Nghiên cứu chuyển gen GmNAC004 vào giống đậu tương đt22 thông qua vi khuẩn agrobacterium để nâng cao khả năng chịu hạn

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM LƯƠNG THANH QUANG NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN GmNAC004 VÀO GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT22 THÔNG QUA VI KHUẨN AGROBACTERIUM ĐỂ NÂNG CAO KHẢ NĂNG CHỊU HẠN Chuyên ngành: Khoa học trồng Mã số: 60.62.01.10 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Văn Đồng TS Nguyễn Thanh Tuấn NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Lương Thanh Quang i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn, tơi nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy cô giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Văn Đồng TS Nguyễn Thanh Tuấn tận tình hướng dẫn, dành nhiều cơng sức, thời gian tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc giúp đỡ nhiệt tình, ý kiến đóng góp q báu ThS Đỗ Thị Như Quỳnh, ThS Trần Duy Hưng Cử nhân Nguyễn Trung Anh suốt trình tơi thực hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Di truyền chọn giống – Khoa Nông học Học viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hồn thành luận văn Cuối xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn./ Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Lương Thanh Quang ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình viii Trích yếu luận văn x Phần Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu đề tài 1.3 Ý nghĩa khoa học, thực tiễn tính đề tài Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Tình hình nghiên cứu phát triển đậu tương 2.1.1 Giới thiệu chung đặc điểm sinh học đậu tương 2.1.2 Giá trị đậu tương 2.1.3 Nghiên cứu phát triển đậu tương giới 2.1.4 Tình hình sản xuất đậu tương Việt Nam 11 2.2 Cơ chế chống chịu yếu tố phi sinh học 12 2.3 Đặc tính chịu hạn số gen liên quan 14 2.3.1 Đặc tính chịu hạn đậu tương 14 2.3.2 Các gen liên quan đến khả chịu hạn đậu tương 15 2.4 Các phương pháp chuyển gen vào thực vật 16 2.4.1 Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium 17 2.5 Một số nghiên cứu chuyển gen vào đậu tương 19 2.5.1 Gen GmDREB2 gen P5CR 19 2.5.2 Gen GmNACs 20 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 22 3.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 22 3.2 Vật liệu nghiên cứu 22 3.3 Nội dung nghiên cứu 25 3.4 Phương pháp nghiên cứu 25 3.4.1 Phương pháp biến nạp gen vào đậu tương thông qua vi khuẩn 25 3.4.2 Kiểm tra có mặt gen hệ T0 27 3.4.3 Đánh giá khả chịu hạn đậu tương chuyển gen 31 3.5 Các tiêu đánh giá 32 Phần Kết thảo luận 34 4.1 Kết chuyển gen GmNAC004 vào đậu tương 34 4.2 Kết chọn lọc sau đất BASTA 36 4.3 Kết kiểm tra kiểu gen 37 4.3.1 Kết phân tích PCR kiểm tra có mặt gen bar 37 4.3.2 Kết phân tích PCR kiểm tra có mặt promoter RD29A 38 4.3.3 Kết phân tích PCR kiểm tra có mặt gen GmNAC004 39 4.4 Kết kiểm tra có mặt gen GmNAC004 41 4.4.1 Tách ADN tổng số 41 4.4.2 Kết phân tích phương pháp Southern blot 42 4.5 Kết sàng lọc phun BASTA 44 4.6 Kết đánh giá khả chịu hạn 45 4.6.1 Kết PCR kiểm tra có mặt gen GmNAC004 45 4.6.2 Đánh giá nước nhiệt độ phòng sau thu mẫu 46 4.6.3 Đánh giá khả chịu hạn chuyển gen 50 4.6.4 Đánh giá phát triển thân, rễcủa GmNAC004 52 Phần Kết luận đề nghị 61 5.1 Kết luận 61 5.2 Đề nghị 62 Tài liệu tham khảo 63 Phụ lục 69 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens ADN Axit deoxyribonucleic AS Acetosyringone BAP – benzylaminopurine Bar Gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin acetyl transferase CCM Cocultivation medium – môi trường đồng nuôi cấy dNTP Deoxynucleoside triphosphate ĐT22 Giống đậu tương ĐT22 EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic GA3 Gibberelic acid GM Germination medium – môi trường nảy mầm hạt IBA Indole-3-butyric acid OD RM Optical density Rooting medium – môi trường rễ RWC Relative water content – Hàm lượng nước tương đối SEM Shoot elongation medium – môi trường kéo dài chồi SIM Shoot induction medium – môi trường tạo đa chồi T0 Cây chuyển gen hệ thứ Ti-plasmid Tumor-Including Plasmid T-DNA Transfer-DNA v/p vòng/phút YEP Yeast extract peptone DANH MỤC BẢNG Bảng Tình hình sản xuất đậu tương giới năm gần Bảng Tình hình sản xuất đậu tương nước đứng đầu Thế giới năm gần 10 Bảng Tình hình sản xuất đậu tương Việt Nam năm gần 11 Bảng Thông tin vector pZY101:RD29A:GmNAC004 23 Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR 29 Bảng 3.3 Chu trình nhiệt trình tự mồi phản ứng PCR 29 Bảng 4.1 Kết thí nghiệm chuyển gen GmNAC004 vào đậu tương sử dụng vi khuẩn khuẩn A.tumefaciens 35 Bảng 4.2 Kết phun BASTA câyđậu tươngchuyển gen GmNAC004 36 Bảng 4.3 Kết PCR đậu tương chuyển gen GmNAC004 hệ T0 40 Bảng 4.4 Kết sàng lọc đánh giá dòng đậu tương sau chuyển gen phun BASTA 44 Bảng 4.5 Sự giảm lượng nước tương đối giống chuyển gene qua sau thu mẫu (*p