3. Nội dung nghiên cứu
2.2.8. Đánh giá, phân tích kết quả chuyển gen
2.2.8.1. Phương pháp tách DNA từ cây ngô
Quy trình tách DNA tổng số từ lá cây ngô
Cân 200g mẫu lá cây và nghiền trong nitơ lỏng bằng cối, chày sứ cho đến khi thành dạng bột mịn, sau đó cho vào ống eppendorf 2ml.
Bổ sung thêm 700µl dung dịch đệm tách chiết DNA và trộn đều bằng cách đảo nhẹ.
Bảng 2.3. Thành phần dung dịch đệm tách chiết DNA
STT Thành phần Nồng độ
1 Tris- HCl, pH=8,0 0,1M
2 NaCl 1,4M
3 EDTA 0,02M
4 CTAB 4%
Ủ ở nhiệt độ 65°C khoảng 1 giờ (cứ 5 phút đảo nhẹ 1 lần).
Thêm 600µl dung dịch chloroform: isoamyl alcohol (24:1) đảo đều và để 5 phút ở nhiệt độ phòng.
Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000v/p ở 4°C, trong 15 phút. Dùng pipet hút lấy 500µl dịch nổi chuyển sang ống eppendorf 1,5ml.
Thêm 500µl isopropanol lạnh, để ở nhiệt độ khoảng -20°C, trong 30 phút.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Loại bỏ phần dịch nổi phía trên rửa DNA kết tủa dưới đáy ống bằng cồn 70% (1 lần). Ly tâm 13000v/p và làm khô DNA kết tủa ở đáy ống eppendorf.
Bổ sung 50µl nước khử ion và 2µl RNAse, ủ ở 37°C trong 30 phút.
2.2.8.2. PCR kiểm tra sự có mặt của gen biểu hiện
Chúng tôi tiến hành phản ứng PCR để kiểm tra sự có mặt của gen quan tâm với cặp mồi như trong bảng 2.2 với thành phần phản ứng theo bảng 2.4:
Bảng 2.4. Thành phần chạy phản ứng PCR nhân gen Cys2
ngô STT Thành phần Thể tích (µl) 1 H2O 12,5 2 Buffer (10X) 2,5 3 dNTP(25mM) 2,5 4 Mg2+(25mM) 2,5 5 CYS-F(10pM/µl) 1 6 CYS-R (10pM/µl) 1 7 Taq polymerase 1 8 DNA 2 Tổng thể tích 25
Bảng 2.5. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR nhân gen Cys2
Bước Phản ứng Nhiệt độ ( ºC) Thời gian Chu kì
1 Biến tính 95 4 phút 1
2 Biến tính 95 30 giây
35
3 Gắn mồi 58 30 giây
4 Kéo dài chuỗi 72 30 giây
5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Kết quả kiểm tra PCR bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
2.2.8.3. Phương pháp điện di trên gel agarose
Quy trình: Hòa tan agarose 0,8% để nhiệt độ hạ xuống khoảng 50- 600C. Đổ dung dịch vào khay gel có cài sẵn răng lược thích hợp, trong quá trình đổ hạn chế tạo bọt khí. Sau 30-60 phút, khi gel đó đông cứng, tháo răng lược, đặt khay gel vào bể điện di. Đổ đệm TAE 1X ngập cách mặt gel một khoảng 2mm
Lấy 8µl DNA trộn cùng với 2µl đệm tra mẫu (Loading dye 6X), tra mẫu vào các giếng trên bản gel. Tiến hành điện di với hiệu điện thế 100v, cường độ dòng điện vào khoảng 60-80mA. Theo dõi sự di chuyển của vệt màu bromophenol blue để ngừng thời gian phù hợp (sau khoảng 30 phút).
Gel sau khi chạy điện di được ngâm trong dung dịch EtBr 5 đến 10 phút. Sau đó gel được chuyển sang máy UV để soi gel. Gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại, DNA được hiện lên dưới dạng các vạch sáng, ảnh điện di được chụp trên máy Bio-Rad với tia UV có bước sóng 312 -365nm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN