Nghiên cứu chuyển gen CBF1 và đánh giá biểu hiện trên cây đậu tương (glycine max (l ) merrill)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGÔ THỊ BẢO OANH NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN CBF1 VÀ ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN TRÊN CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX (L.) MERRILL) LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên, năm 2020 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGÔ THỊ BẢO OANH NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN CBF1 VÀ ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN TRÊN CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX (L.) MERRILL) Ngành: Công nghệ sinh học Mã số ngành: 8.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN TIẾN DŨNG GS.TS NGÔ XUÂN BÌNH Thái Nguyên, năm 2020 i LỜI CẢM ƠN Trang đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu nha trường, Ban chu nhiệm khoa Công nghệ Sinh học va Công nghệ Thực phẩm cùng các thầy cô giáo Khoa đa tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu Đặc biệt, em xin bay to lòng biết ơn sâu sắc, gửi lời cảm ơn chân thành tới GS.TS Ngô Xuân Bình va thầy giáo TS Nguyễn Tiến Dũng, giảng viên khoa Công nghệ Sinh học va Công nghệ Thực phẩm đa tận tình chi bảo, giúp đỡ va hướng dẫn em thời gian thực hiện luận văn Cuối em xin gửi lời cảm ơn chân va sâu sắc tới gia đình, người thân va bạn bè đa động viên, giúp đỡ em suốt quá trình học tập va thực hiện đề tai Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng Học viên Ngô Thị Bảo Oanh năm 2020 ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC .ii DANH MỤC BẢNG BIỂU iv DANH MỤC HÌNH ẢNH vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .vii MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tai Mục tiêu nghiên cứu 3 Những đóng góp mới của đề tai Ý nghĩa Khoa học va thực tiễn của đè tài luận án Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc va phân loại đậu tương 1.2 Đặc tính chống chịu của đậu tương 1.3 Tình hình sản xuất đậu tương nước va thế giới 1.3.1 Trên thế giới 1.3.2 Tại Việt Nam 1.4 Đặc điểm của gen CBF1 10 1.4.1 Đặc điểm gen CBF1 10 1.4.2 Các nghiên cứu về gene CBF1 10 1.5 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens va quá trình chuyển gen vao trồng 12 1.5.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 12 1.5.2 Cấu trúc va chức của Ti-Plasmid 13 1.5.3 Cấu trúc va chức T-DNA 13 1.5.4 Cơ chế phân tư của việc chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens 14 Chương VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Vật liệu nghiên cứu 16 2.1.1 Vật liệu thực vật 16 2.1.2 Vật liệu di truyền 16 2.1.3 Hóa chất 16 2.1.4 Thiết bị thí nghiệm 17 2.2 Địa điểm nghiên cứu 18 2.3 Nội dung nghiên cứu 18 2.4 Phương pháp nghiên cứu 18 2.5 Phân tích, đánh giá sau chuyển gen 21 2.6 Chọn lọc dòng chuyển gen phun chất diệt co Basta 24 2.7 Các chi tiêu đánh giá 24 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Kết quả biến nạp gen CBF1 vao giống đậu tương DT22, cọc chùm, Cúc Ha Bắc thông qua vi khuẩn A tumefaciens 25 3.1.1 Kết quả biến nạp gen CBF1 vao giống đậu tương DT22 25 3.1.2 Kết quả biến nạp gen CBF1 vao giống đậu tương cọc chùm 31 3.1.3 Kết quả biến nạp gen CBF1 vao giống đậu tương Cúc Ha Bắc 37 3.2 Đánh giá đậu tương chuyển gen dương tính sư dụng phương pháp PCR 44 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47 4.1 Kết luận 47 4.2 Đề nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1 Tình hình sản xuất đậu tương thế giới năm gần Bảng Tình hình sản xuất đậu tương tại Việt Nam năm gần Bảng Kết quả tạo đa chồi của các thí nghiệm chuyển gen CBF1 vao đậu tương DT22 thông qua vi khuẩn A Tumefaciens………………………27 Bảng Kết quả chọn lọc mẫu biến nạp của các thí nghiệm chuyển gen CBF1 vào đậu tương DT22 thông qua vi khuẩn A Tumefaciens 28 Bảng 3 Kết quả chuyển đậu tương sau biến nạp bầu đất của các thí nghiệm chuyển gen CBF1 vào đậu tương DT22 thông qua vi khuẩn A tumefaciens 29 Bảng Kết quả chuyển gen CBF1 vao đậu tương DT22 thông qua vi khuẩn A tumefaciens 30 Bảng Kết quả tạo đa chồi của các thí nghiệm chuyển gen CBF1 vao đậu tương Cọc chùm thông qua vi khuẩn A tumefaciens 33 Bảng Kết quả chọn lọc mẫu biến nạp của các thí nghiệm chuyển gen CBF1 vào đậu tương cọc chùm thông qua vi khuẩn A tumefaciens 34 Bảng Kết quả chuyển đậu tương sau biến nạp bầu đất của các thí nghiệm chuyển gen CBF1 vào đậu tương cọc chùm thông qua vi khuẩn A tumefaciens 35 Bảng Kết quả chuyển gen CBF1 vào đậu tương cọc chùm thông qua vi khuẩn A tumefaciens 36 Bảng Kết quả tạo đa chồi của các thí nghiệm chuyển gen CBF1 vao đậu tương Cúc Ha Bắc thông qua vi khuẩn A tumefaciens 38 Bảng 10 Kết quả chọn lọc mẫu biến nạp của các thí nghiệm chuyển gen CBF1 vào đậu tương Cúc Ha Bắc thông qua vi khuẩn A tumefaciens 40 Bảng 11 Kết quả chuyển đậu tương sau biến nạp bầu đất của các thí nghiệm chuyển gen CBF1 vao đậu tương Cúc Ha Bắc thông qua vi khuẩn A tumefaciens 41 Bảng 12 Kết quả chuyển gen CBF1 vào đậu tương Cúc Ha Bắc thông qua vi khuẩn A tumefaciens 42 Bảng 13 Kết quả tách chiết DNA tổng số của các chuyển gen T0 44 Bảng 14 Đánh giá biểu hiện gen chuyển gen T0 PCR 45 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Sơ đồ cấu trúc Ti-plasmid dạng octopyne 13 Hình Sư tương tác Agrobacterium với tế bao thực vật va chế chuyển T-DNA 15 Hình Sơ đồ quy trình biến nạp gen vao đậu tương 19 Hình Một số hình ảnh quá trình biến nạp gen CBF1 vao giống đậu tương DT22 thông qua vi khuẩn A tumefaciens 26 Hình Hình ảnh chuyển gen tái sinh môi trường SEM (A) va 28 Hình Cây đậu tương chuyển gen thu được sau quá trình biến nạp gen CBF1 vao giống đậu tương DT22 thông qua vi khuẩn A tumefaciens 30 Hình Kết quả biến nạp – tái sinh chồi chuyển gen CBF1 vao giống đậu tương cọc chùm thông qua vi khuẩn A tumefaciens 32 Hình Kết quả mẫu biến nạp kéo dai chồi va rễ 34 Hình Cây đậu tương chuyển gen thu được sau quá trình biến nạp gen CBF1 vao giống đậu tương cọc chùm thông qua vi khuẩn A tumefaciens 36 Hình 10 Kết quả biến nạp – tái sinh chồi chuyển gen CBF1 vao giống đậu tương Cúc Ha Bắc thông qua vi khuẩn A tumefaciens 39 Hình 11 Kết quả mẫu biến nạp kéo dai chồi va rễ 40 Hình 12 Cây đậu tương chuyển gen thu được sau quá trình biến nạp gen CBF1 vao giống đậu tương Cúc Ha Bắc thơng qua vi kh̉n A tumefaciens 42 Hình 13 Hình ảnh sang lọc chuyển gen sau Basta 43 Hình 14 Kết quả phân tích PCR chuyển gen T0 46 vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CCM Cocultivation medium - Môi trường đồng nuôi cấy cDNA Complementary DNA CTAB Hexadecyltrimethylammonium bromide LB Luria-Bertani OD600 kế Mật độ vi khuẩn đo bước sóng 600 nm quang phổ PCR Polymerase Chain Reaction PCR Polymerase Chain Reaction RM Rooting medium - Môi trường rễ SEM Shoot elongation medium - Môi trường kéo dai chồi SIM Shoot induction medium - Môi trường tạo đa chồi 41 Lần 56 3,57 Lần 53 11,32 Lần 10 43 9,30 Tổng cộng 605 59 15 9,75 Kết quả chọn lọc từ 605 mẫu môi trường SIM2 thu được tổng số 59 chồi tái sinh môi trường chọn lọc SEM (tỷ lệ 9,75%), số chồi đu tiêu chuẩn chuyển sang môi trường tạo rễ la 15 chồi (Bảng 3.10, Hình 11) Cây chuyển gen được chuyển chậu đất va trồng nha lưới cho đến trưởng Kết quả biến nạp của 10 thí nghiệm đa thu được 11 đậu tương chuyển gen T0 sống sót sau chuyển trồng điều kiện nha lưới (Hình 12) Cây chuyển T0 tiếp tục được chọn lọc thuốc trừ co basta va PCR Bảng Kết chuyển đậu tương sau biến nạp bầu đất thí nghiệm chuyển gen CBF1 vào đậu tương Cúc Hà Bắc thông qua vi khuẩn A tumefaciens Chồi sống sót sau chọn lọc tạo rễ Số sống sót mơi trường RM sau đất Lần 2 Lần 1 Lần 0 Lần Lần 2 Lần 2 Lần Lần Lần 1 Lần thí nghiệm 42 Lần 10 Tổng cộng 0 15 11 Hình 12 Cây đậu tương chuyển gen thu sau trình biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương Cúc Hà Bắc thông qua vi khuẩn A tumefaciens Bthông qError! Bookmark not defined K2EQ B qchuy B qua vi khuẩn A tumefaciensCúc Hà Bua thông qua vi khuuẩn A tumefacien Số sống Số sống sót Hiệu suất sót sau sau phun biến nạp đất kiểm tra basta (%) Lần thí Số mẫu biến nghiệm nạp (mẫu) Lần 72 1,38 Lần 75 1 1,33 Lần 62 0 Lần 66 0 Lần 71 0 Lần 59 1,69 43 Lần 62 0 Lần 57 1 1,75 Lần 55 1 1,82 Lần 10 43 0 Tổng cộng 622 11 0,8 Qua kết quả bảng 3.12 ta thấy: sau 10 lần thí nghiệm chuyển gen cấu trúc pER10-pUBQ14:CBF1 với 622 mẫu đậu tương Cúc Ha Bắc được biến nạp thu được 11 chuyển gen T0 sống sót Kết quả sang lọc thuốc trừ co basta thu được kháng thuốc Hiệu suất chuyển gen đạt 0,8% cao ba giống đậu tương được sư dụng cho chuyển gen (Cọc chùm 0,48% va DT22 0,56%) Hình 13 Hình ảnh sàng lọc chuyển gen sau ngày Basta Ghi chú: lá) (A) Lá không chuyển gen bị chết quét Basta (vạch kẻ màu vàng (B) chuyển gen CBF1 kháng lại Basta Vạch kẻ ngang giữ vị chí quét Basta để sàng lọc chuyển gen (C) Cây chuyển gen sàng lọc phương pháp phun Basta Mũi tên không chuyển gen bị chết khơng có khả kháng Basta 3.2 Đánh giá đậu tương chuyển gen dương tính sử dụng phương pháp PCR Kết quả chọn lọc thuốc trừ co Basta thu được tổng số 14 chuyển gen T0 cả giống DT22, Cọc chùm va Cúc Ha Bắc Để kiểm tra sư có mặt của gen chuyển CBF va gen Bar các T0 được kiểm tra PCR DNA tổng số được tách từ mẫu lá non của các dòng chuyển gen theo kít DNeasy Plant Mini Kit của hang QIAGen (https://www.qiagen.com/) Mẫu được hòa loang với 100l dung dịch TE va kiểm tra nồng độ DNA máy Nanodrop Kết quả kiểm tra cho thấy các mẫu cho kết quả A260/A280 mức cho phép 1.81-2.02 (Bảng 3.13) Nồng độ DNA dao động từ 192,3 đến 359,3 ng/l Kết quả cho thấy các mẫu DNA hoàn toàn đảm bảo độ tinh sạch va nồng độ để thực hiện các thí nghiệm phân tích PCR B Kết qu5 K3EQ Bảng_3 \* ARABIC A tổng số chuyển gen Cây số Giống A260/A280 ng/l DT22 1,89 310,8 1,92 303,8 1,95 198,5 1,91 195,8 1,89 287,5 1,92 305,8 2,00 205,5 1,98 192,3 2,02 192,5 10 1,94 213,6 Cọc chùm 11 1,99 314,4 12 1,81 159,2 13 1,90 302,2 14 1,94 359,3 Cúc Ha Bắc Để kiểm tra sư có mặt của gen chuyển CBF1 va bar tiến hanh kiểm tra PCR với cặp mồi CBF1F/CBF1R va BarF/BarR Kết quả cho thấy tất cả các chuyển gen đều mang gen chuyển CBF1 với kích thước tương ứng (Bảng 3.14 va hình 14) Bảng Đánh giá biểu gen chuyển gen T0 PCR Kết PCR Cây số Kháng Basta CBF1F/CBF1R BarF/BarR x + + x + + x + + x + + x + + x + + x + + x + + x + + x + + 10 x + + 11 x + + 12 x + + 13 x + + 14 x + + Ghi chú: (x): kháng basta; (+): Dương tính Hình 14 Kết phân tích PCR chuyển gen T0 Ghi chú: (A) Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi gen CBF1F/CBF1R; (B) Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi gen BarF/BarR M: DNA marker, từ 1-14: số thứ tự mẫu Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận  Kết quả chuyển gen CBF1 đa thu được số đậu tương sống sót sau quá trình chọn lọc: • DT22: 30 • Cọc chùm: 13 • Cúc Ha bắc: 15 Số đậu tương chuyển gen CBF1 sống sót sau bầu đất: • DT22: 12 • Cọc chùm: • Cúc Ha bắc: 11  Số đậu tương chuyển gen CBF1 sống sót sau sàng lọc phun Basta: • DT22: • Cọc chùm: • Cúc Ha bắc: Hiệu quả biến nạp gen thông qua chủng vi khuẩn A tumefaciens mang vector pER10-pUBQ14:CBF1 vao giống đậu tương Cúc Ha Bắc la cao đạt 0,8%, sau đến giống đậu tương DT22 đạt 0,56% va thấp giống đậu tương Cọc chùm đạt 0,48% Kết quả sang lọc chuyển gen thuốc trừ co basta va phân tích PCR đa xác định được 14 đậu tương có phản ứng dương tính với gen đích CBF1 4.2 Đề nghị Tiếp tục nghiên cứu chuyển gen vao số giống đậu tương địa phương khác Tiến hanh thí nghiệm khẳng định lại sư có mặt của gen đích ước đoán số bản copy phương pháp Southern blot của dòng chuyển gen thu được Tiếp tục đánh giá va chọn lọc kiểm tra đậu tương chuyển gen thế hệ T1, T2 va T3 để kiểm tra đặc tính của chuyển gen qua các thế hệ TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Ngô Thế Dân, Trần Đình Long, Trần Văn Lai, Đỗ Thị Dung, Phạm Thị Đao (1999), Cây đậu tương, Nxb Nông nghiệp Phạm Hoang Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Quyển I, Nha xuất bản Trẻ Trần Văn Điền (2007), Cây đậu tương, NXB Nông nghiệp, Ha Nội Nguyễn Huy Hoang (1992), Nghiên cứu khả chịu hạn giống đậu tương nhập nội miền Bắc Việt Nam, Luận án phó tiễn sỹ, Ha nội Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoang Mậu, Nguyễn Phú Hùng, Lê Thị Thanh Hương (2005), “Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh hóa va nhân gen dehydrin của số giống đậu tương địa phương vùng núi phía Bắc Việt Nam” Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc – Nghiên cứu khhoa học sống - Đại học Y Ha nội NXB KHKT Ha nội, 2224 – 2227 Trần Thị Phương Liên (1999), “Nghiên cứu đặc tính hóa sinh va sinh học phân tư của số giống đậu tương có khả chịu nóng, chịu hạn Việt Nam’’, Luận án tiến sỹ sinh học, Viện công nghệ sinh học, Ha nội Chu Hoàng Mậu (2001), “Sư dụng phương pháp đột biến thực nghiệm để tạo các dòng đậu tương va đậu xanh thích hợp cho miền núi Đông Bắc Việt Nam”, Luận án tiến sỹ sinh học, Viện công nghệ sinh học, Ha nội TÀI LIỆU TIẾNG ANH Singh, Ram J.; Nelson, Randall L.; Chung, Gyuhwa (2006) Genetic Resources, Chromosome Engineering, and Crop Improvement: Oilseed Crops, Volume London: Taylor & Francis tr 15 Hymowitz, Theodore (1995) “Evaluation of Wild Perennial Glycine Species and CrossesFor Resistance to Phakopsora” Trong Sinclair, J.B.; Hartman, G.L Proceedings of the Soybean Rust Workshop Urbana, IL: National Soybean Research Laboratory tr 33–37 10 Newell, C A; Hymowitz, T “Hybridization in the Genus Glycine Subgenus Glycine Willd (Leguminosae, Papilionoideae)” American Journal of Botany : 70 (3): 334–348 11 AF Garay va Wallace Wilhelm (1983), “Root System Characteristics of Two Soybean Isolines Undergoing Water Stress Condition”, Agronomy Journal, Vol 75 12 Lakshmi P Manavalan & Satish K Guttikonda & Vinh T Nguyen & J Grover Shannon & Henry T Nguyen (2009), “Evaluation of diverse soybean germplasm for root growth and architecture”, Plant Soil 13 Tetsuji Oya, Alexandre Lima Nepomuceno, Norman Neumaier, Jose Renato Boucas Rarias, Satoshi Tobita va Osamu Ito (2004), “Drought tolerance characteristics of Brazilian soybean cultivars evaluation and characterization of drought tolerance of various Brazilian soybean cultivars in field”, Plant Prod.Sci (2): 129-137 14 Mary Dell Chilton, Randall K Saiki, Narendra Yadavt, Milton P Gordon and Francis Quetieri (1980), “T-DNA from Agrobacterium Ti plasmid is in the nuclear DNA fraction of crown gall tumor cells”, Proc Nati Acad Sci USA, Vol 77, No 7, pp 4060-4064 15 Mutasim M Khalafalla, Hany A El-Shemy, Shaikh M Rahman, Masayoshi Teraishi, Hisakazu Hasegawa, Teruhiko Terakawa and Masao Ishimoto, “Efficient production of transgenic soybean (Glycine max [L] Merrill) plants mediated via whisker-supersonic (WSS) method”, African Journal of Biotechnology Vol (18), pp 1594-1599 16 Tzvi Tzfira and Vitaly Citovsky (2006), “Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology”, Current Opinion in Biotechnology, 17:147-154 17 Genlvin S.B (2000), “Agrobacterium and plant genes involved in T- DNA transfer and intergration”, Rev Plant Physiol Biology (51), pp 223-256 18 Hookaas P.J.J., and Beijersbergen, A.G.M (1994), “The virulence system of Agrobacterium tumefaciens” Ann.Rev Phytopathol 32: 157-179 19 Lan-Ying Lee and Stanton B Gelvin (2008), “T-DNA Binary Vectors and Systems”, Plant Physiology, Vol 146, pp 325-332 20 R Walden, B Reiss, C Koncz, and J Schell (1997), “The impact of Tiplasmid-derived gen vector on the study of the mechanism of action of phytohormones”, Annu Rev Phytopathol 35:45-66 21 Tetsuya Yamada, Satoshi Watanabe, Maiko Arai, Kyuya Harada, Keisuke Kitamura (2010),"Cotyledonary node pre-wounding with a micro-brush increased frequency of Agrobacterium-mediated transformation in soybean”, Plant Biotechnology, 27, 217-220 22 Mutasim M Khalafalla, Hany A El-Shemy, Shaikh M Rahman, Masayoshi Teraishi, Hisakazu Hasegawa, Teruhiko Terakawa and Masao Ishimoto, “Efficient production of transgenic soybean (Glycine max [L] Merrill) plants mediated via whisker-supersonic (WSS) method”, African Journal of Biotechnology Vol (18), pp 1594-1599 23 Gustavo A., Cabrera J., (1998), “The Agrobacterium tumefaciens: a natural tool for plant transformation”, Plant Cell Report (26), pp 1-11 24 Hookaas P.J.J., and Beijersbergen, A.G.M (1994), “The virulence system of Agrobacterium tumefaciens” Ann.Rev Phytopathol 32: 157-179 25 Hooykass P.J.J., Schilperoort, R.A (1992), “Agrobacterium and plant genetic engineering”, Plant Molecular Biology (35), pp 205-218 26 Hille J., Wullems G., Schiperoort R.A., (1983), “Non-oncogenic T- Region mutants of Agrobacterium tumefaciens transfer T-DNA into plant cells”, Plant Molecular Biology (2), pp 155-163 27 Kirankumar S Mysore, Burgund Bassuner, Xiao-bing Deng, Nune S Darbinian, Andrei Motchoulski, Walt Ream, and Stanton B Gelvin (1998), “Role of the Agrobacterium tumefaciens VirD2 Protein in T-DNA Transfer and Integration”, MPMI, Vol 11, No 7, pp 668-683 28 Michal Sharabi- Schwager, Amnon Lers, Alon Samach, Charles L Guy and Ron Porat (2009), “Overexpression of the CBF2 transcriptional activator in Arabidopsis delays leaf senescence and extends plant longevity’’, Journal of Experimental Botany, Vol 61, No 1, pp 261–273 29 http://soybeanbreederstoolbox.org/ 30 El Kayal W, NavarroM, Marque G, Keller G, Marque C, Teulieres C (2006) Ex pression profile of CBF- like transcriptional factor genes from Eucalyptus in response to cold J Exp Bot.57: 2455- 2469 31 Kasuga M, Miura S, Shinozaki K, Yamaguchi- Shinozaki K (2004) A combination of the Arabidopsis DREB1A gene and stress- induciblerd 29 Apromoter impeoved drought and low- temperature stress tolerance in tobacco by gene transfer Plant Cell Physiol 45: 346- 350 32 Tổng cục thống kê (2010), Niên giám thống kê 2009, NXB Thống kê, Ha Nội 33 Jorgensen, R.A., Cluster, P.D., English, J., Que, Q., and Napoli, C.A (1996), “Chalcone synthase cosuppression phenotype in petunia flowers: comparison of sense vs antisense constructs and single-copy vs complex TDNA sequences” Plant Mol.Biol 31: 957-973 34 http://www.fao.org/faostat/en/#data/QC 35 https://www.gso.gov.vn 36.Yoshida, T., Fujita Y., et al (2010), AREB1, AREB2, and ABF3 are master transcription factors that cooteratively reglate ABRE dependent ABA signation, The Plant Journal, 61(4) pp 672- 685 37 Jian Lia, Yaqing Wâng, BoYua, Qiping Songa, Yang Liua Tony, H H Chenb Gang Lia Xinghong Yanga “Ectopic expression of StCBF1 have difirent functions in response to freezing and drought stresses in Arabidopsis” Plant science Pp 221- 233 38 Singh S, Rathore M, Goyary D, Singh RK, Anandhan S, Sharma DK, Ahmed Z “carrot antifreeze protein enhances chilling tolerance in transgenic tomato”, Haldwani 263 39 Paz MM, Martinez JC, Kalvig AB, Fonger TM, Wang K “Improved cotyledonary node method using an alternative explant derived from mature seed for efficient Agrobacterium-mediated transformation” Plant Cell Rep 2006 Mar; 25(3):206-13 soybean PHỤ LỤC MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY CCM SIM SEM RM GM (Co- (Shoot (Shoot (Rootting (Germinatio cultivatio induction n medium) n medium) medium) medium) Full-strenght MS x medium) X X x x B5 Vitamins 1x 1x 1x 1x 1x 3,9 mg/l 0,59 mg/l 0,59 mg/l 0,59 mg/l 30 g/l 30 g/l 30 g/l 30 g/l 30 g/l 5,6 - 5,8 5,6 - 5,8 5,6 - 5,8 5,6 - 5,8 5,6 - 5,8 7,5 g/l 7,5 g/l 7,5 g/l Compounds MES Sucrose pH Agar 7,5 g/l Acetosyringone elongation elongation - 0,4 (AS) - mM - - - L – cysteine* - 400 mg/l - - - L – asparagine* - - - 50 mg/l - acid* - - - 100 mg/l - BAP mg/l 1,67 mg/l 1,67 mg/l - - IAA - - - 0,1 mg/l - IBA - - - - 0,8 mg/l Ticarcillin - - 250 mg/l 250 mg/l 250 mg/l Cefotaxime - - 200 mg/l 200 mg/l 200 mg/l L - izoglutamic Ghi chú: (*) – Lọc qua màng lọc bổ sung sau khử trùng môi trường PHỤ LỤC MÔI TRƯỜNG LB STT Thành phần Khối lượng Trytone 10 g/L Yeast Extract g/L Nacl 10 g/L ... chuyển gen CBF1 đánh giá biểu đậu tương (Glycine max (L. ) Merill)” Mục tiêu nghiên cứu ? ?Nghiên cứu biến nạp gen CBF1 vào số giống đậu tương của Việt Nam Đánh giá biểu hiện của gen CBF1. .. NÔNG LÂM NGÔ THỊ BẢO OANH NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN CBF1 VÀ ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN TRÊN CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX (L. ) MERRILL) Ngành: Công nghệ sinh học Mã số ngành: 8.42.02.01... B Hình Cây đậu tương chuyển gen thu sau trình biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương DT22 thông qua vi khuẩn A tumefaciens Ghi chú: (A): Cây chuyển gen trồng bầu đất cảm ứng phòng; (B): Cây chuy