xây dựng quy trình chuyển gen gus vào giống sắn km 94 thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

Mục đích sử dụng sắn khác nhau ở các vùng, ở Châu Phi, sắn được sử dụng chủ yếu làm lương thực, trong khi đó ở Thái Lan, một nửa sản lượng 20 triệu tấn sắn hàng năm được sử dụng cho công

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY BẮC

TRỊNH THỊ THƯƠNG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN GUS VÀO GIỐNG SẮN KM 94 THÔNG QUA VI KHUẨN

AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Sơn La, năm 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY BẮC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Người hướng dẫn: ThS Đỗ Hải Lan

Sơn La, năm 2014

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô Đỗ Hải Lan người trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ và truyền thụ những kiến thức, kinh nghiệm cho em trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận

Em xin cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa Sinh – Hóa , các thầy, cô giáo phòng thực hành Di truyền – Thực vật đã tạo điều kiện cho chúng em về cơ sở vật chất, trang thiết bị

Em xin chân thành cảm ơn Phòng KHCN – HTQT - Trường Đại học Tây Bắc đã giúp đỡ, ủng hộ nhiệt tình cho tôi trong suốt thời gian qua

Cuối cùng, em xin gửi lời tri ân tới tất cả những người thân trong gia đình cùng toàn thể bạn bè đã hết lòng quan tâm, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn!

Sơn La, tháng 05 năm 2014 Sinh viên thực hiện

Trịnh Thị Thương

KÝ HIỆU VIẾT TẮT

AS : Acetosyringone (3,5-dimethoxy-4-hydrroxy Acetophenone)

A tumefaciens: Agrobacterium tumefaciens

BAP : 6-benzylaminopurin

CIAT: Centro Internacional de Agricultura Tropical

DNA : Deoxiribonucleic Acid

FAO : Food and Agriculture Organization

Gus : β-1,4-Glucuronidase

MS : Murashige and Skoog, 1962

OD: Optical density

Ti-plasmid : Tumor-Inclucing Plasmid

T-DNA : Transfer-DNA

Vir : Virulence

VTM: Vitamin

X-gluc : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu đề tài 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Đối tượng và thời gian nghiên cứu 2

4.1 Đối tượng nghiên cứu 2

4.2 Thời gian nghiên cứu 2

5 Địa điểm và phạm vi nghiên cứu 2

5.1 Địa điểm 2

5.2 Phạm vi nghiên cứu 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về cây sắn 3

1.1.1 Nguồn gốc 3

1.1.2 Vị trí phân loại 3

1.1.3 Tính đa dạng và phân bố 3

1.1.4 Giá trị của cây sắn 4

1.1.5 Tình hình sản xuất sắn trên thế giới và Việt Nam 5

1.1.5.1 Tình hình sản xuất sắn trên thế giới 5

1.1.5.2 Tình hình sản xuất sắn ở Việt Nam 7

1.2 Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của đề tài ở trong và ngoài nước 8

1.2.1 Trên thế giới 8

1.2.2 Ở Việt Nam 10

1.3 Vi khuẩn A.tumefaciens và hiện tượng biến nạp gen ở thực vật 10

1.3.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn A tumefaciens 11

1.3.2 Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid 12

1.3.3 Cấu trúc và chức năng của T-ADN 13

1.3.4 Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A tumefaciens 13

1.4 Gen chỉ thị chọn lọc 14

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Vật liệu 16

2.1.1 Vật liệu thực vật 16

2.1.2 Vi khuẩn 16

2.2 Hóa chất, thiết bị và môi trường nuôi cấy 16

2.2.1 Hóa chất 16

2.2.2 Thiết bị 16

2.2.3 Môi trường sử dụng nuôi cấy mẫu 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.2 Tạo vật liệu chuyển gen 17

2.3.3 Các bước chuyển gen 19

2.3.4 Phương pháp xác định hiệu quả chuyển gen bằng nhuộm hóa tế bào 21

2.4 Xây dựng các công thức thí nghiệm 22

2.5 Xác định chỉ tiêu cho mỗi công thức 22

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 23

1 Biến nạp vi khuẩn mang gen Gus vào mảnh lá chưa trưởng thành của giống sắn KM 94 23

2 Biến nạp vi khuẩn mang gen Gus vào đoạn thân non của giống sắn KM 94 26

3 Biến nạp vi khuẩn mang gen Gus vào mảnh lá mầm của giống sắn KM94 29

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34

1 Kết luận 34

2 Kiến nghị 34

TÀI LIỆU THAM KHẢO 35

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 Thành phần môi trường MS (Murashige và Skoog) 16 Bảng 2 Thành phần của môi trường sử dụng nuôi cấy mẫu 17 Bảng 3 Tỉ lệ tạo mô sẹo của mảnh lá chưa trưởng thànhgiống sắn KM 94 23 Bảng 4 Tỉ lệ mẫu bắt màu nhuộm Gus của mảnh lá chưa trưởng thành giống sắn

KM 94 25 Bảng 5 Tỉ lệ tạo mô sẹo của đoạn thân non giống sắn KM 94 27 Bảng 6 Tỉ lệ mẫu bắt màu nhuộm Gus của đoạn thân non giống sắn KM 94 28 Bảng 7 Tỉ lệ tạo mô sẹo của mảnh lá mầm giống sắn KM 94 30 Bảng 8 Tỉ lệ mẫu bắt màu nhộm Gus của mảnh lá mầm giống sắn KM 94 31

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 Ti-Plasmid 12

Hình 2 Mảnh lá chưa trưởng thành và đoạn thân đặt trên môi trường tạo mô sẹo 18

Hình 4 Mảnh lá non chưa trưởng thànhcủa giống sắn KM 94 cảm ứng tạo mô sẹo 23

Hình 5 Mô sẹo của mảnh lá chưa trưởng thành có mặt gen Gus 25

Hình 6 Đoạn thân non giống sắn KM 94 cảm ứng tạo mô sẹo 26

Hình 7 Mô sẹo của đoạn thân non giống sắn KM 94 có mặt gen Gus 28

Hình 8 Mảnh lá mầm giống sắn KM 94 cảm ứng tạo mô sẹo 29

Hình 9 Mô sẹo mảnh lá mầm của giống sắn KM 94 có mặt gen Gus 31

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Sắn (Manihot esculenta Crantz) là cây có củ được trồng ở vùng cận nhiệt

đới của Châu Phi, Châu Á và Mỹ Latin, đáp ứng nhu cầu cho 500 triệu người

Củ có hàm lượng chất khô chiếm 20% trong đó 80% là tinh bột Mục đích sử dụng sắn khác nhau ở các vùng, ở Châu Phi, sắn được sử dụng chủ yếu làm lương thực, trong khi đó ở Thái Lan, một nửa sản lượng 20 triệu tấn sắn hàng năm được sử dụng cho công nghiệp tinh bột Với sự phát triển kinh tế, lượng tinh bột cần cho công nghiệp tăng lên ở các quốc gia đang phát triển Mặc dù các nước nhiệt đới có nguồn tinh bột sắn (hoặc khoai tây, củ cải), nhưng vẫn phải nhập khẩu tinh bột ngô đắt đỏ Để đủ lượng tinh bột sử dụng, tinh bột phải được biến đổi theo nhiều cách khác nhau Nếu tinh bột sắn với những đặc tính mong muốn được tạo ra, đây sẽ là nguồn tinh bột cạnh tranh với các nguồn tinh bột khác, người nông dân có thể trồng sắn để tăng thu nhập [27]

Trên thực tế, lai giống truyền thống khó có khả năng cung cấp giải pháp toàn diện để cải thiện cây trồng cho phù hợp với nhu cầu của người nông dân và sản xuất thương mại khác nhau ở vùng nhiệt đới Việc áp dụng công nghệ biến đổi gen để đưa những tính trạng nông dân mong muốn vào giống cây trồng tạo ra dòng

ưu tú có năng suất cao, có hàm lượng tinh bột cao nhằm đáp ứng giải quyết các vấn

đề thực tiễn cũng như khoa học là hết sức cần thiết, đặc biệt trong sản xuất nhiên liệu sinh học, hàm lượng tinh bột được đánh giá cao hơn năng suất [24]

KM 94 là một trong những giống sắn chủ lực ở Việt Nam do năng suất và hàm lượng tinh bột ổn định và cao hơn các giống mới, được lựa chọn làm đối

tượng chuyển gen Trong đó gen chỉ thị Gus thường được sử dụng để đánh giá

hiệu quả của một quy trình chuyển gen trước khi tiến hành chuyển các gen đích mong muốn Do vậy để tạo tiền đề cho những nghiên cứu tạo ra giống sắn mang gen đích mong muốn và đạt kết quả cao cần phải xây dựng một quy trình chuyển gen hoàn chỉnh

Xuất phát từ thực tế đó, tôi tiến hành thực hiện đề tài “Xây dựng quy

trình chuyển gen Gus vào giống sắn KM 94 thông qua vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens”

2 Mục tiêu đề tài

Xây dựng được quy trình chuyển gen Gus vào giống sắn KM 94 thông qua

vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

3 Nội dung nghiên cứu

- Tạo nguyên liệu chuyển gen: nhân nhanh giống sắn KM 94

- Tiến hành quá trình biến nạp vi khuẩn A Tumefaciens và nuôi cấy mẫu

của giống sắn KM 94

- Kiểm tra và xác định hiệu quả chuyển gen

4 Đối tƣợng và thời gian nghiên cứu

4.1 Đối tƣợng nghiên cứu

Quy trình chuyển gen Gus vào giống sắn KM 94 thông qua vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens

4.2 Thời gian nghiên cứu

Khóa luận được thực hiện từ tháng 9/2013 đến 5/2014, chia làm các giai đoạn:

- Trong tháng 9/2013: Thu thập thông tin liên quan đến khóa luận

- Từ tháng 10/2013 – 4/2014: Tiến hành biến nạp gen Gus, nuôi cấy mẫu của giống sắn KM 94 và kiểm tra sự có mặt của gen Gus

- Tháng 5/2014: Viết và bảo vệ khóa luận

5 Địa điểm và phạm vi nghiên cứu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về cây sắn

1.1.1 Nguồn gốc

Lịch sử tiến hóa của cây sắn cũng như các cây có củ khác là rất khó xác định được chính xác nguồn gốc phát sinh Vì những di chỉ khảo cổ còn lại đối với các bộ phận của cây có bột rất hiếm hoi Qua rất nhiều tranh cãi thì gần đây nhiều tác giả kết luận: Cây sắn có nguồn gốc phức tạp và có 4 trung tâm phát sinh là ở Braxin có 2 trung tâm và còn lại là ở Mêhicô và Bolivia Sắn được trồng cách đây khoảng 3000 – 7000 năm [9]

1.1.2 Vị trí phân loại

Sắn hay khoai mì có tên khoa học là Manihot esculenta Crantz thuộc

ngành Magnoliophyta, lớp Magnoliopsida, bộ Tricorceae, họ Euphorbiaceae, chi Manihot Sắn có số lượng nhiễm sắc thể 2n = 36 là loại cây mang lại giá trị kinh

tế cũng như giá trị dinh dưỡng cao

núi Giống ít bị nhiễm bệnh cháy lá, củ đồng đều, thịt củ màu trắng, năng suất củ tươi: 33,0 tấn/ha, hàm lượng tinh bột 28,7%, thời gian thu hoạch 9-11 tháng

Giống sắn KM 94 là giống sắn được trồng phổ biến nhất trên phạm vi toàn quốc Điển hình là Tây Ninh và Đồng Nai đã áp dụng giống KM 94 với diện tích hàng trăm ha/hộ, đạt năng suất trên 30 tấn/ha [9]

1.1.4 Giá trị của cây sắn

Cây sắn có giá trị kinh tế lớn về nhiều mặt Sắn là nguồn lương thực đáng

kể cho con người, là nguồn thức ăn dồi dào cho chăn nuôi, nguồn nguyên liệu cho công nghiệp Tất cả các bộ phận của cây sắn đều có thể sử dụng vào mục đích kinh tế

 Thành phần hóa học chính của củ sắn là gluxit, ở củ sắn tươi có tỷ lệ các

chất khoáng và vitamin khá cao đặc biệt là canxi Tuy nhiên, sắn có tỷ lệ protein và lipit thấp, vì vậy khi sử dụng sắn làm lương thực phải bổ sung thêm thức ăn giàu đạm và lipit mới cung cấp đủ năng lượng cho cơ thể

 Sử dụng sắn làm lương thực: Thực tế ở nhiều vùng trên thế giới đã coi sắn

và các sản phẩm từ sắn là nguồn lương thực chính, đặc biệt là các nước Châu Phi Sắn đứng vị trí thư tư trên thế giới về mặt cung cấp năng lượng cho con người Trong thập kỉ 20, có khoảng 450-500 triệu người ở 26 nước nhiệt đới sử dụng nguồn năng lượng tứ sắn tới 300 kcal/ngày Từ sau năm 1991, đặc biệt từ năm 1996 đến nay nhờ sự tiến bộ trong công tác nghiên cứu tuyển chọn giống sắn mới và khuyến nông sắn, với việc giới thiệu giống sắn mới KM 60, KM 94 vào sản xuất đã tạo ra bước đột phá trong nghề trồng sắn ở Việt Nam cùng với việc đưa 42 nhà máy chế biến tinh bột sắn vào hoạt động, đã đánh dấu sự chuyển dịch vị trí cây sắn từ cây lương thực thành cây trồng hàng hóa [9]

 Sử dụng sắn làm thức ăn gia súc: Bên cạnh sử dụng lương thực và chế biến

tinh bột phục vụ cho các ngành công nghiệp, sắn còn là nguồn thức ăn cho gia súc Ở nước ta, sắn là nguồn thức ăn quan trọng trong chăn nuôi của các hộ gia đình Trong những năm gần đây, bên cạnh phối hợp sắn vào khẩu phần thức ăn hỗn hợp trong công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, việc nghiên cứu ủ chua sắn

củ tươi phục vụ chăn nuôi lợn quy mô gia đình đã được chú ý và đã xây dựng

thành quy trình kỹ thuật đang được nhiều hộ gia đình áp dụng vào chăn nuôi lợn ở khu vực miền Trung

 Chế biến tinh bột từ củ sắn: Củ sắn là nguyên liệu chế biến tinh bột và tinh bột biến tính Trong đó Châu Á là lục địa chế biến và xuất khẩu đứng đầu thế giới

 Sử dụng lá sắn: Lá sắn có chứa nhiều chất dinh dưỡng Lá sắn ngọt là một loại rau đối với Châu Phi, lá sắn được bó thành bó bán ở chợ như một loại rau Ở Việt Nam, nhân dân ta dùng lá sắn non để luộc ăn hoặc muối chua [9]

1.1.5 Tình hình sản xuất sắn trên thế giới và Việt Nam

1.1.5.1 Tình hình sản xuất sắn trên thế giới

Sản lượng sắn thế giới năm 2006/07 đạt 226,34 triệu tấn củ tươi so với 2005/06 là 211,26 triệu tấn và 1961 là 71,26 triệu tấn Nước có sản lượng sắn nhiều nhất thế giới là Nigeria (45,72 triệu tấn), kế đến là Thái Lan (22,58 triệu tấn) và Indonesia (19,92 triệu tấn) Việt Nam đứng thứ mười trên thế giới về sản lượng sắn (7,71 triệu tấn) Nước có năng suất sắn cao nhất hiện nay là Ấn Độ (31,43 tấn/ha), kế đến là Thái Lan (21,09 tấn/ha), so với năng suất sắn bình quân của thế giới là 12,16 tấn/ha (FAO, 2008)

Trên thế giới, sắn được trồng bởi những hộ nông dân sản xuất nhỏ để làm lương thực- thực phẩm, thức ăn gia súc và để bán Sắn chủ yếu trồng trên đất nghèo và dùng kỹ thuật canh tác truyền thống Mức tiêu thụ sắn bình quân toàn thế giới khoảng 18 kg/người/năm Sản lượng sắn của thế giới được tiêu dùng trong nước khoảng 85% (lương thực 58%, thức ăn gia súc 28%, chế biến công nghiệp 3%, hao hụt 11 %), còn lại 15% (gần 30 triệu tấn) được xuất khẩu dưới dạng sắn lát khô, sắn viên và tinh bột (CIAT, 1993) Nhu cầu sắn làm thức ăn gia súc trên toàn cầu đang giữ mức độ ổn định trong năm 2006 (FAO, 2007) Sắn chiếm tỷ trọng cao trong cơ cấu lương thực ở châu Phi, bình quân khoảng

96 kg/người/năm Zaire là nước sử dụng sắn nhiếu nhất với 391 kg/người/năm (hoặc 1123 calori/ngày) Nhu cầu sắn làm lương thực chủ yếu tại vùng Saharan châu Phi cả hai dạng củ tươi và sản phẩm chế biến ước tính khoảng 115 triệu tấn, tăng hơn năm 2005 khoảng 1 triệu tấn Buôn bán sắn trên thế giới năm 2006 ước đạt 6,9 triệu tấn sản phẩm, tăng 11% so với năm 2005 (6,2 triệu tấn), giảm

14,8% so với năm 2004 (8,1 triệu tấn) Trong đó tinh bột sắn (starch) và bột sắn (flour) chiếm 3,5 triệu tấn, sắn lát (chips) và sắn viên (pellets) 3,4 triệu tấn [9]

Trung Quốc hiện là nước nhập khẩu sắn nhiều nhất thế giới để làm cồn sinh học (bio ethanol), tinh bột biến tính (modify starch), thức ăn gia súc và dùng trong công nghiệp thực phẩm dược liệu Địa điểm chính tại tỉnh Quảng Tây Năm 2005, Trung Quốc đã nhập khẩu 1,03 triệu tấn tinh bột, bột sắn và 3,03 triệu tấn sắn lát, sắn viên Năm 2006, Trung Quốc đã nhập khẩu 1,15 triệu tấn tinh bột, bột sắn và 3,40 triệu tấn sắn lát và sắn viên Thái Lan chiếm trên 85% lượng xuất khẩu sắn toàn cầu, kế đến là Indonesia và Việt Nam Thị trường xuất khẩu sắn chủ yếu của Thái Lan là Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản và cộng đồng châu Âu với tỷ trọng xuất khẩu sắn khoảng 40% bột và tinh bột sắn, 25% là sắn lát và sắn viên (TTTA, 2006; FAO, 2007) Năm 2006 được coi là năm có giá sắn cao đối với cả bột, tinh bột và sắn lát Việc xuất khẩu sắn làm thức ăn gia súc sang các nước cộng đồng châu Âu hiện đã giảm sút nhưng giá sắn năm 2006 vẫn được duy trì ở mức cao do có thị trường lớn tại Trung Quốc

và Nhật Bản [9]

Viện Nghiên cứu Chính sách lương thực thế giới (IFPRI), đã tính toán nhiều mặt và dự báo tình hình sản xuất và tiêu thụ sắn toàn cầu với tầm nhìn đến năm 2020 Năm 2020 sản lượng sắn toàn cầu ước đạt 275,10 triệu tấn, trong đó sản xuất sắn chủ yếu ở các nước đang phát triển là 274,7 triệu tấn, các nước đã phát triển khoảng 0,40 triệu tấn Mức tiêu thụ sắn ở các nước đang phát triển dự báo đạt 254,60 triệu tấn so với các nước đã phát triển là 20,5 triệu tấn Khối lượng sản phẩm sắn toàn cầu sử dụng làm lương thực thực phẩm dự báo nhu cầu

là 176,3 triệu tấn và thức ăn gia súc 53,4 triệu tấn Tốc độ tăng hàng năm của nhu cầu sử dụng sản phẩm sắn làm lương thực, thực phẩm và thức ăn gia súc đạt tương ứng là 1,98% và 0,95% Châu Phi vẫn là khu vực dẫn đầu sản lượng sắn toàn cầu với dự báo sản lượng năm 2020 sẽ đạt 168,6 triệu tấn Trong đó, khối lượng sản phẩm sử dụng làm lương thực thực phẩm là 77,2%, làm thức ăn gia súc là 4,4% Châu Mỹ La tinh giai đoạn 1993-2020, ước tốc độ tiêu thụ sản phẩm sắn tăng hàng năm là 1,3%, so với châu Phi là 2,44% và châu Á là 0,84 -

0,96% Cây sắn tiếp tục giữ vai trò quan trọng trong nhiều nước châu Á, đặc biệt

là các nước vùng Đông Nam Á nơi cây sắn có tổng diện tích đứng thứ ba sau lúa

và ngô và tổng sản lượng đứng thứ ba sau lúa và mía Chiều hướng sản xuất sắn phụ thuộc vào khả năng cạnh tranh cây trồng Giải pháp chính là tăng năng suất sắn bằng cách áp dụng giống mới và các biện pháp kỹ thuật tiến bộ [9]

1.1.5.2 Tình hình sản xuất sắn ở Việt Nam

Ở Việt Nam, sắn là cây lương thực, thức ăn gia súc quan trọng sau lúa và ngô Năm 2005, cây sắn có diện tích thu hoạch 432 nghìn ha, năng suất 15,35 tấn/ha, sản lượng 6,6 triệu tấn, so với cây lúa có diện tích 7.326 ha, năng suất 4,88 tấn/ha, sản lượng 35,8 triệu tấn, cây ngô có diện tích 995 ha, năng suất 3,51 tấn/ha, sản lượng gần một triệu tấn (FAO, 2007) Cây sắn là nguồn thu nhập quan trọng của các hộ nông dân nghèo do sắn dễ trồng, ít kén đất, ít vốn đầu tư, phù hợp sinh thái và điều kiện kinh tế nông hộ Sắn chủ yếu dùng để bán (48,6%) kế đến dùng làm thức ăn gia súc (22,4%), chế biến thủ công (16,8%), chỉ có 12,2% dùng tiêu thụ tươi [9]

Sắn cũng là cây công nghiệp có giá trị xuất khẩu và tiêu thụ trong nước Sắn là nguyên liệu chính để chế biến bột ngọt, mì ăn liền, bánh kẹo, siro, nước giải khát, bao bì, ván ép, phụ gia dược phẩm, màng phủ sinh học và chất giữ

ẩm cho đất Toàn quốc hiện có trên 60 nhà máy chế biến tinh bột sắn với tổng công suất khoảng 3,8 triệu tấn củ tươi/năm và nhiều cơ sở chế biến sắn thủ công rãi rác tại hầu hết các tỉnh trồng sắn Việt Nam hiện sản xuất mỗi năm khoảng 800.000 – 1.200.000 tấn tinh bột sắn, trong đó trên 70% xuất khẩu và gần 30% tiêu thụ trong nước Sản phẩm sắn xuất khẩu của Việt Nam chủ yếu là tinh bột, sắn lát và bột sắn Thị trường chính là Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản, Singapo, Hàn Quốc Đầu tư nhà máy chế biến bio- etanol là một hướng lớn triển vọng [9]

Sản xuất lương thực là ngành trọng tâm và có thế mạnh của Việt Nam tầm nhìn đến năm 2.020 Chính phủ Việt Nam chủ trương đẩy mạnh sản xuất lúa, ngô và coi trọng việc sản xuất sắn, khoai lang ở những vùng, những vụ có điều kiện phát triển Thị trường xuất khẩu sắn lát và tinh bột sắn Việt Nam dự

báo thuận lợi và có lợi thế cạnh tranh cao do có nhu cầu cao về chế biến bioethanol, bột ngọt, thức ăn gia súc và những sản phẩm tinh bột biến tính Diện tích sắn của Việt Nam dự kiến ổn định khoảng 450 nghìn ha nhưng sẽ tăng năng suất và sản lượng sắn bằng cách chọn tạo và phát triển các giống sắn tốt có năng suất củ tươi và hàm lượng tinh bột cao, xây dựng và hoàn thiện quy trình kỹ thuật canh tác sắn bền vững và thích hợp vùng sinh thái [9]

1.2 Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của đề tài ở trong và ngoài nước

Trên thực tế, khả năng chuyển vật liệu di truyền mới vào hệ gen cây sắn theo cách này là cần thiết Sau một thời gian phát triển công nghệ trong những năm 1990 đã có tiến bộ đáng kể ở lĩnh vực tạo cây sắn biến đổi gen để tăng cường giá trị cho người sản xuất và người tiêu dùng Mọi nỗ lực hướng vào tích hợp những đặc điểm nông dân mong muốn vào giống cây dành cho thương mại trong tương lai Công nghệ biến đổi gen có đầy đủ tiềm năng đưa cây sắn trở thành cây lương thực và hàng hóa trong thế kỷ 21 [24]

Là một trong số ít các cây lương thực chính không trồng trong các quốc gia công nghiệp hóa, tầm quan trọng của sắn không rõ hoặc được đánh giá không đúng Tuy nhiên, sắn đóng một vai trò quan trọng trong cung cấp thực phẩm và đảm bảo an ninh kinh tế của những quốc gia thiếu lương thực và kém phát triển nhất trên thế giới Hiện nay, hơn 600 triệu người tiêu thụ sản phẩm

sản xuất từ sắn hàng ngày, chỉ sau lúa và ngô, là nguồn năng lượng quan trọng trong chế độ ăn uống của người dân vùng nhiệt đới Sản xuất dự kiến sẽ tăng 60% vào năm 2020 để đáp ứng nhu cầu của dân số ngày càng tăng trong các khu vực này [24]

Thiếu đầu tư vào nghiên cứu về sắn và giai đoạn phát triển những năm

1980 đã dẫn đến một phần đáng kể năng suất sắn chưa được khai thác, được chứng minh bằng sản lượng tiềm năng có thể là 80 - 100 tấn trọng lượng tươi của rễ trên mỗi ha trong khi sản lượng trung bình trên thế giới là 10,7 tấn/ ha và 8,9 t/ha ở châu Phi (FAO) Mở khóa tiềm năng di truyền này để tăng sản lượng

và cải thiện các tính trạng như tinh bột và chất lượng dinh dưỡng, đặc tính sau thu hoạch và giảm hàm lượng cyanogen (HCN) đã trở thành tâm điểm của chương trình cải thiện [24]

Công nghệ biến đổi gen cho phép những tính trạng có lợi được chuyển từ một giống sắn này tới giống sắn khác và từ họ hàng hoang dại, vượt qua ranh giới loài và các vấn đề về thụ phấn chéo và giao phối cận huyết Ngoài ra, chuyển vật chất di truyền từ các nguồn ngoại lai như virus cho chiến lược kháng tác nhân gây bệnh, và gene vi khuẩn kháng sâu có thể được phát triển và triển khai mang lại lợi nhuận cho nông dân trồng sắn Công nghệ chuyển gene ở sắn cũng như các loại cây trồng khác, hệ thống biến đổi gen trong sắn phụ thuộc vào khả năng tạo các tế bào toàn năng và mô của hệ thống nuôi cấy mô Đây là mục tiêu cho chuyển gene, sau khi chọn lọc thành công tái sinh cây chuyển gene hoàn chỉnh [20] Ở sắn, không hệ thống tái sinh nào tái sinh được cây từ mô trưởng thành Tuy nhiên, nghiên cứu ban đầu đã xác định rằng phôi soma có thể được cảm ứng và cây được tạo ra từ mẫu lá chưa hoàn chỉnh trên môi trường Murashige và Skoog (1962) bổ sung auxin Cây tái sinh theo cách này là dạng

vô tính của vật liệu gốc trưởng thành, giữ nguyên tất cả các tính trạng của các tế bào mầm có được Những cấu trúc phôi đa bào và phôi thứ cấp có thể được tạo

ra từ các tế bào mầm, đã được sử dụng làm mục tiêu cho chuyển gen khi chương trình kỹ thuật di truyền của sắn được bắt đầu vào đầu những năm 1990 Sau một thời gian thất bại, đã có bằng chứng cho việc tạo phôi và thực vật chuyển gen

lần đầu tiên được đưa ra vào năm 1994 Tiếp theo là bước đột phá trong tái sinh cây từ hệ thống phôi, dẫn đến phục hồi xác nhận cây sắn biến đổi gen biểu hiện

uidA và gen chỉ thị luciferine [24]

Có rất nhiều công trình chuyển gen thành công trên các giống cây trồng

như: đậu tương, ngô, lúa, bông, cà chua nhờ vi khuẩn Agrobacterium Tuy

nhiên, ở Việt Nam chưa có một công trình chuyển gen thành công nào ở sắn

thông qua vi khuẩn Agrobacterium được công bố mà chỉ có một công trình

chuyển gen bằng phương pháp bắn gen được công bố như:

+ Xây dựng quy trình biến nạp gen bar – gen kháng thuốc diệt cỏ vào cây khoai

mì bằng phương pháp bắn gen

Trước khi tiến hành chuyển gen, cần nghiên cứu hệ thống tái sinh làm cơ

sở để tái sinh cây sau khi chọn lọc Hiện nay đã có một số công trình liên quan được công bố như:

+ Nghiên cứu khả năng tái sinh và tiếp nhận gencủa một số giống sắn (Manihot

esculenta Cantz) Việt Nam

+ Nghiên cứ u hệ thống tái sinh cây sắn (Manihot esculenta Crantz) qua phôi soma

từ đỉnh chồi

1.3 Vi khuẩn A.tumefaciens và hiện tƣợng biến nạp gen ở thực vật

Hiện nay, có rất nhiều các phương pháp chuyển gen vào thực vật khác nhau như sử dụng súng bắn gen, dùng xung điện, dùng vi tiêm, chuyển gen thông qua con đường ống phấn,… Tuy nhiên, phương pháp chuyển gen gián

tiếp nhờ vi khuẩn A.tumefaciens là phương pháp được sử dụng phổ biến hiện nay Phương pháp này được sử dụng trong khóa luận này để chuyển gen Gus

vào cây sắn

1.3.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn A tumefaciens

A.tumefaciens là loài vi khuẩn sống trong đất gây ra bệnh khối u hình

chóp ở các vị trí tổn thương của thực vật Hai lá mầm Chỉ rất ít thực vật Một lá

mầm thuộc họ Liliaceae và Amaryllidaceae là dễ bị bệnh khối u hình chóp Sự

sinh trưởng khối u có thể tiếp diễn khi vắng mặt vi khuẩn và mô khối u có thể được sinh trưởng vô trùng bằng nuôi cấy mô trong các môi trường thiếu sự bổ xung auxin và cytokinie ngoại sinh mà bình thường là cần thiết để xúc tiến sự

sinh trưởng của mô thực vật in vitro Mô khối u tổng hợp amino acid và các dẫn

xuất của đường được biết chung là opine Loại opine tổng hợp trong khối u (ví

dụ như nopaline, octopine, agrocinopine, mannopine và agropine) phụ thuộc vào

dòng Agrobacterium khởi đầu sự hình thành khối u Octopine và nopaline là hai

loại opine có nguồn gốc từ arginine và dễ dàng phát hiện nhất trong mô khối u

hình chóp Do đó nhiều dòng A tumefaciens phổ biến được thiết kế theo kiểu

octopine hoặc nopaline [5]

A tumefaciens có khả năng xâm nhiễm tế bào thực vật bằng cách

chuyển một đoạn ADN của nó vào tế bào thực vật Khi ADN vi khuẩn được hợp nhất với nhiễm sắc thể thực vật, nó sẽ tấn công vào hệ thống tổ chức của

tế bào một cách có hiệu quả và sử dụng nó để đảm bảo cho sự sinh sổi của quần thể vi khuẩn

Để khai thác và sử dụng A.tumefaciens như là một vector chuyển gen các

nhà khoa học đã loại bỏ các gen gây khối u và gen mã hóa opine của T-ADN và thay thế vào đó là các marker chọn lọc, trong khi vẫn duy trì các vùng bờ phải

và bờ trái của T-ADN và các gen vir Gen chuyển được xen vào giữa các vùng

bờ của T-ADN Nó sẽ được chuyển vào tế bào và trở nên hợp nhất với nhiễm sắc thể tế bào thực vật [5]

Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ A tumefaciens đã được kiểm tra

đối với sự xâm nhập bền vững, sự biểu hiện và sự di truyền của các gen chuyển đặc biệt Tuy nhiên, một vài yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp

là loại mô được biến nạp, giai đoạn phát triển của mô, mức khởi đầu của vi

khuẩn A tumefaciens sử dụng, môi trường để nuôi cấy mô sau khi biến nạp,

marker được sử dụng để chọn lọc thể biến nạp, loại vector sử dụng và kiểu gen của thực vật [5]

1.3.2 Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid

Ti-plasmid là các vòng DNA tự do sinh sản độc lập Ở vi khuẩn, plasmid liên quan tới yếu tố giới tính của tế bào, đến khả năng chống chịu các loại kháng sinh,… Đặc điểm quan trọng của plasmid là chúng có thể liên kết vào nhiễm sắc thể nhưng cũng có thể tồn tại bên ngoài nhiễm sắc thể một cách độc lập

u trong khi hai vùng khác liên quan đến sự tiếp hợp và sự tái bản của plasmid

trong A Tumefaciens [5]

Trong khi hình thành khối u, T-ADN được chuyển vào tế bào thực vật và hợp nhất với genome nhân T-ADN ổn định trong genome nhân Lai Ti-plasmid với ADN của khối u đã cho thấy T-ADN trong tế bào thực vật là tương ứng song

song với T-ADN trong Ti-plasmid của A tumefaciens Kết quả này chứng tỏ không

có sự sắp xếp lại vị trí của T-ADN trong lúc khối u được tạo thành Một hoặc nhiều bản sao của T-ADN có thể có mặt ở các đoạn lặp nối tiếp Chúng cũng có thể tách

ra và liên kết với các vùng khác nhau của ADN thực vật Vị trí hợp nhất của ADN vào ADN thực vật là tương đồng [5]

T-1.3.3 Cấu trúc và chức năng của T-ADN

T-ADN là một đoạn ADN có kích thước 25 kb, trong đó chứa gen mã hóa cho sinh tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen gây khối u Trong Ti-plasmid, vị trí của T-ADN được giới hạn bằng bờ phải (RB- Right Border) và

bờ trái (LB-Left Border) Ngoài T-ADN, trên Ti-plasmid còn có các vùng ADN

mã hóa cho việc tái sinh plasmid, cho khả năng lấy nhiễm và tiếp hợp (vùng

vir), cho việc tiêu hóa opine

Ở Ti-plasmid dạng nopalin, T-ADN xâm nhập vào genom thực vật ở dạng một đoạn liên tục dài 22 kb Trong khi ở Ti-plasmid dạng octopine, T-ADN là một đoạn gen liên tục dài 13 kb T-ADN mang rất nhiều gen như: (1) Các gen

mã hoá những enzyme cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp opine; (2) Các gen

gây khối u như tms1, tms2, tmsr mã hoá cho các enzyme liên quan đến quá trình

sinh tổng hợp auxin và cytokinine

Trong các vùng ADN của Ti-plasmid, ngoài T-ADN được nghiên cứu

nhiều hơn cả là vùng ADN phụ trách khả năng lây nhiễm còn gọi là vùng vir Sản phẩm hoạt động của các gen nằm trong vùng vir dưới tác động kích thích

của các hợp chất phenol tiết ra từ vết thương là một loạt các protein đặc hiệu

như virE2, virB, virD, virD2,… Các protein này nhận biết các vết thương ở các cây chủ thích hợp (hầu hết là cây hai lá mầm), kích thích sản sinh ra các đoạn T-ADN, bao bọc che chở các đoạn ADN này và giúp chúng tiếp cận với hệ gen của cây chủ một cách an toàn [5]

1.3.4 Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A tumefaciens

Các tế bào cây bị tổn thương sẽ tiết ra các hợp chất hoá học dẫn dụ vi

khuẩn như: AS, Dưới tác dụng của các hợp chất này, A.tumefaciens nhận biết

rồi bám vào thành tế bào chủ và chuyển T-ADN vào tế bào thực vật Quá trình

này được sự trợ giúp đặc biệt của các gen vir và bờ phải (RB- Right Border) và

bờ trái (LB-Left Border) Cũng chính các hợp chất này là AS, với vai trò cảm ứng, giúp cho các gen vùng vir hoạt động và tăng cường biểu hiện

Sự tiếp xúc của A tumefaciens với các hợp chất giải phóng từ mô thực vật

bị tổn thương đã làm cho vùng vir của Ti-plasmid phiên mã Trong quá trình này

một chất có hoạt tính hóa học cao và đặc trưng đã được nhận biết là AS Gen

virA và gen virC được biểu hiện ở vi khuẩn sinh trưởng sinh dưỡng mặc dù gen virC chỉ được phiên mã ở mức độ thấp Khi A tumefaciens gặp dịch rỉ của các tế

bào thực vật bị tổn thương, hoặc AS tinh khiết, sản phẩm của gen virA (có thể

liên kết với màng) sẽ nhận diện và tương tác với AS và truyền tín hiệu ngoại bào

vào trong tế bào này làm hoạt hóa sản phẩm của gen virC Sau đó protein virC

đã biến đổi hoạt hóa làm cho các gen virB, virC, virD và virE không hoạt động

và làm tăng cường sự phiên mã của gen virC

Sự cảm ứng gen vir xảy ra nhờ sự xuất hiện các điểm đứt sợi đơn trong các trình tự biên 25 bp nằm ở mép của T-ADN và sự xuất hiện phân tử sợi đơn

mạch thẳng tương ứng với T-ADN Các sản phẩm của operon vir D có hoạt tính

endonuclease Bằng một cơ chế tương tự sự tiếp hợp của vi khuẩn, T-ADN được chuyển sang tế bào thực vật và xen một cách ổn định vào ADN nhân [5]

1.4 Gen chỉ thị chọn lọc

Gen chỉ thị thường được sử dụng là các gen β-glucuronidase (gus A): là

gen mã hóa cho sinh tổng hợp enzyme β-glucuronidase β-glucuronidase là một hydrolase xúc tác cho sự phân giải các β-glucuronide, sản phẩm phân giải có màu xanh chàm đặc trưng, dễ nhận biết β-glucuronide thường dùng nhất trong phản ứng để nhận biết sự tồn tại của gen gus A là X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide) Dung dịch X-gluc không màu dưới tác động của enzyme β-glucuronidase sẽ chuyển sang màu xanh chàm đặc trưng [11]

* Phương pháp xác định hiệu quả chuyển gen bằng nhuộm hóa tế bào

Do không phải toàn bộ các tế bào và các mẫu chuyển gen đều mang gen chuyển nên nhất thiết phải tiến hành sàng lọc các tế bào chuyển gen Dựa vào các gen chọn lọc được thiết kế trong vector chuyển gen mà người ta sử dụng các

kháng sinh phù hợp để thu được các tế bào, mẫu mang gen chuyển

Có thể nhuộm hóa tế bào để khẳng định sự của mặt của sản phẩm thông qua một loại gen chỉ thị được sử dụng phổ biến trong chuyển gen thực vật là gen

Gus hay gen uidA Gen Gus nằm ở locus uid của vi khuẩn E coli và mã hóa cho

enzyme β-glucuronidase Đây là một enzyme hydrolase có khả năng phân hủy các hợp chất có gốc β- glucuronide tạo thành chất trung gian, khi chất này bị oxi hóa sẽ có màu xanh đậm đặc trưng Do đó, enzyme này được xác định rất dễ dàng và thuận tiện bằng hợp chất indole- β-glucuronide [10]

Người ta thường sử dụng dung dịch muối 5-Br-4-Cl-3-indolyl glucuronide cyclohexylamine (X-Gluc) để nhuộm mô tế bào Sản phẩm sơ cấp 5-Br-4-Cl-3indolyl vẫn còn là một chất dễ tan, không màu Nhưng ngay sau đó sản phẩm này bị ôxy hóa và dimmer hóa thành một phức hệ không tan có màu xanh Sự có mặt của ferri và ferrocyanide trong dung dịch nhuộm làm tăng quá trình hình thành sản phẩm cuối cùng, đồng thời cũng góp phần hạn chế việc

β-D-khuếch tán sản phẩm sơ cấp đến vùng không có Gus [10]