3. Nội dung nghiên cứu
1.4. CHUYỂN GE NỞ THỰC VẬT
Chuyển gen thực vật đã phát triển cùng với sự phát triển của các kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào. Nó cho phép nghiên cứu cấu trúc và điều khiển hoạt động của gen. Nó còn mở ra triển vọng chuyển các gen có ý nghĩa kinh tế cho cây trồng.
1.4.1. Phƣơng pháp chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens
Hiện nay, có nhiều phương pháp chuyển gen được các nhà khoa học sử dụng để chuyển gen vào thực vật như: phương pháp gián tiếp sử dụng A.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
tumefaciens, phương pháp trực tiếp sử dụng xung điện, vi tiêm, xử lý polyethylene glycol (PEG) và dùng súng bắn gen. Mỗi phương pháp chuyển gen đều có những ưu, nhược điểm riêng tùy vào từng loài cây khác nhau. Trong đó phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A.tumefaciens đem lại hiệu quả cao và ít tốn kém nhất.
Năm 1980, lần đầu tiên DNA ngoại lai (transposon Tn7) được chuyển vào thực vật nhờ A.tumefaciens, tuy nhiên T-DNA vẫn chưa được thay đổi.
Năm 1983, nhiều nhóm nghiên cứu đã biến đổi T-DNA và đưa DNA ngoại lai vào, tạo ra tính kháng một số chất kháng sinh. Ngoài ra, các gen tạo khối u được cắt ra. DNA ngoại lai cùng với phần còn lại được chuyển vào thực vật và được biến nạp. Thành công này nhờ nghiên cứu chính xác con đường lây nhiễm của A.tumefaciens trước đó và khả năng của hệ thống chọn lọc đối với thực vật.
Phương pháp chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn A.tumefaciens
ban đầu không được xem là có hiệu quả với cây một lá mầm. Tuy nhiên, đã có nhiều cố gắng trong việc cải tiến khả năng tái sinh đối với các cây một lá mầm, những mô sẹo lây nhiễm với A.tumefaciens được sinh ra từ mô rễ và phôi chưa trưởng thành đã được sử dụng [26], [27].
Chuyển gen vào cây một lá mầm thông qua vi khuẩn A.tumefaciens là bước đột phá của công nghệ gen. Đây là kỹ thuật chuyển gen được ưa chuộng nhất vì có nhiều ưu điểm so với chuyển gen bằng phương pháp bắn gen, như cho nhiều sự kiện chuyển gen ổn định, ít bản sao, thể hiện đúng, tăng tần số đồng biểu hiện và ít có sự tái sắp xếp gen chuyển nạp. Đến nay, các quy trình chuyển gen hiệu quả đã được xây dựng cho các cây một lá mầm như lúa, lúa mì [26], [28], [32]. Chuyển gen vào phôi non ngô dòng A188 thông qua vi khuẩn A.tumefaciens [32]. Năm 2002, Frame và cs đã chuyển gen vào phôi non dòng ngô Hi II [30].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
A. tumefaciens. Đây là loại vi khuẩn sống trong đất, gây bệnh cho cây bằng cách gắn các đoạn gen vào hệ gen của tế bào chủ và sinh ra u nhờ một loại plasmid Ti. Phần lớn các loại Ti-plasmid gồm 4 vùng A, B, C, D.
Vùng A luôn luôn được truyền sang tế bào thực vật nên được gọi là T- DNA. Vùng B có liên quan đến sự tái sinh. Vùng C có liên quan đến sự tiếp hợp. Vùng D là vùng độc có chứa các gen vir, giữ vai trò quan trong trong việc chuyển T-DNA vào hệ gen nhân của tế bào thực vật.
Điều kiện cho việc chuyển T-DNA vào thực vật trước hết là tế bào bị tổn thương. Khi tế bào bị tổn thương, chúng tiết ra các hợp chất phenol (acetosyringon), chất có vai trò quan trọng trong việc nhận biết và sự gắn kết giữa vi khuẩn và tế bào thực vật. A.tumefaciens nhận biết acetosyringon nhờ một chất nhận, được mã hóa bằng một gen ở vùng vir. Sự nhận biết của chất nhận dẫn đến sự hoạt hóa của tất cả các gen vir.
Có hai hệ thống vector dùng cho chuyển gen thông qua A.tumefaciens
là hệ thống vector liên hợp và hệ thống vector nhị thể [14].
Vector liên hợp (cointegrate)
Vì kích thước Ti plasmid quá lớn nên thao tác với chúng rất khó khăn. Giải pháp cho việc này là chuyển vùng T - DNA lên một vector nhỏ hơn. Điều này là hoàn toàn có thể nhờ gen vir đóng vai trò vận chuyển gen vào tế bào chủ. Hệ thống này gọi là hệ thống vector liên hợp. Cả gen tiền ung thư và gen tổng hợp opine ở dạng T - DNA hoang dại đều được thay thế bởi gen chọn lọc (gen kháng kháng sinh). Gen sinh tổng hợp opine trên Ti plasmid cũng bị loại bỏ và chỉ giữ lại gen vir cần thiết cho việc hình thành bộ máy và cấu trúc đảm bảo cho việc sao chép bền vững của plasmid trong
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Vector nhị thể (binary vector)
Vector nhị thể bao gồm hai vector (một là plasmid tách dòng từ E.coli
trong đó có thiết kế vùng bờ trái và bờ phải, nằm giữa chúng là các gen chỉ thị và vùng gắn gen cần chuyển; plasmid thứ hai là Ti-plasmid cải tiến: toàn bộ vùng T-DNA và vùng bờ trái và bờ phải bị cắt bỏ chỉ giữ lại vùng vir, plasmid này được gọi là plasmid hỗ trợ). Hệ thống vector này cũng hoạt động theo cơ chế chuyển gen của vi khuẩn đất A.tumefaciens một cách rất hữu hiệu. Khắc phục tình trạng khó nhân bản trong A.tumefaciens, loại vector nhị thể được thiết kế bao gồm các phần như sau:
i) Vị trí ghép nối đa điểm;
ii) Đoạn khởi đầu tái bản hoạt động cả ở E.coli và A.tumefaciens; iii) Gen chọn lọc hoạt động được ở cả vi khuẩn và thực vật;
iv) gen có khả năng vận chuyển (như oriV, oriT, trfA), chỉ cần khi chuyển gen thông qua A.tumefaciens, không cần khi chuyển gen trực tiếp;
v) Đoạn T - DNA ngoại biên (border), đặc biệt là đoạn ngoại bien bắt buộc phải có. Ngoài ra còn một số thành phần phụ trợ khác như đoạn kích thích vận chuyển T - DNA.
Hệ vector nhị thể được thiết kế bao gồm hai plasmid tự tái bản. Loại vector vận tải mang đoạn gen quan tâm (gen of interest = GOI) giữa đoạn ngoại biên của T - DNA và một plasmid hỗ trợ có gen vir đảm nhiệm chức năng vận chuyển vào tế bào thực vật. Plasmid hỗ trợ được cải biến từ các Ti plasmid bình thường bằng cách loại bỏ gen kích thích tế bào thực vật phát triển thành khối nhưng vẫn duy trì khả năng thâm nhập vào tế bào thực vật [11], [19].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Đối với cây ngô, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu chuyển gen thông qua A.tumefaciens vào mô sẹo dạng I từ đoạn cây con, phôi non [30], [31], [34], [51], [52] và phôi từ mô sẹo [42]. Phôi ngô được sử dụng nhiều và cho hiệu quả chuyển nạp gen khá cao. Nghiên cứu chuyển gen thành công vào phôi non các dòng ngô A634, H99, W117 sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens với tỷ lệ thành công khoảng 15%, riêng dòng A188 cho tỷ lệ cao nhất 50% [34]. Wang và cs (2007) cũng chuyển vector pCABIA3301 mang gen glgC vào phôi non của dòng ngô Zong3, sau 3 thế hệ cho thấy hàm lượng tinh bột trong hạt đã tăng từ 13 đến 25% [52]. Vega và cs (2008) đã chuyển thành công vector pCABIA3301 và pZY101 vào phôi non dòng ngô Hi-II sử dụng vi khuẩn A.tumefaciens, tỷ lệ chuyển gen thành công trong nghiên cứu này vào khoảng 12%, cao nhất có dòng đạt được 18% [51]. Li và cs (2010) đã nghiên cứu chuyển gen Bt2 và Sh2 vào mô phân sinh cây ngô non của dòng ngô DH4866 sử dụng vi khuẩn A.tumefaciens đã đem lại hiệu quả khá cao, khoảng 10% các cây non xử lý được chuyển gen [38]. Năm 2012, Wang và cs đã sử dụng mô phân sinh chồi của hai dòng ngô cận giao Tian Tawu và 7922 để chuyển gen mã hóa phytoene synthase (psy) thông qua A.tumefsciens [53]. Phương pháp này làm giảm thời gian trong nuôi cấy mô truyền thống và đã chứng tỏ đây là phương pháp chuyển gen đơn giản.
Năm 2009, Kim và cs đã sử dụng phương pháp chuyển gen thông qua A.tumefaciens vào phôi non để tạo cây ngô chuyển gen kháng chất điệt cỏ [36].
Takava và cs (2010) đã chuyển vector pCABIA3301 vào 4 dòng ngô thuần S61, B73, Mo17, A188 và 2 dòng ngô lai HiIIB và HiIIC thông qua vi khuẩn A.tumefaciens LBA4404. Các tác giả đã lấy phôi có kích thước trung bình từ 1,5 đến 2 mm đồng nuôi cấy với vi khuẩn A.tumefaciens LBA4404
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
trong 72 giờ (3 ngày) và sử dụng MES, timentin và PPT để diệt và chọn lọc mẫu được gây nhiễm, tạo mô sẹo và tái sinh cây. Hai dòng S61 và A188 cho kết quả tái sinh cao nhất. PCR để phát hiện gen gus và bar trong hệ gen của cây tái sinh. Tần số xuất hiện hai gen này là 6,45% đối với dòng S61 [48].
Năm 2010, Anima và cs cũng chuyển hai vector pXBb7-SI-UBIL và pBbm42GW7_GUS vào phôi non của 3 dòng ngô TL26, CML216 và CML244 với môi trường đồng nuôi cấy có nồng độ cao hơn các nghiên cứu khác (200 µM acetosyringone) và cũng tạo ra được cây chuyển và và đời con lai của các dòng chuyển gen trên [22].
Ở Việt Nam hiện nay đã sử dụng rộng rãi phương pháp biến nạp gen vào vi khuẩn A.tumefaciens để chuyển vào cây trồng rất nhiều và đem lại các thành tựu đáng kể như: đã chuyển được gen cryIA kháng sâu xanh Heliothis armigera vào cây hông và cây cải ngọt thông qua vi khuẩn A.tumefaciens
EHA 105 đã chuyển được gen kháng thuốc diệt cỏ và kháng côn trùng chích hút vào cây thuốc lá nhờ vi khuẩn A.tumefaciens LBA 4404 [2], [3].
Các nghiên cứu về chuyển gen ngô nhờ vi khuẩn A.tumefaciens đã được thực hiện chủ yếu với mục đích kháng sâu bệnh và thuốc trừ cỏ. Theo báo cáo khoa học của Viện Di truyền nông nghiệp đã tạo được 6 dòng ngô GA35 mang gen nptII bằng phương pháp chuyển gen thông qua
A.tumefaciens [4]. Chưa có kết quả nghiên cứu nào về việc sử dụng kỹ thuật gen làm tăng năng suất ngô thông qua tăng chất lượng cũng như trữ lượng tinh bột. Phạm Thị Lý Thu (2007) đã nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh từ phôi non và xác định phương pháp chuyển gen thích hợp ở ngô ở hai dòng ngô HR8 và HR9, tác giả nhận định rằng chuyển gen bằng súng bắn gen có hiệu quả cao nhất đối với hai dòng ngô nghiên cứu [15].
Đinh Văn Trình và cs sử dụng A.tumefaciens EHA105 chứa vector
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Nhóm tác giả sử dụng râu ngô đã được cách ly tiếp xúc với dịch huyền phù vi khuẩn trước khi thụ phấn của cùng dòng. 135 bắp (13145 hạt thế hệ đầu tiên T0) đã thu được trong vụ đông xuân năm 2006 - 2007. Cây con chuyển gen giai đoạn 2 -3 lá được sàng lọc bằng điều kiện khô hạn. Phép thử tính kháng hygromycin và phân tích PCR trên 59 cây T0 sau xử lý hạn cho thấy hiệu quả chuyển gen ở thế hệ T0 đạt 0,023% [18].
Với việc áp dụng kĩ thuật chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens, Trương Thu Hằng đã chọn tạo thành công dòng ngô HR9 có mang gen kháng sâu CryIAc. Khi phân tích biểu hiện của gen kháng sâu (CryIAc) ở thế hệ T1, đã chỉ ra rằng trong số hơn 1500 cá thể thuộc 10 dòng HR9 thế hệ T0 mang gen CryIAc có khoảng hơn 100 cá thể thuộc 10 dòng T0 nói trên mang gen kháng sâu đục thân cao. Hiệu suất chuyển gen thông qua phôi được kiểm tra bằng phương pháp PCR đạt 0.22% [5].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chƣơng 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ
2.1.1. Vật liệu
2.1.1.1. Nguyên liệu thực vật
Hai LVN 99 và LVN 885 có do Viện Nghiên
cứu ngô cung cấp[8].
Bảng 2.1. Đặc điểm 2 giống ngô nghiên cứu
LVN 99 LVN 885
95 - 120 ngày 95 - 110 ngày
Năng suất 9 - 12 (tấn/ha) 8 - 10 (tấn/ha)
Tính chống chịu Chịu hạn khá, chống đổ tốt, ít nhiễm bệnh, độ đồng đều cao. Chịu hạn tốt, kháng bệnh, thích ứng rộng.
2.1.1.2. Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và vector chuyển gen
Chủng vi khuẩn A.tumefaciens mang plasmid tái tổ hợp pPhaso-Cys2
. Cặp mồi: CYS-F/R được thiết kế dựa trên sự phân tích trình tự gen
Cystatin2 của giống ngô được công bố tại GenBank - NCBI với mã số D38130:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bảng 2.2. Trình tự cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu
Mồi Trình tự Tm (ºC) % GC
CYS-F 5’- CAC CAT GCG CAA ACA TCG AAT CG -3’ 64,7 52,2 CYS-R 5’- TTA GGC GCT AGC ACC CTC TTC A -3’ 64 54,5
2.1.2. Hóa chất, thiết bị sử dụng
- Thiết bị: bao gồm box cấy vô trùng; nồi khử trùng; máy nước cất một lần,
hai lần; máy đo pH; máy đo OD; máy PCR; máy điện di; máy chụp ảnh gel; tủ ấm; tủ lắc; dàn nuôi cấy và một số dụng cụ, thiết bị và máy móc khác tại phòng thí nghiệm Sinh học, khoa Khoa học Sự sống, trường Đại học Khoa học.
- Hóa chất:
+ Môi trường cơ bản sử dụng để nuôi cấy mô tế bào phôi ngô là môi trường N6 và MS cơ bản có bổ sung kháng sinh và chất kích thích sinh trưởng (Phụ lục).
+ Môi trường sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn dùng cho thí nghiệm là môi trường nuôi cấy LB (Phụ lục).
+ Hormone sinh trưởng: BAP, kinetin, 2,4-D, NAA.
+ Các hóa chất khác: AgNO3, L-proline, casein hydrolysate, sucrose, glucose, acetosyringone.
+Kháng sinh: kanamycin, cefotaxim, rifamicin, spectinomycine ...
+ Những loại môi trường nuôi cấy được ký hiệu lần lượt từ H1 đến H6 là. H1: N6 + 2 mg/l 2,4-D , 10 mg/l AgNO3, 2,3 g/l L-proline, 100 mg/l casein hydrolysate, 20 mg/l sucrose, 10 g/l glucose, 100 µM acetosyringone
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
H2: N6 + 2 mg/l 2,4-D , 10 mg/l AgNO3, 2,3 g/l L-proline, 100 mg/l casein hydrolysate, 20 g/l sucrose, 10 g/l glucose, 500 mg/l cefotaxim, 50mg/l kanamycin.
H3: N6 + 3 mg/l 2,4-D , 20 mg/l AgNO3, 2,3 g/l L-proline, 100 mg/l casein hydrolysate, 20 g/l sucrose, 10 g/l glucose, 200 mg/l cefotaxim, 30mg/l kanamycin.
H4: N6 + 2 mg/l 2,4-D , 15 mg/l AgNO3, 1,15 g/l L-proline, 100 mg/l casein hydrolysate, 20 g/l sucrose, 10 g/l glucose
H5: MS + 2 mg/l BAP (hoặc kinetin) + 30 g/l đường sucrose H6: MS + 1 mg/l NAA+ 30 g đường sucrose.
+ Các cặp mồi sử dụng để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển nạp trong cây chuyển gen như ở bảng 2.2.
2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh học - khoa Khoa học Sự Sống - Trường Đại học Khoa Học - Đại học Thái Nguyên, Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào khoa Sinh học - Trường Đại học Sư Phạm Thái Nguyên.
Thời gian nghiên cứu từ 20/8/2013 đến 20/3/2015
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Trong quá trình nghiên cứu sử dụng các phương pháp thường quy của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật như khử trùng mẫu, tái sinh cây trực tiếp từ phôi non. Kỹ thuật chuyển gen bằng phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumefaciens theo nghiên cứu của Paz và cs (2009) [43]. Có một số cải tiến cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
2.2.1.
Đ
của hai giống ngô LVN 99, LVN 885
3/2015. Các cây ngô mẹ được treo thẻ đánh dấu giống và khi cây ra hoa, ụ phấ
các độ tuổi từ 5-15 ngày để làm thí nghiệm.
Hình 2.1. Cây ngô mẹ đƣợc trồng ngoài đồng ruộng
1
v 70%
70%
, gây tổn thương trên phôi ngô rồi ngâm trong môi trường ½ MS lỏng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
2.2.3. Tạo dịch huyền phù
Nuôi cấy tạo khuẩn lạc: Nuôi chủng vi khuẩn A.tumefaciens mang plasmid tái tổ hợp pPhaso-Cys2 trên môi trường LB đặc có bổ sung