DAI HOC THAI NGUYEN
NGUYEN KIM OANH
Féin dé tai:
BUGC DAU KHAO SAT QUY TRINH CHUYEN GEN CHIU HAN 4£
VÀ0 GIGNG DAU TUONG DVNS THONG QUA VI KHUAN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS
KHOA LUAN TOT NGHIEP DAI HOC
Hé dao tao : Chinh quy
Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : Công nghệ sinh học
& Cơng nghệ thực phẩm
Khố học : 2006 - 2010
Trang 2ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
NGUYEN KIM OANH
Féin dé tai:
BUC DAU KHAO SAT QUY TRINH CHUYEN GEN CHIU HAN GimNWAC
VAO GIONG DAU TUUNG DVNS THONG QUA VI KHUAN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS
KHOA LUAN TOT NGHIEP DAI HOC
Hệ đào tao : Chính quy
Chuyên ngành : Công nghệ sinh hoc
Khoa : Công nghệ sinh học
& Công nghệ thực phẩm
Khoá học : 2006 - 2010
Ngudi huéng din : 7 SS Wguyén Odin Dong
(Phong TNTD - CNTBTV - Vién Di Truyén Nong Nghiép)
2 KS Bai Fri Shie (Khoa CNSH & CNTP - Dai hoc Nong Lam Thái Nguyên)
Trang 3LOI CAM ON
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Đồng đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với sự giúp đỡ to lớn, những ý kiến đóng góp quý báu, sự hướng dân tận tình của ThS Hà Văn Chiến, KS Bùi Tri Thức và KS Nguyễn Tiến Dũng trong quá trình tơi thực hiện và hồn thành khóa luận này
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán bộ Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật - Viện Di truyền nông nghiệp về sự giúp đố nhiệt tình trong
suốt thời gian tôi thực hiện khóa luận
Tôi xin chân thành cảm ơn các thây cô giáo khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên đã giúp đỡ nhiệt tình và đã tạo mọi điêu kiện thuận lợi trong thời gian học tập cũng như khi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp
Cuối cùng, tôi xin gửi tới bố mẹ, anh chị cùng bạn bè, những người mà đã luôn quan tâm, ỉng hộ và là chỗ dựa cho tôi trong suốt thời gian tôi làm khóa luận
này, cũng như trong cuộc sống
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đối với những giúp đỡ quý báu đó
Hà Nội, ngày 30 tháng 05 năm 2010
Sinh viên
Trang 4DANH MUC BANG BIEU
Bảng 2.1 Các quốc gia sản xuất đậu tương nhiều nhất thế giới năm 2008 Bảng 2.2 Diện tích canh tác, năng suất và sản lượng của đậu tương ở Việt
Nam từ năm 2004 - 2Ó .- G6 2< 91191 11 1 101 ng như tự
Bảng 2.3 Số liệu thống kê sản xuất đậu tương qua các vùng khác nhau ở Việt
T0 020011111717 3
Bảng 4.1 Biểu hiện tạm thời của gen g⁄s khi biến nạp các chủng Agrobacterium khác nhau vào nốt lá mầm giống đậu tương ĐVNO 5s «+s+
Bảng 4.2 Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen
Trang 5DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Bản đồ Ti-plasmmid ¿+2 St *391 E391 E151 E11 111 11.11 xe 9 Hình 2.2 Cấu trúc T-DNA
Hình 2.3 Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A /neƒfaciens 11 Hinh 2.4 So d6 céu tric vector hai nguOn cccceccseeeseeeeeceeeeeeeeeeeeeeeeseeeeeeeeeeeeeee 14 Hình 2.5 Sơ đồ cấu trúc vector liên hỢp ¿ +: +++++++++£+x+vEexexxerexeerereeree 15
Hình 2.6 Phản ứng tạo ra sản phẩm 5,5'-dibromo-4.4-dicloro-indigo có màu xanh 27
Hình 3.1 Cấu trúc vector pBÌ - -¿- 6+ + xxx +EEkEeEekererrkrkerrrerrrrrei 29 Hình 3.2 Cấu trúc vector dựa trên nên vector pBÌ - ¿+ +s+sx+s+e£+x+e>ex+x 30 Hình 4.1 Biểu hiện tạm thời của gen ø⁄s trên đậu tương sau lây khi nhiễm với
các chủng khuẩn ¿- + +5 +++t+E+£ESE£k£EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEErrkrkrkrrrrrre 39 Hình 4.2 Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn đến biểu hiện gen gus tren ĐVN0 4I
Hình 4.3 Ảnh hưởng của nồng độ AS đến biểu hiện tạm thời của gen gus trén Hình 4.4 Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy lên biểu hiện tạm thời của
øen g/s trên VÌNO - «cv HH TH TH Tu HH Hy 45 Hình 4.5 Ảnh hưởng của việc gây tổn thương nốt lá mầm đến tỷ lệ sống và tần
9n) 8 0 d 47
Hình 4.6 Một số hình ảnh quy trình chuyển gen GmNAC vào giống đậu
tương ĐVNU TH TH TH TH Hư 48
Hình 4.7 Mức độ kháng hygromycin sau 12 giờ Lá của cây không chuyển gen (1, 2) Lá của cây đã được chuyển gen #;p/ (3, 4) - ¿55+ 48 Hình 4.8 Điện di DNA tổng số từ mẫu lá cây thí nghiệm qua xử lý RNase 49 Hình 4.9 Ảnh điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen Hpt
Trang 6
Ki HIEU VIET TAT
AS : Acetosyringone
(3,5-dimethoxy-4-hydrroxy Acetophenone) BAP : 6-benzylaminopurin
Bar : Gen ma héa tong hop phosphinothricin acetyl transferase CaMV : Cailiflower Mosaic Virus
Car : Carbenicillin
DNA : Deoxirionucleic Acid
FAO : Food and Agriculture Organization GFP : Green Fluorescent Protein
GUS : B-1,4-Glucuronidase
HPT : Hygromycin Phosphotransferase IAA : B-indol acetic acid
IBA : Indol-3-butyric acid
ISAAA : International Services for the Acquisition of Agri-Biotech
Ka : Kanamycin
LB : Luria Bertani L-Cys : L-Cystein
MS : Murashige and Skoog, 1962 NAA : Napthalene acetic acid
NPT II : Neomycin Phosphotransferase II PCR : Polymerase Chain Reaction
Ti-plasmid : Tumor-Including Plasmid
Trang 7MUC LUC
Trang
Phan 1: MO DAU w esssscsssssssssssssessesssesssesssessesseesseeuesssesesseennseseensessseeeesstee 1
LiL Tinh cap thiét ctha dé tai 1
I0 án 0u to n J 2
1.3 Yêu cầu của để tài - - - xxx HH HH HH1 TT TH ngư 2
1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài - 2-22 ©2+©s2+E+2E£+E+zEzEerxecrecree 2
Phân 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU -222222222222112122.2 xe 3
2.1 Nguồn gốc, vai trò và vị trí của cây đậu tương trong hệ thống cây trồng 3 2.1.1 Nguồn gốc và phân lOại ¿+62 x+32E*+E+tE£EEEEEEEESEEEEEEEkEEEEkEkkrkrkrkvree 3 2.1.2 Tâm quan trọng của cây đậu tương
2.1.3 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam - +-+ 5 2.1.3.1 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế glỚI 5 + + +++s++s++£+++e>e+ 5 2.1.3.2 Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam 6 55+ S+£+x+vesecsxss 6 2.1.4 Giống đậu tương ÐVÌNO kh HT HH TH HT Hư 7 2.1.5 Khái quát tình hình chịu hạn ở thực vật và ở cây đậu tương - 7 2.1.5.1 Khái niệm về hạn - 5c 633363 9328 E923 EEEE1 1111111111111 cee 7 2.1.5.2 Đặc tính chịu nóng, chịu hạn của cây đậu tương - - «++s+ss++s>s+ 7
2.2 Vi khuan Agrobacterium tumefaciens và hiện tượng biến nạp gen ở thực vật 8
2.2.1 Cấu trúc và chức năng của Ti-plasImid - - - +6 SE evEekeeerserexee 9 2.2.2 Cấu trúc và chức năng của đoạn T-DNA - ¿5+ +55 +++s+s++e£+++exe+sez 10 2.2.3 Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A tumefaciens
Trang 82.5.1 Một số nghiên cứu môi trường tái sinh ở thực vật và cây đậu tương 17
2.5.2 Một số nghiên cứu về chuyển gen ở đậu tương
2.6 Một số đặc tính đã được cải thiện ở cây đậu tương bằng kỹ thuật di truyền 20
2.7 Tình hình sản xuất đậu tương chuyển gen trên thế giới và trong nước 2
2.7.1 Tình hình sản xuất đậu tương chuyển gen trên thế giới -. ++ 2
2.7.2 Tình hình sản xuất đậu tương chuyển gen ở Việt Nam - + 23
2.8 Những nghiên cứu về gen Œ7n/WACC -¿- St St *+k+tEeEsketxeketersveervee 24 "` c 26
2.10 Các gen chi thi chọn lọc và các gen thông báo trong hệ thống vectơ biến nạp 27
Phan 3: VAT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚU 29
3.1 Vật liệu và phạm vi nghiên CỨU - 2< «5£ + + *£* £*E****E£k£eEekeeeeeereee 29 3.1.1 Vật liệu thu VẬT - - 6-1 vn TT TT TH HT TT HH rà 29 KP (0.1 n6 29
3.1.3 Hoá chất và dụng cụ thí nghiệm Ek =n ti na 30
3.1.3.2 Máy móc và thiết Đị ¿6 + kh nh Hà TT TT HH HH rên 30 3.1.4 Phạm vi nghiên CỨU <6 <6 << E1 E111 S1 1 TH HH ky 30 3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành - ¿+ xt+k+xzkeEvekkttekrrkrrrkrrrrrrrrke 30 kŠên? 30
3.2.2 Thời gian tiến hành - - - + E SE E vn nh nh nhàn 30 3.3 Nội dung nghiên CỨU << + 3k vn nh nh ng rà 31 3.4 Phương pháp nghiên CỨU - - + + SE + EkE E kh nh nến 31 3.4.1 Thí nghiệm 1: Lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho việc chuyển BON VAO DV NG ‹4 31
3.4.2 Thi nghiém 2: Danh gid dnh hudng cua mat do vi khudn (OD gonm) lén khả năng biến nạp gen vào đậu tương thông qua tỷ lệ biểu hiện tạm thời 071842.84101 8200.0Ẻnn 31 3.4.3 Thí nghiệm 3: Đánh giá ảnh hưởng của hàm lượng chất dân dụ
Trang 93.4 4 Thí nghiệm 4: Đánh giá ảnh hưởng của thời gian đông nuôi cấy đến khả năng biến nạp gen vào đậu tương thông qua tỷ lệ biểu hiện tạm thời của BEN GUS CHEN DVN 0 naỪ 32 3.4.5 Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của việc gây tổn thương nốt lá
mâm đến sự biểu hiện của gen gus trên ĐVNNO -s+s+s+++s+s sex s++ 32 3.4.6 Thí nghiệm 6: Chuyển gen chịu hạn GmNAC vào đậu tương ĐVN9 thông
qua vi khudin Agrobacterium tHHI©fICÏGHNS .- 5552 55s S2 S22 sexesex++ 34 3.4.7 Thí nghiệm 7: Phân tích các cây đậu tương chuyển gen sau tái sinh bằng
kỹ thuật PCR voi cap môi đặc hiệu của gen Hpt (kháng hygromycin) 35 3.5 Các chỉ tiêu đánh giá - - ¿<< k vn Tnhh ngư 37 3.6 Các phương pháp đánh giá - 6 - E1 ng ng Hư ky 37 Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN . z:¿ 38
4.1 Két qua lua chon ching vi khudn A tumefaciens thich hgp cho chuyén gen
vào giống đậu tương ĐVN9 thông qua biêu hiện tạm thời của gen g3 38
4.2 Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn (OD,ss„„) lên tỉ lệ biểu hiện tạm thời của
6Ô 0 40
4.3 Ảnh hưởng của hàm lượng Acetosyringone (AS) lên tỷ lệ biểu hiện tạm 00012000 ả 42 4.4 Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng biến nạp gen vào
đậu tương ĐVN9 thông qua tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus 43 4.5 Ảnh hưởng của việc gây tổn thương nốt là mâm trên giống ĐVN9 đến sự
biểu hiện tạm thời của gen gi/s ¿22 S2 S252 S32 Se+EeEeE+vzxexevrxresereresrr 45 4.6 Kết quả chuyển gen GmNAC giống đậu tương ĐVNO9 sử dụng
AgrobqCIGIIHII [HIHGAC CN ả SG <2 3813131381 E E4 E1 VESEEESkEEkkkkkskerrkere 47
Trang 10Phan 1
MỞ ĐẦU
1.1 Tính cấp thiết của đề tài
Đậu tương [Glycine max (L.) Merrill.] còn gọi là đậu nành là một cây trồng cạn ngắn ngày có giá trị kinh tế cao Khó có thể tìm thấy một cây trồng nào có tác dụng nhiều mặt như cây đậu tương Sản phẩm của nó làm thực phẩm cho con người, thức ăn cho gia súc nguyên liệu cho công nghiệp và hàng xuất khẩu Vì thế cây đậu tương được gọi là “Ơng Hồng trong các loại cây họ đậu" Ngoài ra, đậu tương là cây trồng lý tưởng trong hệ thống luân canh do khả năng cải tạo đất tốt (Ngô Thế Dân và cs, 1999)[2], (Trần Văn Điền, 2007)|4] Diện tích đậu tương ở nước ta hiện nay đạt khoảng 200.000 ha với năng suất bình quân 1,5 taén/ha (Clive James, 2008)[15], (FAO Statistic Database, 2007)[16] Để tăng sản lượng đậu tương, ngoài mở rộng thêm diện tích trong cơ cấu luân canh thì tăng năng suất là giải pháp chính
Sử dụng đậu tương biến đổi gen là một tiến bộ quan trọng trong nghành trồng đậu tương của trên toàn thế giới hiện nay Hiện diện tích trồng đậu tương biến đổi gen trên thế giới năm 2008 lên đến 125 triệu ha (Clive Jame, 2008)[15] Vì vậy, ở nước ta, cần thiết nhanh chóng tiếp cận và ứng dụng công nghệ này để tăng năng suất đậu tương Việc tạo giống đậu tương biến đổi gen từ các giống đậu tương trồng ở Việt Nam đòi hỏi các nghiên cứu tiến hành có hệ thống Ở Việt Nam đã xây dựng thành công hệ thống tái sinh và bước đầu nghiên cứu đánh giá khả năng đáp ứng chuyển nạp gen của các giống đậu tương địa phương (Trần Thị Cúc Hoà, 2007){8]
(Trần Thị Cúc Hoà, 2008)[9]
Mặt khác, đậu tương là một cây trồng cạn, ngắn ngày có giá trị kinh tế cao Là một nguồn quan trọng của dầu thực vật và protein Những yêu cầu dành cho dầu đậu tương và protein được tăng lên, sự cải thiện về chất lượng và sản xuất đậu tương thông qua sự biến nạp gen và chức năng di truyền học đã trở thành một vấn đề quan
trọng trên khắp thế giới
Trang 11Trong hàng loạt các yêu cầu cần phải có để tạo được giống cây trồng chuyển gen thì việc xây dựng quy trình biến nạp thuận lợi và có hiệu quả là một trong những đồi hỏi cần thiết
Do phạm vi nghiên cứu của đề tài quá rộng và đậu tương là đối tượng khó nuôi cấy, vì vậy với mong muốn góp phần hoàn thiện quy trình chuyển gen ở đậu tương nên chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: "Bước đầu khảo sát quy trình chuyển gen chịu hạn GmNAC vào giống đậu tương ĐVN9 thông qua vì khuẩn Agrobacterium tumefaciens"
1.2 Mục tiêu của đề tài
- Bước đầu khảo sát quy trình chuyển gen vào đậu tương nhờ vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens
- Xay dung quy trinh chuyén gen vao mot s6 ging dau tuong va phan tich các cây chuyển gen chịu hạn GmNAC sau tái sinh
- Trên cơ sở đó xác định được phương pháp chuyển gen thích hợp vào đậu tương, góp phần phát triển lĩnh vực chọn tạo giống đậu tương bằng công nghệ sinh học
1.3 Yêu cầu của đề tài
- Tối ưu hoá quá trình chuyển gen vào giống đậu tương ĐVNO9 sử dụng Agrobacterium tumefaciens
- Xay dung quy trinh chuyén gen GmNAC vao gidng dau tuong DVN9 sit dung vector dua trén nén vector pBI
- Phan tich cdc cay chuyén gen GmNAC sau tai sinh
1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của dé tài
- Ý nghĩa trong học tập và nghiên cứu khoa học
Thực hiện đề tài giúp sinh viên có thêm kinh nghiệm, kiến thức bổ ích và tiếp cận với công tác nghiên cứu khoa học để phục vụ cho nghiên cứu và công tác sau nay
- Ý nghĩa trong thực tiễn sản xuất
Trang 12Phan 2
TONG QUAN TAI LIEU
2.1 Nguồn gốc, vai trò và vị trí của cây đậu tương trong hệ thống cây trông
2.1.1 Nguồn gốc và phân loại
Đậu tương có tên khoa học là Glycine max (L.) Merrill, là loại cây trồng thuộc họ đậu (Ƒabaceae), họ phụ cánh bướm (Papilionoi dea) có nguồn gốc từ Trung Quốc là loại cây trồng hàng năm không thấy xuất hiện ở loài hoang dại Các giống đậu tương địa phương của nước ta hiện nay được du nhập từ Trung Quốc đã từ lau (Tran Van Dién, 2007)[4], (FAO Statistic Database, 2007)[16] Cay dau tuong 1a cây thân thảo, ít phân cành dang bụi, lá đậu tương là lá kép với 3 lá chét, nhưng đôi khi còn có 4-5 lá chét Hoa màu trắng hay tím, quả thẳng hay quả cong có nhiều lông Vỏ của hạt đậu tương có màu nâu, đen, vàng, xanh Khối lượng hạt rất đa dạng từ 20-400 mg/hạt Cây đậu tương có 2 đặc tính sinh trưởng: sinh trưởng hữu han va sinh trưởng vô hạn, thời gian sinh trưởng có 3 loại: chín sớm (75-85 ngày) trung bình (80-100 ngày), muộn (110-120 ngày) Thời gian sinh trưởng là một yếu tố rất
quan trọng để lựa chọn cây trồng luân canh xen vụ Một đặc điểm nổi bật là ở rễ cây
đậu tương thường có nốt sân chứa vi khuẩn có khả năng cố định nitơ tự do, cho nên trồng cây đậu tương còn có tác dụng cải tạo đất (Trần Văn Điền, 2007)|4], (Gamborg O L và cs, 1986)[18] Các công trình nghiên cứu cho thấy những giống có khả năng cộng sinh và có đủ nốt sân thường làm cho hàm lượng protein cao Đậu tương là cây tương đối mãn cảm với điều kiện ngoại cảnh Trong tập đoàn giống đậu tương có những giống chỉ trồng vào vụ hè, có những giống chỉ trồng vào vụ đông
(Gamborg O L va cs, 1986)[18]
Trang 132.1.2 Tam quan trong của cây đậu tương
Cây đậu tương là nguồn thực phẩm có giá trị kinh tế cao, giàu đạm, giàu chất béo, giàu các chất khoáng và các vitamin Ngoài ra, đậu tương còn là nguyên liệu tốt cho ngành công nghiệp thực phẩm, công nghệ ép dầu, thức ăn gia súc và cây làm tốt đất (nhờ hoạt động cố định N; của loại vi khuẩn Rizobium cộng sinh trên rễ cây họ đậu), đồng thời cũng là những loài xuất khẩu có giá trị đối với nhiều thị trường trên thế giới (Ngô Thế Dân và cs, 1999)[2]
Giá trị về mặt thực phẩm
Trong hạt đậu tương chứa 38-40% protein, trong khi đó sắn, gạo, ngô chỉ chứa từ 2-14,9% và hydrat cacbon từ 15-16% Hơn nữa, đậu tương còn chứa nhiều
axit amin cơ bản cần thiết như: isoleucin, leucin, metionin, lysin, phenylamin, tryptophan, valnhu, nhiều loại vitamin A, Bị, B;, C, và chất khống (Ngơ Thế Dân
và cs, 1999)2] Hạt đậu tương được coi là nguồn cung cấp protein hoàn chỉnh vì chứa một lượng đáng kể các amino acid không thay thế Khi thiếu protein trong thành phần thức ăn thì sẽ hạn chế sự sinh trưởng và phát triển trí tuệ của trẻ em và giảm mức độ đề kháng đối với các bệnh truyền nhiễm
Giá trị về mặt công nghiệp
Đậu tương là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp khác nhau như: chế
biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xa phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt lỏng,
đầu bôi trơn trong ngành hàng không, nhưng chủ yếu đậu tương được dùng để ép dầu Hiện nay trên thế giới đậu tương là cây đứng đầu về cung cấp nguyên liệu cho ép dầu, dầu đậu tương chiếm 50% tổng lượng dầu thực vật
Giá trị về mặt nông nghiệp
Làm thức ăn cho gia súc: Đậu tương là nguồn thức ăn tốt cho gia súc, l kg
hạt đậu tương đương với 1.38 đơn vị thức ăn chăn ni Tồn cây đậu tương (thân,
lá, quả, hạt) có hàm lượng đạm khá cao cho nên các sản phẩm phụ như thân lá tươi
có thể làm thức ăn cho gia súc rất tốt, hoặc nghiền khô làm thức ăn tổng hợp của gia
súc Sản phẩm phụ công nghiệp như khô dầu có thành phần dinh dưỡng khá cao: NÑ:6,2%, P;O;: 0,7%, K;O: 2,4%, vì thế làm thức ăn cho gia súc rất tốt (Ngô Thế Dân và cs, 1999)[2]
Cải tạo đất: Đậu tương là cây luân canh cải tạo đất tốt l ha trồng đậu tương
nếu sinh trưởng phát triển tốt để lại trong đất từ 30-60 kg N Trong hệ thống luân
Trang 14cây trồng sau, góp phần tăng năng suất cả hệ thống cây trồng mà giảm chi phí cho việc bón phân N Thân lá đậu tương dùng bón ruộng thay phân hữu cơ rất tốt bởi
lượng N trong thân chiếm 0,05%, trong lá: 0,19% (Ngô Thế Dân và cs, 1999)[2] 2.1.3 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam
2.1.3.1 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới
Trang 152.1.3.2 Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam
Theo kết quả điều tra của tổng cục thống kê Việt Nam về sản xuất đậu tương trong 5 năm gần đây (từ năm 2004 đến 2009) cho thấy khuynh hướng gia tăng chậm về diện tích sản xuất, năng suất và sản lượng của đậu tương tại Việt Nam Định hướng đến năm 2015 diện tích đậu tương của cả nước đạt khoảng 700 nghìn ha Kết quả điều tra cho thấy đậu tương là cây công nghiệp ngắn ngày được sản xuất trên
diện tích lớn sau lúa, bắp (ngô), khoai lang, mía, sắn và đậu phộng (lạc)
Bảng 2.2 Diện tích canh tác, năng suất và sản lượng của đậu tương ở Việt Nam từ năm 2004 — 2009 Số liệu thu thập 2004 | 2005 | 2006 | 2007 | 2008 | 2009 Diện tích (nghìn ha) 183.8 | 204.1 | 185,6 | 187.4 | 191,5 | 146,4 Năng suất (kg/ha) 1340,0 | 1430,0 | 1390,0 | 1470,0 | 1400,0 | 1459,0 Tống sản lượng (nghìn tấn) | 245,9 | 292,7 | 258,1 | 275,2 | 268/6 | 213,6
(Nguồn: Niêm giám thống kê 2009, Nhà Xuất Bản Thống Kê Hà Nội, 2010)[13] Bảng 2.3 Số liệu thống kê sản xuất đậu tương qua các vùng khác nhau
ở Việt Nam năm 2008 Diện tích | Năng suất Sản lượng TT Vùng canh tác
Trang 166 Việt Nam, dựa vào dạng đất canh tác, điều kiện tự nhiên và tập quán canh tác, có 6 vùng canh tác cây đậu tương chính
Việt Nam đã đặt ra mục tiêu tăng sản lượng đậu tương lên đến 500 triệu tấn/năm vào năm 2010 Tuy nhiên, sản lượng đậu tương khó tăng nhanh trong những năm tới do năng suất còn thấp, chỉ phí cho hoá chất trừ sâu hại cao, làm hạn chế khả năng tăng năng suất và tăng mùa vụ và diện tích gieo trồng của đậu tương
2.1.4 Giống đậu tương ĐVN9
Giống đậu tương ĐVN9 do nhóm các nhà khoa học của Viện Nghiên cứu Ngô lai tạo và chọn lọc từ tổ hợp lai ĐT-12 x VN20-5 Giống được công nhận cho sản xuất thử nghiệm năm 2007 và hiện đang được nhân ra diện rộng ĐVN0 là giống đậu tương chín sớm: vụ xuân 88-90 ngày vụ hè 75-77 ngày vụ đông 78-80 ngày; dạng cây đứng, lá hình trứng nhọn, hoa tím, vỏ quả chín màu vàng rơm, hạt vàng, rốn hạt nâu nhạt Chiều cao cây trung bình 27,3-56,5cm; phan cành manh (1,7-3,1 cành cấp 1/cây); cỡ hạt trung bình (148,5 -171,8g/1000 hạt); sai quả (22,9 - 49,5 quả/cây) Năng suất trung bình ở vụ xuân đạt 17 ta/ha, vụ hè 21 tạ/ha
2.1.5 Khái quát tình hình chịu hạn ở thực vật và ở cây đậu tương 2.1.5.1 Khái niệm về hạn
Hạn là hiện tượng thường xuyên xảy ra trong tự nhiên và liên quan trực tiếp đến vấn đề nước trong cơ thể thực vật Hạn cũng như những yếu tố ngoại cảnh khác khi tác động lên cơ thể, gây ra các phản ứng của cơ thể, tuỳ theo từng loài, giống mà mức độ phản ứng của cơ thể cũng như thiệt hại do khô hạn gây ra khác nhau, một số
bị chết một số bị tổn thương, một số khác bị ảnh hưởng còn số khác có thể không bị
ảnh hưởng
2.1.5.2 Đặc tính chịu nóng, chịu hạn của cây đậu tương
Các cây họ đậu nói chung, cây đậu tương nói riêng là cây có nhu cầu về nước cao hơn các loại cây khác Đó chính là do trong hạt và cây đậu tương có hàm lượng protein và lipit rất cao, để tổng hợp 1 kg chất khô cần 500-530 kg nước Trong quá trình nảy mầm thì nhu cầu về nước của đậu tương cũng khá cao - 50%, trong khi đó
ở ngô chỉ là 30%, lúa là 26% (Tran Van Điền, 2007)|4]
Trang 17điểm hoá keo của nguyên sinh chất, đặc điểm của quá trình trao đổi chất Tính chịu
hạn của cây đậu tương mang tính đa gen Chúng thể hiện ở nhiều khía cạnh khác nhau: như sự phát triển nhanh của bộ rễ, tính chín sớm tương đối, cũng như bản chất di truyền của từng giống có khả năng sử dụng nước tiết kiệm trong quá trình sinh
trưởng và phát triển của cây Căn cứ vào đặc điểm này, đậu tương được chia thành
hai nhóm:
- Nhóm chịu được sự mất nước trong từng giai đoạn phát triển của cây - Nhóm chịu được sự thiếu nước trong tất cả giai đoạn phát triển của cây
Ở giai đoạn cây con khi gặp hạn đậu tương có thể vượt qua hơn, còn ở những giai đoạn sau như giai đoạn ra hoa, kết quả, hạt chín sữa mà gặp hạn thì sẽ dẫn đến
năng suất giảm đáng kể
Ở Việt Nam đã có một số tác giả nghiên cứu khả năng chịu nóng, chịu hạn của cây đậu tương, tiêu biểu là công trình đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu tương nhập nội, nghiên cứu phân lập, xác định trình tự gen chaperonin tế bào chất từ giống đậu tương đột biến M103 (Trần Thị Cúc Hoà, 2007)[8], phan lập gen dehydrin liên quan đến khả năng chịu hạn của cây đậu tương, nâng cao tính chịu hạn của cây đậu tương bằng phương pháp đột biến thực nghiệm
2.2 Vikhuan Agrobacterium tumefaciens va hién tượng biến nạp gen ở thực vật Agrobacterium tumefaciens 1a vi khuan gay bénh s6ng trong dat, c6 kha nang xâm nhiễm thực vật, kích thích tạo khối u ngay tại các vết thương của cây chủ Trong tự nhiên, Agrobacferium tumeƒfacines chủ yếu tấn công cây hai lá mâm, đặc biệt là nhóm thực vật có hoa Hoàn toàn khác với mô tế bào thực vật bình thường, khdi u do Agrobacterium tumefaciens sinh ra phát triển mạnh ngay trong điều kiện thiếu hoocmon sinh trưởng (auxin và cytokiin) Đó là do Agrobacteriuim tumefaciens da chuyén mot doan T-DNA (Transfer DNA) sang té bao thuc vat va T- DNA điều khiển quá trình sinh tổng hợp các chất đó Ngoài ra, các khối u cũng sinh tổng hợp các opin là các axit amin (amino acid-aa) đặc biệt là các dẫn xuất của đường Dạng opin được tổng hợp có thể là nopalin, octopin, agrocinopin, mannozapin va agropin phụ thuộc vào từng chủng Agrobacterium tumefaciens
Trong đó, octopin và nopalin là hai dạng opin phổ biến Opin được vi khuẩn sử dụng
Trang 18gây khối u thực vật Cơ chế phân tử của sự hình thành khối u đã được quan tam nghiên cứu nhằm tìm ra một phương thức phòng bệnh cho cây Khi phát hiện ra Ti- plasmid và khăng năng tự chuyển T-DNA vào genome thực vật, người ta đã đặc biệt chú ý và khai thác khả năng sử dụng chúng như một vector tự nhiên để chuyển các gen quan tâm vào thực vật nhằm tạo cây trồng mang những tính trạng mong muốn (Trần Quốc Dung va cs, 2006)[3]
2.2.1 Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid
Ti-plasmid được phát hiện ở tất cả các ching A tumefaciens gay nhiễm và tồn tại bên vững ở nhiệt độ dưới 30°C Đây là một phân tử DNA mạch vòng, sợi kép và tồn tại trong tế bào như một đơn vị sao chép độc lập
'Vùng gây khối u Vùng phân
giải nopalin J 3
Cac gen gay khoiu Sin sinh cytokinin Téng hop opin
“ Vùng T-ADN TDNA
'Vùng tái bản Sản sinh auxin—
‘Doan bién trai 'Đoạn biên phải Vùng chuyến nạp Ti-Plasmid (Nopalin) Ti- Plasmid Ving gay doc Ving VIR | Phin gia opin > NGỘ wr
h 2.1 Ban do ` Vùng khởi đầu sao chép die Phân tícfditfrtyền cho thấy, Ti-plasm cog Cpe re Geng epee nà cà dạng phổ biến nhất, có 4 vùng tương đồng, trong đó có vùng T-DNA và vùng gây độc (vùng vir), liên quan trực tiếp tới sự hình thành khối u ở thực vật Hai vùng còn lại chứa gen mã hoá cho việc sao chép plasmid và chuyển gen
Trên Ti-plasmid, chỉ có vùng T-DNA được chuyển từ vi khuẩn sang genome của cây bị bệnh và tồn tại bên vững ở đó Tuy nhiên, vùng này lại khơng mã hố những sản phẩm trung gian cho quá trình chuyển T-DNA mà cần sự trợ giúp đặc
biệt của các gen gây khối u nằm trên vùng VIR và trên nhiễm sắc thể vi khuẩn (gen
Trang 1910
2.2.2 Cấu trúc và chức năng của doan T-DNA
Kết quả phân tích trình tự gen trên T-DNA ở các Ti-plasmid khác nhau cho thấy, T-DNA được giới hạn bởi một đoạn trình tự lặp lại gần như hoàn toàn từ khoảng 25bp và gọi là đoạn biên Chúng là dấu hiệu nhận biết cho quá trình chuyển T-DNA và xâm nhập của T-DNA vào tế bào thực vật Ở đoạn biên phải (Righ border-RB) có yếu tố điều khiển c¡s cần cho quá trình chuyển T-DNA Doan biên trái (Left border-LB) gián tiếp tham gia vào quá trình chuyển T-DNA và là dấu hiệu để quá trình này kết thúc bình thường (Schmidt M.A và cs, 2007)[28]
6 Ti-plasmid dang nopalin, T-DNA xâm nhập vào genome thực vật ở dạng
một đoạn liên tục dài 22kb Trong khi 6 Ti-plasmid dang octopin, T-DNA 1a mot
đoạn gen liên tục dài 13 kb T-DNA mang rất nhiều gen như: (1) Các gen mã hoá những enzym cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp opin; (2) Các gen gây khối u nhu tms/, tms2, tmr ma hod cho cdc enzym liên quan đến quá trình sinh tổng hợp auxin và cytokinin Vùng gây khối u (Onc) LB RB Tmsl Tms2 Tmr nos TGGCGGATATATATGTGGTGTAAAC TGACAGGATATATGGCGGGTAAAC Hình 2.2 Cấu trúc T-DNA
2.2.3 Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A fmeƒfaciens
Các tế bào cây bị tổn thương sẽ tiết ra các hợp chất hoá học dẫn dụ vi khuẩn
như: acetosyringon, hydroxy-acetosyringon Dưới tác dụng của hợp chất nay, A tumefaciens nhan biét r6i bam vào thành tế bào chủ và chuyển T-DNA vào tế bào thực vật Quá trình này được trợ giúp đặc biệt của gen vir va RB, LB Cũng chính các hợp chất này, với vai trò cảm ứng, giúp các gen vùng VIR hoạt động và tăng
cường biểu hiện Khi vi khuẩn xâm nhiễm tế bào qua vết thương, sản phẩm gen vir
A sẽ nhận biết sự có mặt và tương tác với các phân tử acetosyringon rồi truyền thông tin ngoại bào này vào trong tế bào dẫn đến sự hoạt động của các protein vir G
Trang 2011
tach T-DNA thành hai sợi đơn Một sợi sẽ chuyển sang tế bào thực vật với đầu 5' đi trước Sợi đơn còn lại sẽ làm khuôn để tổng hợp nên sợi DNA bổ sung mới VirDI
và virD2 chịu trách nhiệm hình thành mạch T, một bản copy mạch đơn của T-DNA, bằng cách nhận biết và cắt ở vị trí đặc trưng ở hai đoạn biên, trong đó đoạn biên phải là điểm bắt đầu, do vậy quan trọng hơn (Lê Trần Bình và cs, 1997)[ 1]
Trong quá trình di chuyển, sợi DNA đơn được gắn với protein virE để chui qua rất nhiều màng trước khi vào được đến nhân tế bào thực vật Protein virB nằm
trên màng tế bào vi khuẩn có nhiệm vụ chuyển trực tiếp T-DNA sợi đơn sang tế bào
thực vật Sau khi T-DNA qua màng tế bào, chúng đi thẳng vào nhân và kết hợp với
hệ gen thực vật ở những vị trí ngẫu nhiên Trong quá trình di chuyển, sợi DNA đơn
được gắn với protein VirE để chui qua rất nhiều màng trước khi vào được đến nhân tế bào thực vật Protein virB nằm trên màng tế bào vi khuẩn có nhiệm vụ chuyển trực tiếp T-DNA sợi đơn sang tế bào thực vật
Hinh 2.3 Co ché phan tir cia viéc chuyén gen thong qua A tumefaciens Tại đó, các gen trên T-DNA, nhờ sự điều khiển của gen thực vật, bắt đầu hoạt động và sản sinh auxin, cytokinin và opin gây nên sự phát triển tthái quá của hàng loạt tế bào lân cận dẫn đến sự hình thành khối u (Frame B.R và cs, 2002){ 17] 2.2.4 Biến nạp gen thông qua vi khuan Agrobacterium tumefaciens 2.2.4.1 Hệ thống chuyển gen in vitro
Trang 2112
- Xử lý sóng siêu âm: Xử lý mo té bao thuc vat v6i A.tumefaciens trong diéu kiện sóng siêu âm tạo ra các tổn thương nhỏ, đồng nhất ở mô thực vật, cho phép Agrobacterium dễ dàng xâm nhập vào tế bào thực vật Bằng phương pháp này đã cải
thiện rõ rệt hiệu quả chuyển gen, biểu hiện gs tạm thời đã tăng từ 100-1400 lần ở
các tế bào đậu tương, đậu đũa, cây vân sam trắng, lúa mì và ngô
- Ly tâm tế bào: Phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium kết hợp với ly tâm đã được áp dụng thành công khi biến nạp vào huyền phù tế bào phơi hố nhận được từ hoa chuối đực nuôi cấy in vitro của hai giống chuối thương mại Cavendish và Lady Einger Tần số chuyển gen đã được cải thiện đáng kể bằng cách áp dụng chế độ ly tâm tế bào thực vật trong quá trình nuôi cấy cộng sinh với vi
khuẩn (Khanna H.K và cs, 2004)[21]
2.2.4.2 Hệ thống chuyển gen in vivo
Phương pháp này dựa trên cơ sở của việc chuyển gen vào nguyên cây (in planta) và rất phổ biến đối với loài A /hal/ana, một trong những loài cây mô hình đối với các nghiên cứu về hệ gen học Phương pháp chuyển gen này tốn ít thời gian, bỏ qua công đoạn nuôi cấy mô và tái sinh sau biến nạp, vì thế loại bỏ được các biến đị sôma và số lượng cây chuyển gen thu được lớn hơn Kỹ thuật này đã được mô tả ở các cây trồng khác nhau như: đậu tương, Arabidopsis, hoa hướng dương, hoa rum và
cay lac (Rohini V.K va cs, 2000)[26] - Phuong phap chuyén gen vao hat
Hạt Arabidopsis được lây nhiễm với Agrobacterium sau đó đem trồng va thu được cây trưởng thành với tần số biến nạp 1% Hạt Arabidopsis chuyển gen đã được tạo thành từ các cụm hoa mới xuất hiện sau khi lây nhiễm Agrobacrerium tại những
vùng bị tổn thương khi cắt bỏ cụm hoa
- Phương pháp ngâm cụm hoa
Trang 2213
cây con nay mầm từ hạt nhận được từ các cây ngô sau khi lây nhiễm bằng cách này mang gen 00!I
- Phương pháp thấm lọc chân không
Phương pháp chuyển gen thấm lọc chân không cũng tương tự như phương pháp ngâm cụm hoa Phương pháp này đã được áp dụng ở một số cây trồng, đặc biệt là cây một lá mầm Trong môi trường chân không, tế bào thực vật tiếp xúc với Agrobacterium tốt hơn Người ta đã nhận được các cây Medicago truncatula (cay mô hình thuộc họ đậu) chuyển gen bền vững bằng phương pháp chuyển gen này (Tingay S và cs, 1997)[29]
Ngoài ra, ngày nay trên thế giới còn sử dung các phương pháp biến nạp trực
tiếp như: Biến nạp bằng súng bắn gen, biến nạp bằng hóa chất, biến nạo bằng xung điện (Sharma K.K va cs, 2005)[27]
2.3 Hé thong vecto chuyén gen thong qua vi khuan Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid là một đoạn phân tử DNA mạch vòng, sợi kép có trọng lượng
phân tử bằng 3-5% so với trọng lượng phân tử của nhiễm sắc thể vi khuẩn Với kích
Trang 2314
Hé vector hai nguén
Trên cơ sở phát hiện vùng vir không cần nằm trên cùng một plasmid với vùng T-DNA mà vẫn điểu khiển được sự chuyển và xâm nhập của T-DNA vào hệ gen thực
vật, người ta đã nghiên cứu và hoàn chỉnh hệ thống vector hai nguồn trong đó vùng T- DNA và vùng vir nằm trên hai plasmid khác nhau nhưng trong cùng một chủng A.tmefaciens Có hai loại vector được sử dụng trong hệ thống vector hai nguồn:
(1) Vector chuyển gen: là Ti-plasmid nhỏ có khả năng tự sao chép và có phổ vật chủ rộng với đoạn T-DNA được cắt bỏ hết các gen không cần thiết ở giữa hai trình tự biên trái và biên phải, gắn thêm một số thành phần tạo ra cấu trúc mới gồm:
ï) các đơn vị sao chép để DNA plasmid có thể vừa tự nhân trong cả E.coli và
Agrobacterium; ii) các gen chọn lọc, gen chỉ thị; iii) vùng có chứa nhiều điểm cắt của các enzyme giới hạn (vùng tạo ra dòng đa năng) nằm ở giữa hai trình tự biên trái và biên phải để chèn gen mong muốn
(2) Vector bổ trợ: nằm trong A.fmefaciens, với toàn bộ vùng vir được giữ lại nhưng loại bỏ hoàn toàn vùng T-DNA và RB, LB Plasmid này được cải tiến loại bỏ gen kích thích tế bào thực vật phát triển thành khối u, nhưng vẫn duy trì khả năng thâm nhập vào tế bào thực vật
Hai cấu trúc này cùng được đưa vào Agrobacferium, khi các gen trên vector bổ trợ hoạt động thì các sản phẩm của nó sẽ tác động tới đoạn T-DNA trên vector
chuyển gen dẫn đến sự chuyển đoạn T-DNA sang tế bào thực vật Đoạn khởi động Gen quan tâm
Đoạn kết thúc 'Vùng T-ADN bị loại bỏ
Vùng VIR
'Vùng khởi đầu sao chép
của Agrobacterium
'Vùng khởi đầu sao chép
của E.coli Vùng khởi đầu sao chép
Hình 2.4 Sơ đô cấu trúc vector hai nguôn
Trang 2415
một số ưu điểm như: ¡) Không xảy ra quá trình tái tổ hợp giữa các plasmid; ii) Kích thước vector khá nhỏ Nhờ vậy, hiệu quả quá trình chuyén gen tir E.coli sang A.timcfaciens đã tăng lên Hiện nay, vector hai nguồn được sử dụng rộng rãi với rất nhiều loại được thiết kế phù hợp với yêu cầu của quá trình chuyển gen (Phạm Thị
Hanh va cs, 2005){6]
Hệ thống vector liên hợp
Vector liên hợp được xây dựng trên cơ sở tự tái tổ hợp giữa vùng tương đồng nằm trên plasmid vi khuẩn ( như vector của E.coli) với vùng T-DNA trên Ti-plasmid của A.fmefaciens Trong đó, người ta giữ lại vùng vir, loại bỏ vùng mã hoá chức năng gây khối u và thay thế bằng những đoạn DNA mới trong Ti-plasmid Có 3 loại hệ thống vector tham gia vào hệ thống vector liên hợp:
@) Ti-plasmid: các gen gây khối u đã bị thay bởi gen kháng kanamycin của vi khuẩn; (ii) Vector trung gian: có nguồn gốc từ pBR322 với kích thước nhỏ và được
sử dụng để bổ trợ chức năng không ưu việt của Ti-plasmid (kích thước lớn và thiếu
viing MCS) Ching dugc nhan lén trong E coli va chuyén sang A tumefaciens nho quá trình tiếp hợp Do không thể sao chép trong A tumefaciens nén ching mang những đoạn tương đồng với T-DNA (ii) Vector trợ giúp: tồn tại trong E coli, có kích thước nhỏ, chứa gen di động (mob) và gen chuyển (tra) giúp cho quá trình tiếp
hợp và chuyển vao A tumefaciens
Đoạn khởi động Doan kết thúc
Gen chi thi chon ~~ Đoạn biên phải
Vig VIR
Hình 2.5 Sơ đô cấu trúc vector liên hop
2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp gen thong qua A tumefaciens
Sự thành công trong việc tạo ra thực vật chuyển gen phụ thuộc vào một loạt
Trang 2516
cây chuyển gen hoàn chỉnh từ các tế bào và mô mang gen chuyển nạp Đối với phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium thi tan s6 bién nap phu thudc vào các yếu tố liên quan đến vi khuẩn và các yếu tố liên quan đến thực vật Các yếu
tố liên quan đến vi khuẩn bao gồm: chủng vi khuẩn, mật độ vi khuẩn, thời gian lây
nhiễm, hoạt tính của gen vir, khả năng xâm nhập vào các cây chủ và loại vector Các yếu tố liên quan đến thực vật gồm loại cây, kiểu gen, dạng mẫu mô, khả năng phân bào của các tế bào đích, thành phần môi trường (Lê Thị Thu Hiền, 2003)[7]
Một số yếu tố chính ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen thông qua Agrobacterium:
Ching Agrobacterium va plasmid
Các nghiên cứu chuyển gen thành công thông qua A.tumefaciens cho thay hiện tại chỉ có 3 chủng vi khuẩn được sử dụng hiệu quả ở các loài cây một lá mầm
đó là LBA4404, C58 đã bị bất hoạt và EHA 101; và các chủng cải biên (EHA105 từ EHA101, AGLO &AGL-1 tit EHA101) (Pham Thi Ly Thu, 2006){ 1 1]
Dang Ti plasmid cua Agrobacterium cing c6 vai trò trong quá trình chuyển T- DNA vào tế bào thực vật Các nghiên cứu cho thấy, T¡ plasmid dang nopalin có hiệu qua hon trong viéc lay nhiém Agrobacterium vao ng6 so véi Ti plasmid dang octopin
Thanh phần môi trường lây nhiễm và đồng nuôi cấy
Thành phần môi trường cũng là những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen Môi trường N6 cải tiến có bổ sung 2.4D, casein là môi trường thích hợp cho nuôi cấy cộng sinh trong chuyển gen vào lúa Môi trường MS hay MS cải tiến cũng thích hợp cho lây nhiễm và đồng nuôi cấy trong chuyển gen ở một số kiểu gen lúa khác Môi trường với hàm lượng khoáng giảm đã kích thích khả năng chuyển T-DNA trong biến nạp gen vào mô sẹo phơi hố ở lúa mỳ, phôi non ở ngô
(Phạm Thị Lý Thu, 2006)[11]
Trang 2617
Các chat khang sinh dé loai bé Agrobacterium
Các chất kháng sinh như: cefotaxime, carbenicillin, timentin thường được sử dụng loại bỏ vi khuẩn sau khi đồng nuôi cấy trong các nghiên cứu chuyển gen thông qua Agrobacrerium Cefotaxime biểu hiện rất hiệu quả trong các nghiên cứu chuyển gen ban đầu ở ngô và lúa, nhưng nghiên cứu sau này cho thấy ở nồng độ 250 mg/I đã ảnh hưởng không tốt đến khả năng tạo mô sẹo dòng ngô Hill (Kondo T va cs, 2000)22] Hiện nay, carbenicillin đang được sử dụng chủ yếu trong các thí nghiệm chuyển gen thông qua Agrobacrerium vào ngô và lúa ở nồng độ 100 mgil
Mat do vi khuẩn
Mật độ vi khuẩn Agrobacterium cao thudng gây chết tế bào thực vật giảm khả năng tái sinh của các tế bào sau khi biến nạp, dẫn tới giảm tần số chuyển gen bền vững Tuy nhiên, mật độ vi khuẩn lây nhiễm cao là cần thiết đối với chuyển gen vào các lồi, các mẫu mơ khó, tần số chuyển gen có thể được cải thiện bằng cách lây nhiễm thời gian ngắn, rửa mẫu sau khi lây nhiễm hoặc bổ sung các chất kìm hãm vi
khuẩn vào môi trường đồng nuôi cấy (Hoa C.T.T và cs, 2008)[20]
Trong hầu hết các trường hợp, nếu quá trình chuyển T-DNA hiệu quả sẽ dẫn đến khả năng chuyển gen bền vững cao Mặc dù vậy, trong nhiều điều kiện quá trình chuyển T-DNA tăng đã không có kết quả trong chuyển gen bền vững Nguyên nhân
có thể là do thiếu sự tương tác giữa quá trình chuyển T-DNA và chuyển gen bền vững Để có được sự phối hợp giữa chuyển T-DNA và chuyển gen bền vững thì các
điều kiện lây nhiễm, đồng nuôi cấy phải thích hợp cho việc chuyển T-DNA và tái
sinh cây chuyển gen
Ngoài ra còn có ảnh hưởng của kiểu gen, dạng mô đích, mô sẹo phôi hóa, phôi non mới tách, huyền phù tế bào, nhiệt độ (Nguyễn Đức Thành, 2003)[10] 2.5 Tình hình về nuôi cấy mô và chuyển gen ở đậu tương
Trang 2718
được đưa vào sản xuất và nó phát triển mạnh ở thế kỷ 20 Như vậy sau hơn 100 năm nghiên cứu và phát triển Cho đến nay có hàng trăm loại môi trường dinh dưỡng nhân tạo đã được xây dựng và thử nghiệm có kết quả Hầu hết các loại môi trường gồm những nhóm chất chính sau:
Các loại muối khoáng, nguồn carbon, vitamin, các chất điều khiển sinh
trưởng, các nhóm chất bổ sung, chất độn
Vấn đề đặt ra là nghiên cứu tỷ lệ của các nhóm chất thích hợp với khả năng tái sinh của từng giống cây trồng, đây là một hướng nghiên cứu rất lớn nhằm phục vụ công tác chuyển gen ở cây trồng
Trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu môi trường tái sinh phục vụ chuyển gen ở thực vật: tiến hành gây mất nước mô sẹo lúa và đã nhận thấy ABA (Abscisic acid) là chất làm tăng khả năng giữ nước và chịu mất nước của mô sẹo lúa Nồng độ ABA thích hợp cho việc sử lý tiền mô sẹo lúa là 10M và thời gian sử lý là 5 - 7 ngày Sử dụng kỹ thuật này để biến nạp gen ø⁄s vào mô sẹo lạc, kết quả đã nhận được 82 dòng lạc sống sót sau nhiều lần chọn lọc liên tiếp trên môi trường nuôi cấy có bổ sung 4mg/I BAP và 0,1mg/I NAA (Olhoft P.M va cs, 2001)[23]
Tại Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu công bố kết quả bước đầu xây dựng hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen ở cây trồng Các hướng nghiên cứu chính về hệ thống tái sinh trên là nghiên cứu ảnh hưởng của các loại phytohormon như cytokinin và auxin đến khả năng tái sinh chồi để tìm ra môi trường tối ưu cho hệ số tạo chồi cao, hay nghiên cứu ảnh hưởng của các mơi trường dinh dưỡng khống cơ bản như môi trường MS (Muashige - Skoog 1962), WPM (Lloyd and Mc
Cown, 1981), BA (N° benzyl amino purine), IAA (indol acetic acide), NAA (naphthalene axetic acide ), IBA (indol butyric acide), nudc dita (CW) Cac cong
Trang 2819
2,4D đến khả năng tạo mô sẹo, ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh mô sẹo, ảnh hưởng của tổ hợp BAP, NAA tới khả năng tạo chồi của mô sẹo
2.5.2 Một số nghiên cứu về chuyển gen ở đậu tương
Công tác thu thập và nhập nội các giống đậu tương đã được các Viện nghiên cứu Việt Nam tiến hành từ năm 1962 Theo Nguyễn Danh Đông (1983){5] Viện nghiên cứu cây Công nghiệp tại Định Tường đã thu thập được 250 mẫu giống Viện đã khảo sát và phân loại các giống đậu tương thành 6 nhóm giống: Nhóm [ chín rất sớm có thời gian sinh trưởng dưới 80 ngày, nhóm II chín sớm (80-90 ngày), nhóm TH chín trung bình (90-100 ngày), nhóm IV chín trung bình muộn (100-110 ngày), nhóm V chín muộn (110-120 ngày), nhóm VI chín rất muộn (trên 120 ngày) Tác giả nhấn mạnh khái niệm chín sớm, chín trung bình và chín muộn cần gắn liền với vị trí địa lý và mùa vụ nhất định Do điều sinh thái và nhu cầu sử dụng bộ giống đậu tương khác nhau nên định hướng chọn tạo giống cũng thay đổi đáp ứng nhu cầu sản xuất Ở Việt Nam, đậu tương được trồng 3 vụ/năm Và các phương pháp chọn giống cơ bản là giống nhau thường áp dụng một số kỹ thuật đó là: Tuyển chọn giống thông
qua chọn lọc tập đoàn nhập nội và địa phương, lai hữu tính, đột biến thực nghiệm
Tuyển chọn giống thông qua chọn lọc tập đoàn nhập nội và địa phương Trong giai đoạn 2001-2005, các nhà chọn giống đậu tương Việt Nam đã khảo sát 0482 lượt mẫu giống đậu tương và đã phân lập được 83 mẫu giống đậu tương có đặc tính quý: 4 giống có thời gian sinh trưởng rất ngắn dưới 72 ngày; 6 giống có năng suất cao; 30 dòng kháng bệnh phấn trắng, 25 dòng kháng bệnh gỉ sắt Đánh giá chất lượng 16 giống đậu tương thu thập tại tỉnh Sơn La cho thấy các giống có sự đa dạng và phong phú về hình thái, kích thước và khối lượng hạt Một số giống có hàm lượng protein cao như giống dài Phù Yên (52,7%) và Xanh Phù Yên (51,63%) trong khi đó giống đối chứng DT84 chỉ có 34,97% Vì thế giống này có thể làm vật liệu tốt cho công tác chọn tạo giống có hàm lượng protein cao
Lai hữu tính
Trang 2920
Chọn tạo giống bằng phương pháp đột biến
Xử lý đột biến cũng là một kỹ thuật được các nhà chọn giống đậu tương Việt Nam áp dụng và cho kết quả tốt trong việc chọn tạo giống đậu tương Vì vậy phương pháp chọn tạo giống đậu tương chủ yếu của Viện Di truyền Nông là lai tạo và đột
biến địa phương và nhập nội Trong 20 năm (1985-2005) Viện Di truyền Nông
nghiệp đã chọn tạo thành công 4 giống quốc gia và 4 giống khu vực hoá bằng phương pháp đột biến hoặc kết hợp đột biến và lai tạo Thực tế cho thấy trong giai đoạn 1985-2005 đã có 5 giống đậu tương được công nhận là giống quốc gia được
tạo ra bằng phương pháp xử lý đột biến
2.6 Một số đặc tính đã được cải thiện ở cây đậu tương bằng kỹ thuật di truyền Tính đến thời điểm năm 2008, việc chuyển gen đã được áp dụng cho trên 60
loại cây trồng, với gần 200 tính trạng được chuyển gen, trong đó nghiên cứu và ứng dụng nhiều nhất là các tính trạng sau:
Chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ
Là nghiên cứu được ứng dụng nhiều nhất trên các loại cây trồng Năm 2008, nghiên cứu và ứng dụng nhiều tính trạng kháng thuốc diệt cỏ được áp dụng trên các loại cây trồng tính theo thứ tự giảm dân là: đậu tương, ngô, cải canola, bông, diện tích cây trồng kháng thuốc diệt cỏ lên đến 79 triệu ha chiếm 63% Phần lớn các trang trại trên thế giới có diện tích canh tác lớn, để giảm chỉ phí diệt cỏ bằng lao động thủ công, việc ứng dụng chuyển gen chịu thuốc diệt cỏ đã mang lại lợi nhuận cao cho các trang trại do giảm được đáng kể phần chi phí thuê lao động làm cỏ Đậu tương chịu thuốc diệt cỏ khuyến khích áp dụng kỹ thuật gieo trồng không lên luống nhằm bảo vệ đất Các giống đậu tương chuyển gen hoàn toàn tương tự như các giống đậu tương mẹ về dinh dưỡng, cấu tạo và phương thức chế biến thành thực phẩm và
thức ăn gia súc (Clive Jame, 2008)[ 15]
Chuyển gen kháng sâu hại và chịu han (gen Bt)
Trang 3021
tương (kháng sâu phá hoại thân lá và quả) Nam 2008, diện tích trồng bong Bt chiếm 82 % diện tích bông trên thế giới, tăng nhiều so với tỷ lệ 66% trong năm 2007 (Clive
Jame, 2008)[15]
Chuyển gen nâng cao hàm lượng dầu
Với đậu tương được chuyển gen tạo ra các giống có hàm lượng cao axit oleic, axit béo có một liên kết không no Theo các nhà dinh dưỡng, chất béo không no được xem là tốt hơn so với các chất béo no có trong thịt bò, lợn, phomat, và một số thức ăn thường ngày khác Dầu chế biến từ các giống đậu tương này có giá trị dinh dưỡng như đầu lạc và dầu oliu Đậu tương thông thường có thành phần axit oleic là 24% trong khi đó với các giống đậu tương mới được chuyển gen thành phần axit oleic lên tới trên 80% Các giống đậu tương được chuyển gen được trồng tại
Australia, Canada, MY va Trung Quéc (Clive Jame, 2008)[15]
.Chuyén gen tao cay CNSH da tinh trang
Hướng nghiên cứu ứng dụng CNSH trong chọn tạo giống cây trồng nói chung và cây đậu tương nói riêng là việc tạo ra cây trồng CNSH đa tính trạng bằng việc chuyển nhiều gen cho một giống cây trồng Cho đến nay, cây trồng CNSH đa tính trạng được canh tác tại 10 quốc gia trên thế giới, bao gồm 3 quốc gia là nước phát triển (Mỹ, Canada, Australia) và 7 quốc gia là nước đang phát triển (Philipin, Mexico, Nam Phi, Honduras, Chile, Colombia,và Argentina) Năm 2008, diện tích
canh tác cây trồng CNSH đa tính trạng đạt 28,9 triệu ha (năm 2007 là 21,8 triệu ha)
Mỹ là quốc gia đứng đầu về diện tích cây trồng CNSH đa tính trạng, trong số 62,5 triệu ha cây trồng CNSH ở Mỹ có tới 41% diện tích canh tác cây trồng CNSH đa tính trạng Trong tương lai gần, cây trồng CNSH đa tính trạng sẽ được chuyển các gen có khả năng kháng thuốc diệt cỏ, chịu hạn, giàu thành phần omega-3 (đậu tương) và có hàm lượng pro-Vitamin A cao (gạo vàng, đậu tương vàng) Hiện nay, giống đậu tương và giống ngô CNSH đa tính trạng phát triển nhanh nhất ở Hoa Kỳ là giống mang 3 tính trạng, có khả năng kháng sâu, bệnh và chịu thuốc diệt cỏ Năm 2010, Mỹ dự kiến đưa vào thương mại hoá và trồng trên diện tích rộng giống ngô SmartStax”M được chuyển 8 gen quy định nhiều tính trạng khác nhau, có khả năng chịu nhiều loại sâu, bệnh và chịu được nhiều loại thuốc diệt cỏ
Trang 3122
trên thế giới tập trung phát triển Còn nhiều bàn luận về việc sử dụng sản phẩm cây
trồng CNSH, tuy nhiên thời gian gần đây, bàn luận có chiều hướng mang tính tích
cực, những tranh cãi gay gắt về việc hạn chế canh tác và sử dụng sản phẩm cây trồng
CNSH có phần giảm đi
Thực tế sản phẩm CNSH đã mang lại lợi nhuận kinh tế, bảo vệ môi trường, xoá đói giảm nghèo tại nhiều quốc gia (Clive Jame, 2008)[15]
2.7 Tình hình sản xuất đậu tương chuyển gen trên thế giới và trong nước
2.7.1 Tình hình sản xuất đậu tương chuyển gen trên thế giới
Ung dụng công nghệ sinh hoc trong chon tạo giống đậu tương là hướng mới và hiệu quả trong công tác chọn tạo giống cây trồng nói chung và cây đậu tương nói riêng ở các quốc gia nông nghiệp trên thế giới Trong đó, chọn tạo giống bằng công
nghệ chuyển gen để tạo ra sản phẩm cây trồng chuyển gen được ứng dụng phổ biến
và rộng rãi Cây trồng được ứng dụng chuyển gen thành công đầu tiên là cây cà chua với gen tính trạng chín muộn để tăng hiệu quả kinh tế của sản phẩm
Theo báo cáo của ISAAA, tính đến năm 2008- năm thứ 13 cây trồng CNSH được thương mại hoá, trên thế giới đã có 25 quốc gia canh tác cây trồng CNSH tăng 3 quốc gia so với năm 2007 (từ năm 2007, ISAAA chính thức sử dụng thuật ngữ "Cây trồng CNSH" thay cho tên gọi cũ: "Cây trồng chuyển gen- hay cây trồng GMO" trong đó có 10 quốc gia thuộc nhóm các nước phát triển và 15 quốc gia thuộc nhóm các nước đang phát triển Tổng diện tích cây trồng CNSH năm 2008 đạt 125 triệu ha tăng 15% so với năm 2007 Từ năm 1996 (năm đầu tiên cây trồng CNSH được thương mại hoá) đến năm 2008, diện tích cây trồng CNSH tăng 74 lần, trở thành một công nghệ cây trồng được áp dụng nhanh nhất trong lịch sử nông nghiệp hiện đại thế giới Tỷ lệ tăng nhanh cho thấy cây trồng CNSH đã phát triển tốt và mang lại lợi ích nhiều mặt về kinh tế, môi trường, xã hội và xoá đói giảm nghèo Tính đến thời điểm năm 2008, 8 quốc gia dẫn đầu có diện tích cây trồng CNSH đạt trên 1 triệu ha, sắp xếp theo thứ tự giảm dần là: Hoa Kỳ (62.5 triệu ha), Argentina
(21 triệu ha), Braxin (15,8 triệu ha), Ấn Độ (7,6 triệu ha), Canada (7,6 triệu ha),
Trung Quốc (3,8 triệu ha), Paraguay (2,7 triệu ha), và Nam Phi (1,8 triệu ha) Các nước đang phát triển đã từng bước giữ vai trò quan trọng đối với phát triển của cây
CNSH, điển hình là Ấn Độ, từ vị trí thứ 23 (năm 2007), Ấn Độ đã vươn lên trở thành
Trang 3223
gia còn lại, sắp xếp theo diện tích cây trồng CNSH gidm dan 1a: Uruguay, Bolovia, Phillipin, Australia, Mexico, Tây Ban Nha, Chile, Colombia, Honduras, Burkina
Faso, CH Séc, Rumani, Bồ Đào Nha, Đức, Ba Lan, Slovakia và Ai Cập Theo thống
kê của ISAAA, trong các loại cây trồng CNSH đang được thương mại hoá trên thế giới tính đến năm 2008, cây đậu tương CNSH có diện tích canh tác cao nhất đạt 65,8 triệu ha chiếm 53% diện tích cây trồng CNSH, tiếp theo là ngô CNSH chiếm 30%, bông CNSH chiếm 15% Các quốc gia có tỷ lệ diện tích trồng cây đậu tương CNSH cao nhất gồm: Mỹ, Argentina, Braxin, Paraguay, Uruguay, Bolovia, Tây Ban Nha Trong đó Mỹ có tới 80% diện tích đậu tương được trồng đậu tương CNSH (Clive
Jame, 2008)[15]
2.7.2 Tình hình sản xuất đậu tương chuyển gen ở Việt Nam
Việc ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống đậu tương ở Việt Nam vẫn còn rất hạn chế Một số lượng nhỏ các nghiên cứu liên quan đến công nghệ sinh học cũng đã bắt đầu được triển khai ở Việt Nam Nguyễn Thuý Điệp và cs, (2005) nghiên cứu về khả năng tái sinh của một số giống đậu tương phục vụ cho kỹ
thuật chuyển gen cho thấy môi trường MS-B5 có bổ sung 10mg/1 2,4D cho tỷ lệ tạo
callus cao nhất từ mẫu lá mầm, giống cho tỷ lệ tạo callus cao là DT96 (73%), DT90
(61,7%); DT84 (61,5%) Tỷ lệ tạo chồi cao nhất là ở môi trường MS-BŠ + Img/I
zeatin +0,2mg/I GA3 + 30mg/1 Glutamin saccaroza + 0,3% phytagel (Trần Thị Cúc Hoà và cs, 2007) [8] công bố các kết quả nghiên cứu thử nghiệm về chuyển gen trên cây đậu tương bao gồm: (¡) Nghiên cứu khả năng đáp ứng chuyển gen của một số giống đậu tương trồng tại Việt Nam, đưa ra kết luận có 5 giống có thể sử dụng làm
vật liệu chuyển gen; (¡) Đánh giá hiệu quả tạo dòng đậu tương biến đổi gen bằng
phương pháp nốt lá mầm qua trung gian 1a Agrobacterium tumefaciens, higu quả chuyển gen của các dòng thử nghiệm đạt từ 1,5 đến 5% Phòng thí nghiệm trọng điểm về Công nghệ Tế bào Thực vật thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp, Bộ Nông
Nghiệp và Phát triển Nông thôn đã bắt đầu nghiên cứu chuyển gen chịu hạn từ cây
Trang 3324
Do hạn chế về thiết bị, kiến thức, và nguồn vật liệu, việc nghiên cứu mới chỉ dừng ở mức độ phòng thí nghiệm và thử nghiệm trên diện hẹp, chưa thể đưa cây đậu tương chuyển gen vào sản xuất thương mại trong tương lai gần
2.8 Những nghiên cứu về gen GmWAC
Hạn hán là yếu tố bất lợi cho sự tăng trưởng và phát triển của cây trồng và thường dẫn đến thiệt hại đáng kể về năng suất kinh tế của cây, như là cây đậu nành (glycine max.L) NAC là nhân tố phiên mã, gồm có một họ lớn TEs chuyên biệt của
thực vật, cụ thể đã được thông báo để tăng cường chịu hạn ở một số thực vật Trong
nghiên cứu này, 3l unigens có chứa đầy đủ các khung đọc mở mã hoá cho các protein GmNAC đã được xác định và sinh sản vô tính từ đậu tương
Phân tích trong vùng điều chỉnh có dấu hiệu kết thúc là "C" đã sử dụng nấm men, trong số 31 protein GmNAC, 28 có hoạt động kích hoạt phiên mã và sự biểu hiện những gen GmWAC này là khác nhau trong mỗi cơ quan khác nhau, và nó có chức năng đa dạng trong quá trình phát triển của cây trồng (Guo.Y và cs, 2006)[19] Lần đầu tiên, dòng đậu tương biến đổi gen có khả năng kháng hạn rất cao đã được tạo ra khi chúng được biến nạp gen điều khiển- A: DREB2A Bộ gen của đậu tương đã được giải mã hoàn toàn tạo điều kiện cho nghiên cứu toàn diện gen điều khiển (transcription factors) ở đậu tương Ở đậu tương có tổng số 208 gen điều khién (translations factors) thuộc nhóm MAC/NAM chiếm 4% trong tổng số họ thực
vật (Wang va cs, 2010)[30]
Thực vật thường xuyên phải chịu đựng những tác động xấu của môi trường Theo các kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng, khả năng đáp ứng lại với các điều kiện bất lợi của môi trường (stress) ở thực vật là tính trạng đa gen Các gen trong nhóm gen đáp ứng ở các mức độ khác nhau và ở từng mô cơ quan khác nhau Trong các nhân tố ảnh hưởng lớn tới các thực vật đất, chủ yếu là tác động của nhiệt độ và sự thấm lọc, bao gồm hạn hán và nồng độ muối cao Ví dụ như hạn hán hiện đang được coi là một trong những nguyên nhân chính ảnh hưởng đến năng suất cây trồng Điều kiện hạn hán sẽ làm cho thực vật tạo ra hàng loạt phản ứng sinh hóa và sinh lý để
Trang 3425
giảm hô hấp và quang hợp, giảm thể tích nước trong các mô thực vật, quá trình sinh trưởng chậm lại, tích luỹ và gia tăng mức độ biểu hiện của các protein: kinase, transcription factor (nhân tố phiên mã), phosphatases, proteases, late embryogenesis abundant (LEA), các protein sinh tổng hợp Abscisic acid (ABA), các protein sinh tổng hợp đường (proline, mamnitol, sorbitol) và hàng loạt các protein chức năng khác tham gia vào quá trình chịu hạn ở thực vật Các protein tham gia vào quá trình chống hạn của thực vật được phân thành hai nhóm: nhóm protein chức năng trực tiếp chống
lại điều kiện hạn (ABA, LEA, proline, mamnitol, sorbitol ) và nhóm protein điều
khiển sự biểu hiện của các gen chức năng tham gia vào quá trình chịu hạn (transcription factor, kinase ) Rất nhiều protein điều khiển quá trình phiên mã (transcription factor) được phát hiện trong điều kiện hạn Thực nghiệm đã chứng tỏ rằng nhóm protein này đóng vai trò quan trọng trong cơ chế điều hòa và tăng cường
tính kháng hạn ở thực vật (Wang và cs, 2010)[30]
Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, sự biểu hiện của một hoặc một nhóm gen điều khiển sẽ dẫn tới sự hoạt động và tăng cường của các gen trong một nhóm gen quy định tính trạng đa gen Nghiên cứu về hệ gen đã đưa ra kết luận gen điều khiển chiếm 6-9% tổng số gen trong mỗi hệ gen, ví dụ ở Arabidopsis có 2057 gen điều
khiển được phát hiện trên tổng số 26.000 gen trong hệ gen Rất nhiều nghiên cứu về
Trang 3526
chống lại các stress Gần đây thêm một ho khác 1a NAC (NAM, ATAF va CUC)
cũng có chức năng tương tự Hầu hết các nhân tố phiên mã này điều khiển biểu
hiện gen đích thông qua việc bám vào các cis-element trong promoter cla cdc gen liên quan tới stress Hai nhóm cis-element chính liên quan tới stress hạn được bám bởi các nhân tố phiên mã là DRE (drought-responsible element) bám bởi nhân tố DREB hoặc CBF và ABRE (abscisic acid-responsive element) được nhận dạng bởi nhân tố phiên mã bZIP Nhiều báo cáo cho thấy rằng, tăng cường biểu hiện các
nhân tố phiên mã cảm ứng bởi stress như DREBIA, DREB2A, SNACI, CBE4,
OSISAPI làm tăng khả năng chống chịu lên điều kiện hạn hán, muối và nhiệt độ thấp ở Arabidopsis và các loài khác
Nhóm gen điều khiển quá trình phiên mã (gene transcription factor) đang là trọng tâm chú ý trong các nghiên cứu tăng cường tính chống chịu với điều kiện thời tiết bất lợi (stress) ở thực vật Khi cây bị stress, gen điều khiển hoạt động Các protein
điều khiển quá trình phiên mã được tổng hợp và bám vào trật tự DNA đặc hiệu (cis
acting element) trong đoạn điều khiển gen (promoter) của các gen chức năng tham gia điều khiển tính chịu stress và cùng với enzym sinh tổng hợp RNA (RNA polymerase) thực hiện quá trình phiên mã (biểu hiện) các gen chức năng này Các nghiên cứu đoạn điều khiển gen đã phát hiện rất nhiều gen chức năng tham gia điều khiển tính chịu stress chứa trật tự DNA đặc hiệu Vì vậy, khi một gen điều khiển biểu hiện sẽ sản sinh ra các protein bám vào trật tự DNA đặc hiệu trên đoạn điều khiển gen của nhiều gen
chức năng tham gia điều khiển tính chịu stress và hoạt hoá sự biểu hiện của các gen
này, kết quả là thực vật tăng cường tính chống chịu với môi trường Điều này giải thích vì sao tính trạng chống lại các điều kiện bất lợi (stress) là tính trạng đa gen
nhưng chỉ cần chuyển một gen điều khiển tính chịu hạn có thể làm tăng sức chống
hạn của cây chuyển gen Các trình tự điều khiển nằm phía trước các gen này cũng
đang được đặc biệt quan tâm và nghiên cứu (Guo.Y và cs, 2006) 19]
2.9 Gen gus
Trang 36ứng để nhận biết sự tồn tại của gen gus A (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-B-D- glucuronide) Dung dịch X-Gluc không màu dưới tác động của enzym ÿ- glucuronidase sé chuyén sang mau xanh cham dac trung cl o-glucuronic cl OH Br \ acid Ê-glucuronidase Bì N —————> NH NH + glucuronic X-Bluc ⁄⁄ oxidation mĩ i p dimerization imeri Br NH Br 0 cl 5,5'-dibromo-4, 4'-dichloro-indigo Gnsoluble, colored)
Hinh 2.6 Phan img tao ra san pham 5,5’-dibromo-4,4’-dicloro-indigo cé mau xanh
2.10 Cac gen chi thi chon loc va cac gen thong bao trong hé thong vecto bién nap
Ở tất cả các hệ thống biến nạp tỷ lệ cây tiếp nhận DNA bền vững thường là rất thấp Vì vậy, người ta phải có phương pháp để phân biệt rất ít cây biến nạp từ một lượng lớn cây không biến nạp Thực tế để xác định những cây được biến nạp người ta sử dụng hệ thống gen chọn lọc Đặc biệt ưa thích là hệ thống chọn lọc trội,
có nghĩa là chỉ những cây biến đổi gen có thể tái sinh và phát triển Ngược lại, ở một
Trang 3728
Bên cạnh kháng kanamycin cũng có một loạt các hệ thống chọn lọc khác
được sử dụng Có ý nghĩa là những gen kháng trội, ngoài neomycin phosphotransferase, còn có hygromycin B phosphotransferase và 3-enolpyruvyl shikimate 5-phosphatsynthetase (EPSP-synthetase)
Bên cạnh những gen chọn lọc cũng có những gen chỉ thị (reporter øene) Gen chỉ thị không chọn lọc trội, nhưng sản phẩm gen của nó được chứng minh dễ
dàng bằng phương pháp hóa sinh, hóa học mô, kính hiển vi hoặc quang kế Ví dụ:
Trang 3829
Phan 3
VAT LIEU, NOI DUNG VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU
3.1 Vật liệu và phạm vi nghiên cứu 3.1.1 Vật liệu thực vật
Vật liệu thực vật trong nghiên cứu được sử dụng là giống đậu tương ĐVN9 được lấy từ Viện Ngô Mẫu đậu tương hiện đang được lưu giữ tại Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ tế bào thực vật-Viện Di truyền Nông nghiệp
3.1.2 Vật liệu vi khuẩn
Để xây dựng được quy trình tối ưu cho việc biến nạp gen vào đậu tương, ban đầu đề tài đã sử dụng các chủng khuẩn được lưu giữ tại Viện Di Truyền: EHA105, AGL-1, GV3101, C58, LBA4404 Các chủng này mang vector trên nền vector pBI chứa gen chỉ thị là g⁄s/gen chọn lọc thực vật ñp (kháng hygromycin) được điều
khiển bởi đoạn khởi động pRD29
Hình 3.1 Cấu trúc vector pBI
Sau khi xác định quy trình tối ưu hoá chuyển gen vào đậu tương Các thí nghiém tiép theo str dung ching vi khudn A tumefaciens AGL-1 mang vector dua trên nền vector pBI (promoter RD29, gen chiu han - GmNAC va hpt - khang hygromycin) Gen GmNAC duoc xác định là một nhân tố phiên mã quan trọng liên quan đến cây chịu hạn và cây chịu nhiệt độ cao, gen này được phân lập từ cây đậu
tương Sự biểu hiện gen GmNAC có thể được gây ra bởi hạn hán, độ mặn cao và đặc
Trang 3930 Cấu trúc vector như sau : LB RB T pRD29 GmNAC ms Hinh 3.2 Cau tric vector dua trén nén vector pBI 3.1.3 Hoa chat va dung cu thi nghiém 3.1.3.1 Hoá chất Các muối đa lượng, vi lượng, vitamin là MS (Murashige & Skoog, 1962), N6 (Chu và cộng sự, 1975) và B5 (Gambor, 1968)
Các chất kháng sinh Genteticine, Paromomycine, Cefotaxine,
Hygromycine , chat din du Acetosyringone (AS), chat b6 sung: yeast extract, beef extract, trytone, sucrose, agarose
Và các hoá chất sử dụng trong sinh học phân tử 3.1.3.2 Máy móc và thiết bị
Các máy móc và thiết bị thí nghiệm chính dùng cho nghiên cứu bao gồm: Tủ -80°C, can dién tử, tủ ổn nhiệt 289C, tủ cấy vô trùng cấp II, máy ly tâm lạnh, bể nước ổn nhiệt, máy PCR, pipette, nồi khử trùng, bộ điện di, máy soi gel và các trang thiết bị khác của phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp
3.1.4 Phạm vỉ nghiên cứu
Đề tài: "Bước đầu khảo sát quy trình chuyển gen chịu hạn GmNAC vào giống đậu tương ĐVN9 thông qua vi khuẩn Agrobaeterium tumefaciens”
Các thí nghiệm chuyển gen vào giống đậu tương ĐVN9 được duy trì trong điều kiện nhân tạo
Phạm vi nghiên cứu của đề tài tập trung vào giống đậu tương ĐVNO với gen
cần chuyển là GmNAC
3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành 3.2.1 Địa điểm
Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm trọng điểm về Công nghệ Tế bào
Thực vật thuộc Viện Di truyền Nông Nghiệp, Từ Liêm, Hà Nội
3.2.2 Thời gian tiến hành
Trang 4031
3.3 Nội dung nghiên cứu
* Noi dung 1: Tối ưu hoá quá trình chuyển gen vào ĐVN9 sử dụng vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens
* Nôi dung 2: Xây dung quy trinh chuyén gen chiu han GmNAC vao dau tuong sit dung vector dua trén nén vector pBI
* Noi dung 3: Phân tích, đánh giá các cây đậu tương sau khi chuyển gen chịu hạn GmNAC
3.4 Phương pháp nghiên cứu
* Nôi dung 1: Tối ưu hoá quá trình chuyển gen vào ĐVN9 sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 3.4.1 Thi nghiém 1: Lua chon ching vi khudn thich hop cho viéc chuyén gen vào ĐVN9 CT 1 2 3 4 5 6 Ching vi Đối > LBA4404 | GV3101 | EHA 105 C58 AGL-1 khuan chứng
3.4.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn (OD600nm) lên khả năng biến nạp gen vào đậu tương thông qua tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus vào ĐVN9
Mật độ vi khuẩn ảnh hưởng tới số lượng vi khuẩn tiếp xúc với mẫu biến nạp do đó có thể ảnh hưởng tới tỷ lệ số vi khuẩn chuyển được đoạn T-DNA vào tế bào thực vật ocr 1 2 3 4 5 6 | OD6eo0 0 0,5 0,8 1 1,2 1,5