation of psy gene into shoot meristem of maize‖, China Biol, 32(8), pp. 36-40.
54. http://www.ctu.edu.vn. 55. http://faostat.fao.org/. 56. http://www.gso.gov.vn 57. http: //www.ncbi.nlm.nih.gov./sites/nuccore/AF45439 58. http: //www.ncbi.nlm.nih.gov./sites/nuccore/D63342. 59. http: //www.ncbi.nlm.nih.gov./sites/nuccore/D64115 60. http://old.padil.gov.au/pbt/index.php?q=node/70&pbtID=217. 61. http://www.vietrade.gov.vn/.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/