Nghiên cứu chuyển gen kháng nguyên ha1 của virus h5n1 vào bèo tấm wolffia globosa thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ------------      ---------- NGUYỄN HỮU HẢI NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN KHÁNG NGUYÊN Ha1 CỦA VIRUT H5N1 VÀO BÈO TẤM Wolffia globosa THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng Mã số: 60.62.05 Người hướng dẫn khoa học: TS. PHẠM THỊ LÝ THU HÀ NỘI - 2010 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………i LỜI CAM ðOAN - Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào. - Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Nguyễn Hữu Hải Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………ii LỜI CẢM ƠN ðể luận văn này ñược thành công tôi ñã nhận ñược sự quan tâm giúp ñỡ của rất nhiều người. Trước hết, tôi xin trân trọng cảm ơn ban lãnh ñạo Viện ñào tạo Sau ñại học và các thầy cô của trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội. Những người ñã tận tình truyền thụ kiến thức và tạo mọi ñiều kiện cho tôi ñược học tập, nghiên cứu trong suốt 2 năm qua. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñến tiến sỹ Phạm Thị Lý Thu, người thầy ñã dành nhiều thời gian, công sức tận tình chỉ bảo và dìu dắt tôi trong suốt thời gian thực hiện ñề tài. Tôi cũng xin cảm ơn ban lãnh ñạo Viện Di truyền Nông nghiệp và tập thể cán bộ phòng thí nghiệm Trọng ñiểm công nghệ tế bào thực vật ñã giúp ñỡ, tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành ñề tài. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia ñình, bạn bè, những người luôn ở bên cạnh giúp ñỡ và ñộng viên tôi trong suốt thời gian qua! Tác giả luận văn Nguyễn Hữu Hải Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………iii MỤC LỤC Lời cam ñoan 1 Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii 1 MỞ ðẦU 1 1.1 ðặt vấn ñề 1 1.2 Mục ñích và yêu cầu của ñề tài 2 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Giới thiệu chung về bèo tấm Wolffia globosa 3 2.2 Cơ sở khoa học của chuyển gen ở thực vật 5 2.3 Cơ sở khoa học của phương pháp PCR 15 2.4 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 16 3 ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Vật liệu 22 3.2 Nội dung nghiên cứu 23 3.3 Phương pháp nghiên cứu 24 3.4 ðịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 35 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 4.1 Nghiên cứu tối ưu hoá một số yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình biến nạp gen vào bèo tấm Wolffia globosa 36 4.1.1 Lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho việc chuyển gen vào bèo tấm Wolffia globosa nguyên cây 36 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………iv 4.1.2 Xác ñịnh mật ñộ vi khuẩn thích hợp cho biến nạp gen vào bèo tấm Wolffia globosa 38 4.1.3 Ảnh hưởng của phương thức lây nhiễm ñến tỷ lệ biểu hiện của gen gus ở bèo Wolffia globosa chuyển gen 41 4.1.4 Xác ñịnh thời gian lây nhiễm thích hợp của vi khuẩn A.tumefaciens với bèo tấm Wolffia globosa 43 4.1.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng Acetosyringone (AS) ñến tỷ lệ biểu hiện của gen gus ở bèo Wolffia globosa chuyển gen 45 4.1.6 Xác ñịnh môi trường ñồng nuôi cấy bèo tấm – vi khuẩn thích hợp. 47 4.1.7 ðánh giá ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy ñến tỷ lệ biểu hiện của gen gus ở bèo Wolffia globosa chuyển gen 48 4.2 Nghiên cứu xác ñịnh nồng ñộ chất kháng sinh (Cefotaxim, Timentin) thích hợp ñể loại bỏ vi khuẩn A. tumefaciens sau biến nạp 50 4.3 Nghiên cứu xác ñịnh ngưỡng gây chết của kháng sinh thực vật ñến bèo tấm W.globosa 51 4.4 Phân tích PCR cây chuyển gen 57 5 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 59 5.1 Kết luận 59 5.2 ðề nghị 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 PHỤ LỤC 66 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AS acetosyringone bp base pair CaMV35S- P Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter CTAB Cetyltrimeethylammonium bromide DNA Deoxy ribo-Nucleic Acid ðC ðối chứng EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Acid Et-Br Ethidium Bromide gus β- glucuronidase gene = gen mã hoá β-glucuronidase NOS Nopaline Synthetase NOS-P Nopaline Synthetase Promotor nptII Neomycin phosphotransferase gene = gen mã hoá neomyciphosphotransferase OD 600 Mật ñộ vi khuẩn ño ở bước sóng 600nm bằng quang phổ kế DUR800 Spectrophotometer của hãng Beckman Coulter PCR Polymerase Chain Reaction T-DNA transferred-DNA = DNA chuyển Ti- Plasmid Tumor inducing plasmid = plasmid gây khối u thực vật X-Gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………vi DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 1 Lựa chọn chủng vi khuẩn A. tumefaciens thích hợp cho chuyển gen vào bèo tấm Wolffia globosa 37 2 Ảnh hưởng mật ñộ vi khuẩn lây nhiễm ñến tỷ lệ biểu hiện của gen gus ở bèo tấm Wolffia globosa chuyển gen 39 3 Ảnh hưởng của phương thức lây nhiễm ñến tỷ lệ biểu hiện của gen gus ở bèo tấm Wolffia globosa chuyển gen 42 4 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm ñến tỷ lệ biểu hiện của gen gus ở bèo tấm Wolffia globosa chuyển gen 44 5 Ảnh hưởng của Acetosyringone ñến biểu hiện của gen gus ở bèo tấm Wolffia globosa chuyển gen 46 6 Xác ñịnh môi trường ñồng nuôi cấy thích hợp cho chuyển gen vào bèo tấm Wolffia globosa 47 7 Ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy ñến tỷ lệ biểu hiện của gen gus ở Wolffia globosa chuyển gen 49 8 Kết quả thí nghiệm nghiên cứu ngưỡng gây chết của Geneticin 52 9 Kết quả thí nghiệm nghiên cứu ngưỡng gây chết của Paromomycin 53 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………vii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1 Cây phân loại họ Bèo tấm (Lemnaceae) 4 2.2 Cấu trúc Ti-Plasmid dạng octopin 10 2.3 Cơ chế lây nhiễm của A. tumefaciens vào tế bào thực vật 12 2.4 Sơ ñồ cấu trúc hệ vector nhị thể 13 2.5 Sơ ñồ cấu trúc vector liên hợp 15 3.1 Bèo tấm Wolffia globosa nuôi trên ñĩa thạch 22 3.2 Vectơ nhị phân pCAMBIA1301 và vector p6d35SUbiHa1 23 4.1 Biểu hiện của gen gus khi biến nạp bằng các chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefacies 38 4.2 Ảnh hưởng của mật ñộ vi khuẩn lây nhiễm ñến tỷ lệ biểu hiện của gen gus ở bèo tấm W. globosa sau khi biến nạp với A. tumefaciens 40 4.3 Ảnh hưởng của cách phương thức lây nhiễm ñến tỷ lệ biểu hiện của gen gus ở bèo Wolffia globosa chuyển gen. 42 4.4 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm ñến tỷ lệ biểu hiện của gen gus 45 4.5 Ảnh hưởng của Acetosyringone (AS) ñến biểu hiện của gen gus ở bèo tấm W. globosa chuyển gen 47 4.6 Biểu hiện của gen gus ở bèo Wolffia globosa chuyển gen trên các môi trường ñồng nuôi cấy khác nhau 48 4.7 Ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy ñến tỷ lệ biểu hiện của gen gus ở Wolffia globosa chuyển gen. 50 4.9 Ảnh hưởng của Geneticin tới sự sinh trưởng và phát triển của bèo tấm Wolffia globosa 53 4.10 Ảnh hưởng của Paromomycin tới sự sinh trưởng và phát triển của bèo tấm Wolffia globosa 53 4.8 Biểu hiện của gen gus khi chuyển gen bằng quy trình hoàn thiện 55 4.10 Kết quả kiểm tra DNA tổng số của 12 mẫu bèo W. globosa chuyển gen 57 4.11 Kết quả phân tích PCR của 12 dòng bèo W. globosa chuyển gen 58 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………1 1. MỞ ðẦU 1.1. ðặt vấn ñề Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, ñời sống con người cũng không ngừng ñược nâng cao. Việc chăm sóc sức khỏe cộng ñồng ngày càng ñược quan tâm chú ý hơn. Nhất là trong giai ñoạn hiện nay, khi mà hiện tượng kháng thuốc ñối với các tác nhân gây bệnh cũ khá phổ biến và số lượng các tác nhân gây bệnh mới xuất hiện ngày càng nhiều thì việc chăm sóc sức khỏe con người ñã trở thành một vấn ñề bức thiết của toàn xã hội. Các phương pháp phòng bệnh luôn ñược ưu tiên hàng ñầu ở mọi quốc gia. Tuy nhiên, do giá thành vaccine sản xuất còn rất cao và lượng vaccine sản xuất còn hạn chế nên nhiều nước ñang phát triển vẫn không thể cung cấp ñầy ñủ vaccine ñể phòng ngừa các loại bệnh nguy hiểm. Ngoài ra, việc bảo quản và sử dụng các loại vaccine sống nhược ñộc cũng phải tuân thủ những quy tắc rất nghiêm ngặt nếu không sẽ mất tác dụng, thậm chí có thể quay trở lại dạng ñộc gây nguy hiểm cho người sử dụng. Vì vậy, một yêu cầu ñặt ra cho các nhà khoa học trên thế giới là phải tìm ra phương pháp sản xuất vaccine mới có hiệu quả cao và giá thành hạ. Hiện nay, một hướng nghiên cứu mới ñang thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới, ñó chính là ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất vaccine thực vật, hay còn gọi là “Vaccine thực phẩm”. ðây chính là các protein tái tổ hợp do thực vật tạo ra sau khi ñược chuyển gen. So với phương pháp sản xuất vaccine truyền thống, hệ thống thực vật có nhiều lợi thế hơn hẳn. Vaccine thực phẩm an toàn hơn hẳn so với các loại vaccine nhược ñộc hiện nay do chúng không có khả năng quay trở lại dạng ñộc ñể gây nguy hiểm cho người sử dụng. Về mặt giá thành, thực vật có thể trồng trên diện tích rộng với chi phí thấp hơn rất nhiều so với việc nuôi cấy tế bào ñộng vật ñể sản xuất các loại vaccine nhược ñộc. Ngoài ra, việc bảo quản và sử dụng vaccine cũng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………2 ñươn giản hơn nhiều. Thay vì việc tiêm chủng thường gây chi phí tốn kém, người sử dụng chỉ cần ăn các loại rau quả mang vaccine thực phẩm. Nhiều loài cây trồng ñã ñược các nhà khoa học chọn làm ñối tượng ñể nghiên cứu cho mục tiêu trên và thu ñược những thành công ñáng kể. Trong số các loài thực vật ñược nghiên cứu ñể sử dụng làm hệ thống sản xuất protein tái tổ hợp, các loài thuộc họ Bèo tấm (Lemnaceae) ñang ñược ñặc biệt chú ý bởi chúng có rất nhiều ưu ñiểm. Bèo tấm Wolffia globosa là một thực vật nhỏ bé nhưng lại có sức sống mạnh mẽ. Chúng có thể sống ở nhiều vùng khí hậu khác nhau; có khả nhân sinh khối nhanh; chứa nhiều loại vitamin A, B1, B2,… và ñặc biệt là chúng có bộ máy sản xuất protein khá mạnh. Với những ưu ñiểm ñó bèo tấm Wolffia globosa mang nhiều lợi thế cho việc sản xuất các loại protein tái tổ hợp. Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi ñã thực hiện ñề tài: “Nghiên cứu chuyển gen kháng nguyên Ha1 của virus H5N1 vào bèo tấm Wolffia globosa nguyên cây thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”. 1.2. Mục ñích và yêu cầu của ñề tài 1.2.1. Mục ñích - Xây dựng thành công quy trình chuyển gen kháng nguyên Ha1 cảu virus vào bèo tấm W. globosa nguyên cây thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. - Tạo ñược mẫu bèo tấm Wolffia globosa mang gen Ha1. 1.2.2. Yêu cầu - Tối ưu hoá các yếu tố ảnh hưỏng ñến quá trình biến nạp gen, bao gồm: Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens thích hợp cho biến nạp gen, mật ñộ vi khuẩn thích hợp ñể biến nạp, thời gian biến nạp,… - Sử dụng các loại kháng sinh như: Geneticin, Paromomycin ñể chọn lọc cánh bèo chuyển gen và nhân dòng. - Kiểm tra sự có mặt của gen Ha1 trong hệ gen của bèo tấm Wolffia globosa bằng phản ứng PCR. [...]... gen gián ti p Phương pháp chuy n gen gián ti p, ñây gen ñư c chuy n vào t bào th c v t qua m t sinh v t trung gian, thư ng là vi khu n, virus Chuy n gen nh virus Virus ñư c s d ng làm vector chuy n gen cho cây tr ng do r t d thâm nh p và lây lan trong cơ th th c v t M t khác trong c u t o c a virus cũng có m t axit nuclêic làm cơ s cho vi c g n các gen c n chuy n vào Tuy nhiên ñ làm vector chuy n gen. .. tái t h p t bèo t m [40] Robert Boehm và các c ng s (2001) cũng ñã xây d ng thành công quy trình chuy n gen vào bèo t m Wolffia columbiana nh vi khu n Agrobacterium [8] ð n năm 2002, nhóm các nhà khoa h c này l i ti p t c công b chuy n gen thành công vào bèo t m Wolffia columbiana s d ng súng b n gen Trong nghiên c u này c a mình, Cordula Kruse và Robert Boehm ñã chuy n gen vào bèo t m Wolffia Trư... thì virus c n có các tiêu chu n sau: - B genome c a virus có c u t o DNA ch không ph i RNA - Có kh năng di chuy n t t bào này sang t bào khác qua các plasmodest (l thành t bào) - Có kh năng t i ñư c các ño n DNA g n vào - Có ph ký ch r ng - Không gây h i ho c gây h i không ñáng k Tuy nhiên hi n nay, vi c chuy n gen nh virus r t ít ñư c s d ng, do virus v nguyên t c không chuy n qua h t do v y vi c... trình chuy n gen thông qua Agrobacterium Ph v t ch c a Agrobacterium ñư c xác ñ nh là r t r ng, song hi u qu bi n n p gen l i không gi ng nhau các ñ i tư ng th c v t Nhìn chung cây hai lá m m t n su t chuy n n p gen cao hơn nhi u so v i cây m t lá m m Ngoài ra hi u qu bi n n p gen còn ph thu c nhi u vào ki u gen c a th c v t Hi u qu bi n n p gen thông qua Agrobacterium th c v t ph thu c vào m t s y... cúm gia c m H5N1 và virus Gumboro Các các nghiên c u ñã ti n hành ñ ng th i phương pháp chuy n gen vào cánh bèo và chuy n gen vào mô s o r i t mô s o tái sinh thành cây bèo chuy n gen hoàn ch nh Các nghiên c u này ñã thu ñư c nh ng thành công bư c ñ u Vũ Văn Ti n và c ng s (2006) ñã xây d ng thành công h th ng tái sinh loài bèo t m Lemna aequinoctilis [4] Nh ng k t qu nghiên c u v i loài bèo này cho... công b nh ng k t qu nghiên c u bư c ñ u chuy n gen vào bèo t m [5] Nghiên c u g n ñây nh t c a Ph m Th Lý Thu và c ng s (2010) ñã xây d ng và hoàn thi n quy trình chuy n gen vào bèo t m Wolffia thông qua vi khu n Agrobactrium tumefaciens Hi u qu chuy n gen cao nh t khi bi n n p b ng ch ng AGL-1 mang vectơ pCAMBIA1301 trong ñi u ki n ly tâm hút chân không (75cmHg, 1200 vòng/phút), m t ñ vi khu n OD=1,0... m A tumefaciens v i bèo t m + M t ñ vi khu n lây nhi m + nh hư ng c a Acetosyringone + Xác ñ nh th i gian ñ ng nuôi c y - Nghiên c u n ng ñ ch t kháng sinh (cefotaxim, timentin) thích h p ñ lo i b vi khu n A tumefaciens sau bi n n p - Nghiên c u nh hư ng c a kháng sinh th c v t Geneticin và Paromomycin ñ n bèo t m W globosa - Tách chi t DNA các dòng bèo t m chuy n gen và ki m tra s có m t c a gen chuy... hành các nghiên c u chuy n gen vào bèo t m T i ñây, m t s loài bèo t m như: Lemna minor, Lemna aequinoctilis, Spirodela polyrhiza, Wolffia globosa, Wollffia australiana, ñã ñư c thu th p, lưu gi và s d ng làm ñ i tư ng ñ chuy n gen nh m t o ra Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ nông nghi p ……………20 gi ng bèo t m bi n ñ i gen có kh năng s n xu t ñư c protein kháng nguyên c a virus cúm... gen b ng súng b n gen có nhi u thu n l i do d dàng ti n hành và ñ c bi t ñ i tư ng nh n gen r t ña d ng ( d ng mô, phôi, t bào tr n, t bào) Ngư i ta s d ng thành công súng b n gen vào callus ñ chuy n gen kháng thu c di t c , gen kháng r y, kháng n m cho nhi u ñ i tư ng cây tr ng không k cây hai hay m t lá m m Phương pháp này ñư c áp d ng v i các cây tr ng mà vi c chuy n gen thông qua Agrobacterium khó... công quy trình chuy n gen vào loài bèo t m Spirodela [15], [16] Sau khi Edelman cùng các c ng s công b nh ng k t qu nghiên c u bư c ñ u chuy n gen vào bèo t m thì năm 2001, nhóm các nhà khoa h c c a Yamoto ñ ng ñ u cũng công b ñã chuy n thành công 2 gen β-glucuronidase và gen kháng kanamycine (npt II) vào m t s loài bèo t m Lemna gibba (G3) và Lemna minor (8627 và 8744) nh vi khu n Agrobacterium, và tr . hiện ñề tài: Nghiên cứu chuyển gen kháng nguyên Ha1 của virus H5N1 vào bèo tấm Wolffia globosa nguyên cây thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens .. ---------- NGUYỄN HỮU HẢI NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN KHÁNG NGUYÊN Ha1 CỦA VIRUT H5N1 VÀO BÈO TẤM Wolffia globosa THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens LUẬN VĂN