Nghiên cứu chuyển gen kháng bệnh nấm vào một số giống cà chua thông qua vi khuẩn agrobacterrium tumefaciens

Luận văn, thạc sỹ, tiến sĩ, cao học, kinh tế, nông nghiệp

TR¦êNG §¹I HäC N¤NG NGHIÖP Hµ NéI

Bïi ThÞ Lan H−¬ng

Nghiªn cøu chuyÓn gen kh¸ng bÖnh nÊm vµo mét sè gièng cµ chua th«ng qua vi khuÈn

agrobacterium tumefaciens

LUËN ¸N TIÕN SÜ N¤NG NGHIÖP

Chuyªn ngµnh: Di truyÒn vµ chän gièng c©y trång

M· sè : 62 62 05 01

Ng−êi h−íng dÉn: PGS TS Lª ThÞ ¸nh Hång

PGS.TS NguyÔn Hång Minh

Hµ NéI - 2010

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này là trung thực và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án này đ0 được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận án đều đ0 được chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả

Bùi Thị Lan Hương

Lời cảm ơn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Hồng Minh - Trưởng Bộ môn Di truyền Chọn giống cây trồng- Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội và PGS.TS Lê Thị ánh Hồng - Nguyên là Phó Viện Trưởng Viện Di truyền Nông nghiệp là những người thầy đ0 tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi và chia sẻ những khó khăn cùng tôi trong suốt 5 năm liền thực hiện và hoàn thành luận án này

Tôi cũng xin bày tỏ lòng lời cám ơn chân thành đến GS.TS Trần Tú Ngà người đ0 hết lòng giúp đỡ chỉ bảo tôi những kiến thức về di truyền học, những tài liệu tham khảo chuyên môn quý giá và cũng luôn động viên tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án

Trong thời gian qua, tôi đ0 nhận được sự giúp đỡ quý báu của Ban l0nh đạo Viện Di truyền Nông nghiệp, các cán bộ, các bạn bè đồng nghiệp trong Phòng Bệnh học Phân tử Thực vật và Bộ môn Di truyền và Công nghệ Lúa lai - Viện Di Truyền Nông Nghiệp, ban l0nh đạo Viện Môi Trường Nông Nghiệp, Bộ môn Môi Trường Nông Thôn Nhân dịp này tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó

Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo Viện Đào tạo Sau đại học, Khoa Nông học

và Bộ môn Di truyền và Chọn giống Cây trồng - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đ0 tạo điều kiện giúp tôi hoàn thành tốt mọi mục tiêu nghiên cứu và mọi thủ tục

để có thể hoàn thành luận án này

Tôi rất biết ơn những người thân trong gia đình tôi đ0 luôn bên tôi quan tâm

và tạo điều kiện tốt cho tôi học tập và nghiên cứu

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu của các tập thể và cá nhân đ0 dành cho tôi

Tác giả

Bùi Thị Lan Hương

Môc lôc

1.2 Nguån gèc, ph©n lo¹i vµ gi¸ trÞ dinh d−ìng c©y cµ chua 6

1.4.1 Nh÷ng nghiªn cøu vÒ chän t¹o gièng cµ chua theo c¸c ph−¬ng ph¸p

1.7.2 ứng dụng công nghệ in vitro trong việc nhân nhanh giống cây trồng

1.8 Một số thành tựu về thu nhận cây trồng chuyển gen và khả năng ứng

3.1 Một số kết quả nghiên cứu quy trình tái sinh cây cà chua phục vụ

3.1.1 ứng dụng kỹ thuật DAS-ELISA để kiểm tra tình hình sức khoẻ hạt

3.1.2 Nghiên cứu quy trình tái sinh cây cà chua phục vụ cho công tác chuyển gen 53

3.2 Những kết quả ban đầu về chuyển gen kháng nấm Glucanase vào

3.2.1 Khả năng tái sinh của hai giống cà chua Balan, H18 và dòng dại

3.2.3 Quá trình biến nạp gen kháng nấm Glucanase 86 3.2.4 Nghiên cứu khả năng tái sinh của các mẫu cấy trên môi trường có

3.3.1 Khả năng tái sinh cây in vitro của hai giống cà chua H18 và L

3.3.4 Các kết quả nghiên cứu khả năng tái sinh của các mẫu cấy trên môi

3.4 Kết quả chuyển gen Chitinase vào cà chua p375 và Pháp lùn 118 3.4.1 Khả năng tái sinh của hai giống cà chua P375 và Pháp lùn trong

3.4.3 Các kết quả nghiên cứu khả năng tái sinh của các giống sau khi biến

Các công trình đã công bố có liên quan đến luận án 131

Danh môc c¸c ch÷ viÕt t¾t

International Agriculture

Danh môc b¶ng

sinh tr−ëng IAA kÕt hîp víi mét sè Cytokinin (Kinetin, Zeatin vµ BA)

3.14 Kh¶ n¨ng t¸i sinh c¸c mÉu trô l¸ mÇm vµ l¸ mÇm cña Balan, H18, vµ

Danh môc h×nh

3.21 Mẫu trụ lá mầm (trái) và lá mầm (phải) đồng nuôi cấy trong dung dịch

3.41 C¸c chåi ph¸t triÓn cña gièng H18 t¸i sinh trªn m«i tr−êng chän läc cã

Mở đầu

Cây cà chua (Lycopersicon esculentum Mill) được nhập nội vào nước ta hơn

100 năm trước Hiện nay, bằng con đường nhập nội giống, chúng ta còn thu thập

được một tập đoàn gen khoảng 1000 mẫu giống cà chua khác nhau, tập trung ở các Viện nghiên cứu, các trường Đại học và các tỉnh

Với điều kiện khí hậu Việt Nam, cà chua là một cây rau chủ lực có diện tích trồng ngày càng tăng Cà chua được trồng ở hầu hết các tỉnh thành trên cả nước ở nước ta, diện tích trồng cà chua hiện nay đạt khoảng 20.000 ha với năng suất hiện nay khoảng 30 tấn/ ha (Trần Khắc Thi, 2005)[25] Vào những năm 1980 diện tích trồng cà chua đạt 100.000 ha (Ngô Thị Hạnh, 2001)[4] Cây cà chua được trồng vào

vụ Đông-Xuân, Xuân-Hè, Thu-Đông (từ tháng 9 đến tháng 4 ở miền Bắc và tháng

11 đến tháng 4 năm sau ở miền Nam) Riêng tại Lâm đồng, cà chua được trồng quanh năm, do vụ Đông-Xuân có thời tiết thích hợp mọi nơi đều trồng được, ở đây năng suất cà chua có thể đạt 40-60 tấn/ha Ngược lại vụ Xuân-Hè, miền Bắc có khoảng 6 -7 tháng (từ tháng 4 đến tháng 9) và miền Nam có khoảng 7-8 tháng (từ tháng 5 đến tháng 12) là những tháng rất khó trồng, do điều kiện thời tiết nóng ẩm, mưa nhiều là những điều kiện thuận lợi cho nhiều loại bệnh phát sinh gây hại cả trong điều kiện vườn ươm và ngoài đồng ruộng như: Mốc sương (Phytophtora infestans), thối Fusarium, thối cổ rễ và thối rễ do Rhizostonia solani và Pythium, bệnh thối Verticilium, Alternaria, bệnh đốm (Stemphylium solani và nhiều bệnh nấm hại khác Ngoài ra chúng còn bị nhiều loại bệnh vi khuẩn và virus gây hại nghiêm trọng như: Erwinia, Streptomyces, Ralstonia solanacearum, Clavibacter michiganensís, sepedonicus và PVY, ToLRV, PVX, PVM, TMV, ToMV, TSWV, CMV,

đặc biệt hai bệnh virus TMV và ToMV là hai bệnh lan truyền qua hạt Các loại bệnh hại này không chỉ ảnh hưởng lên năng suất mà còn ảnh hưởng nghiêm trọng lên chất lượng quả, giảm khả năng thương phẩm Vì thế, hàng năm những người sản xuất cà chua đ0 phải sử dụng một lượng thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) rất lớn, để bảo vệ năng

suất và chất lượng sản phẩm Việc sử dụng thuốc BVTV một cách thiếu thận trọng,

đặc biệt là thuốc trừ nấm hại đ0 gây ra nhiều hậu quả nghiêm trọng, làm ô nhiễm môi trường sống gây ảnh hưởng trực tiếp đến sức khoẻ người sản xuất và người tiêu dùng, làm huỷ diệt các sinh vật có ích trong đất, nước và làm cho các loại vi sinh vật kháng thuốc, bệnh hại tỏ ra hung h0n hơn Như vậy việc phòng trừ và quản lý chúng khó khăn hơn (Trần Văn Lài, 2005) [10]

Những giống cà chua có khả năng kháng được nhiều loại bệnh khác nhau sẽ giúp rất nhiều cho ngành sản xuất cà chua nói chung, đây là vấn đề có ý nghĩa lớn trong nông nghiệp Vì vậy, chúng được sự quan tâm rất lớn của nhiều nhà chọn giống cà chua trên thế giới đồng thời cũng cần có sự tham gia đóng góp tích cực của nhiều lĩnh vực nghiên cứu khoa học

Chuyển gen là một biện pháp bổ sung cho chọn tạo giống truyền thống, có thể giúp cho việc mở rộng các nguồn gen có lợi sang các giống khác Công nghệ chuyển gen cũng cung cấp lợi thế trong việc chuyển một gen đơn hoặc thậm chí các gen số lượng, tránh được những khó khăn mà phương pháp chọn tạo giống truyền thống phải đương đầu

Cho đến nay, các nhà khoa học đ0 chuyển thành công một số gen vào cà chua nhằm tạo ra những giống cà chua có năng suất và chất lượng cao Các vector đ0

được cắt, sửa chữa có tiềm năng to lớn tiếp tục bổ sung cho phương pháp chuyển gen qua Agrobacterium (Frary và Earle, 1996)[58],

Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu chuyển gen kháng bệnh nấm vào một số giống cà chua thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”

Xác định các môi trường nuôi cấy, tái sinh cây, thiết lập hệ thống biến nạp các gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens nhằm thu nhận các cây tái sinh mang các gen chuyển ở một số giống cà chua

3.1 Đ0 xác định được các điều kiện và qui trình tái sinh cây cà chua in vitro ứng

dụng cho chuyển nạp gen và các mục tiêu nghiên cứu khác

3.2 Đ0 góp phần xác định được hiệu quả sử dụng 2 vector đúp hữu ích (Vector mang gen Chitinas-Glucanas và vector mang gen Glucanase- Osmotin) trong chuyển nạp gen vào một số giống cà chua nghiên cứu

3.3 Đây là những tài liệu có hàm lượng khoa học tốt về công nghệ nuôi cấy in vitro, chuyển nạp gen ở cà chua Chúng có giá trị tham khảo trong nghiên cứu công nghệ sinh học nông nghiệp ứng dụng và trong công tác giảng dạy ở các trường đại học

1 Luận án đ0 xác định được các môi trường nuôi cấy nhằm thu nhận cây cà chua tái sinh đối với các giống P375, H18, Ba lan và giống Pháp lùn, đặc biệt đối với các loài

cà chua dại L pennelli

2 Lần đầu tiên ở Việt nam đ0 thực hiện thành công các quy trình chuyển gen kháng nấm Chitinas-Glucanas và Glucanase-Osmotin thông qua vi khuẩn Agrobacterrium tumefaciens vào một số dòng, giống cà chua như P375 và H18 để tạo giống kháng nấm

3 Đ0 tạo được một số dòng cà chua mang gen kháng nấm như Defensin (giống H18), Chitinase (giống P375), Glucanase (giống Balan) Sự có mặt của gen chuyển đ0

được kiểm tra bằng các phương pháp định tính (sinh học) và phân tử

- Đề tài đ0 sử dụng 2 chủng vi khuẩn:

+ Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens EHA 105

+ Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens LBA4404

- Các giống cà chua: Ba lan, Pháp lùn, P375, H18 và dòng cà chua dại L pennelli

sinh mang gen chuyển Thẩm định sự có mặt của chúng bằng phương pháp chỉ thị phân tử

Phòng thí nghiệm của Phòng Bệnh Học Phân Tử - Viện Di Truyền Nông nghiệp - Từ Liêm Hà Nội và Trại Thực nghiệm của Viện Di truyền Nông nghiệp - Văn Giang - Hưng Yên

Thời gian nghiên cứu: 2004 - 2008

Chương 1

Tổng quan tài liệu

Cà chua trồng (Licopersicon esculentum Mill.) thuộc họ Solannaceae chi Lycopersicon Cà chua là cây rau có giá trị kinh tế cao được phát triển ở hầu hết các nước trên thế giới từ các nước hàn đới đến các nước nhiệt đới (Rick,1978) [116]; (Tạ Thu Cúc,1994) [1]

thách thức to lớn trong sản xuất nông nghiệp Hàng năm, trên thế giới, sản lượng cây trồng giảm sút đáng kể do chúng bị nhiễm nhiều loại sâu, bệnh hại khác nhau như: virus, viroid, vi khuẩn, nấm cũng như tuyến trùng và côn trùng gây hại khác Đó là một trong những nguyên nhân gây nên sự đói kém của người nông dân nói riêng và

đe doạ trầm trọng nền kinh tế của cộng đồng x0 hội nói chung Song chúng ta cũng biết rằng: “Những cây trồng không thể chạy trốn các vấn đề của chính mình, chúng cần phải đối mặt với các vấn đề đó” Trong tự nhiên, các loại cây trồng đ0 thích ứng

được với môi trường xung quanh nhờ phát triển những cơ chế kỳ lạ và các cơ chế liên quan (Jeon,1998) [67] Các áp lực do môi trường gây ra thường là: nóng, lạnh, mặn, chua, các loại kim loại nặng độc hại, ánh sáng v v và các yếu tố sinh học như: viroid, micoplasma, virus, vi khuẩn và nấm (Hu K.l, 2002) [64] Một vài cơ chế trong chúng xảy ra rất nhanh, có nghĩa là phản ứng chỉ xảy ra sau vài giây hoặc vài phút sau khi bị kích thích và dẫn đến những thay đổi trong hoạt động của gen Một

số phản ứng xảy ra chỉ trong khoảnh khắc, sau vài phút hoặc vài giờ (ví dụ khi có

sự tấn công của các tác nhân gây bệnh) Những phản ứng thứ cấp, có thể xảy ra trong những phần cách biệt của cây, sau một hoặc hai ngày khi gây chấn thương ban

đầu Nhìn chung, những phản ứng muộn này là kết quả từ những thay đổi trong các hoạt động của gen, làm sản sinh ra những protein mà bình thường cây trồng không sản sinh ra được hoặc chỉ sản sinh ra một số lượng ít ỏi trong các cơ quan đặc thù Thêm vào đó, do không có các bộ phận tương ứng của động vật, nên cây trồng không có khả năng nhận biết rất nhiều tín hiệu tác động từ môi trường xung quanh (Bennett,1993) [38]

Hiện nay, với sự phát triển vô cùng nhanh chóng của công nghệ di truyền, người ta đ0 biết đến các tiến bộ của công nghệ này, ứng dụng trong công tác giống cây trồng (Nguyễn Như Khanh, 2002) [8] Các tiến bộ về công nghệ gen đ0 đạt tới việc nhận ra cơ chế phân tử đầy đủ giữa cây chủ với các tác nhân gây bệnh và chiến lược tự vệ tự nhiên của cây chủ Mặt khác công nghệ này cũng được sử dụng để kiểm tra và tái sinh có hiệu quả sự đa dạng di truyền Chính công nghệ di truyền cho phép nhanh chóng nhận dạng, tách dòng và kiểm tra những tái tổ hợp gen trong in vitro và khả năng để nhận biết các kiểu gen ưa thích, vượt xa khả năng của phương pháp chọn giống cổ điển (phương pháp lai hữu tính và lai dòng soma) (Stanton B, 1994) [106] Thử nghiệm thành công đầu tiên thực hiện trên sự cải tạo tính kháng

đối với bệnh virus, vi khuẩn, nấm và côn trùng bằng thiết kế cây chuyển gen Phần lớn các chiến lược này được dựa trên cơ sở chủ yếu là sự thể hiện các protein đơn m0 hoặc gây độc đối với tác nhân gây bệnh, côn trùng hoặc gây trở ngại cho chu trình tái sinh của chúng Chính vì vậy, giữa những năm 1987-1991 cục Liên bang Quốc gia Nông nghiệp Mỹ đ0 nhận được trên 100 đề nghị cho thử nghiệm ngoài

đồng các cây được chuyển gen Phần lớn các thử nghiệm này là dự tính thử các giống đ0 được tăng khả năng chống chịu với các điều kiện khắc nghiệt do các yếu tố sinh học (biotic) và vô sinh (abiotic) gây ra Đồng thời, một số thí nghiệm khác song song có liên quan đến vấn đề chất lượng sản phẩm như: Làm chậm thời gian chín, biến đổi hàm lượng protein của hạt, tăng hàm lượng carbonhydrate ở củ, biến

đổi hàm lượng dầu để giảm sự gây mùi, vấn đề màu sắc của hoa.v.v.[31]; [32]

Có nhiều định nghĩa về cây trồng biến nạp gen, đây là một định nghĩa có tính bao quát nhất:“Cây biến nạp gen là cây được chuyển một hay nhiều gen mới từ đó ta

đM thu được thêm một hay nhiều đặc điểm mới Các gen được chuyển vào cây không phải bằng con đường lai hữu tính giữa hai bố mẹ, mà được chuyển bằng các kĩ thuật

di truyền (một cây chuyển gen mang những đoạn ADN thu được bằng những thao tác trong in vitro) Kết quả cũng giống như tất cả các cơ chế khi có một gen lạ thâm nhập vào tính di truyền được biến đổi (OGM-Organismes Genetiquement Modifiees)” (Macheix, 1997) [73]

1.2.1 Nguồn gốc cây cà chua

Cây cà chua thuộc chi Lycopersicon, loài esculentum (Rick, 1978) [97] có xuất

xứ từ Trung và Nam Mỹ, được phân bố từ Bắc Chilê đến Nam Colombia, phía Tây

đến Thái Bình Dương và phía Đông đến vùng núi Anner (Peru, Chilê và Ecuador) (Rick, 1983) [98] Không có bất cứ một chi hoang dại Lycopersicon nào có thể tìm thấy bên ngoài châu Mỹ, ngoại trừ Lycopersicon esculentum var cerasiforme (cherry tomato) Theo Rick (1983), nguồn hoang dại của cà chua trồng hiện nay chắc chắn phải là Lycopersicon esculentum var cerasiforme (cherry tomato), trước đây nó được

di trú từ Trung tâm d0y núi ADNer xuyên qua Nam-Bắc Mỹ, dọc theo eo biển Panama đến Trung Mỹ và Nam Mexico rồi di cư đi khắp các châu lục khác

Hầu hết các bằng chứng về nguồn gốc cà chua thuần hoá đều chỉ ra rằng đó là

từ Mexico (Taylor, 1986) [109] Điều này chứng tỏ cà chua trải qua một giai đoạn tiến hoá rất lâu trước khi được du nhập vào châu âu Giống cà chua đầu tiên được

du nhập vào châu Âu năm 1519 là giống cà chua quả to, vì vậy ở ý người ta gọi

cà chua là pomid’oro (táo vàng), còn loài thuỷ tổ ban đầu có quả nhỏ như các báo cáo trước đây của Rick năm 1978 đ0 miêu tả về hình dáng, mầu sắc của các giống cà chua

Cà chua được du nhập vào Mỹ không phải từ châu Mỹ Latinh mà từ châu Âu Những tài liệu mô tả đầu tiên về cà chua được tìm thấy vào những năm 1700, đầu những năm 1800 là của các nhà nghiên cứu thực vật William Salmon và Thomas Jeferson (Rick, 1976) [99]; (Rick, 1978) [97] Cà chua được đưa vào Việt nam từ những nhà truyền giáo đến từ pháp từ trên 100 năm nay

1.2.2 Phân loại cây cà chua

Chi Lycopersicon thuộc họ Solanaceae Họ này là một trong những họ quan trọng nhất phục vụ con nguời và bao gồm rất nhiều loại rau quả quan trọng Trong

khuôn khổ họ Solanaceae, Lycopersicon thuộc họ phụ (subfamily) Solanoidae thuộc tông (tribus) Solaneae (Rick,1978) [97]

Ngoài chi Licopersicon còn có một số loài trong chi Solanum có quan hệ rất gần gũi với dạng cà chua trồng hiện nay Trong khi chi Solanum và Licopersicon có cùng số nhiễm sắc thể cơ bản (x=12), nhưng rào cản về khả năng lai khác loài đ0 làm giảm rất nhiều khả năng tái tổ hợp của chúng trừ một vài trường hợp h0n hữu Một

số nhà chọn giống đ0 thành công trong việc lai giữa Licopersicon esculentum và Solanum licopersicoides và Solanum rickii, tuy nhiên phải nhờ vào kỹ thuật cứu phôi, nhưng nhìn chung các con lai có tỷ lệ bất dục rất cao (Stevens và cs, 1986)[131] Còn với các loài Solanum corneliomuelleri, Solanum ochranthum và Solanum sitiens chưa

có các công bố về sự thành công trong việc lai tạo giữa chúng với các loài của L esculentum (Peralta, 2005) [92]; (Peres, 2001) [93] Riêng đối với loài Solanum nigrum thì chưa có một nhà chọn giống nào thành công trong khi lai tạo nó với Licopersicon esculentum (Taylor, 1986) [109], (Peralta, 2005) [90]

Giá trị dinh dưỡng

Cà chua đ0 được trồng làm thức ăn từ hàng trăm năm nay, cho đến những năm

1900 cà chua chưa được trồng và tiêu thụ nhiều vì thời đó cà chua chỉ được dùng như mặt hàng ăn tươi và muối dưa (những quả xanh) nhưng từ những năm sau 1900 cà chua được dùng như một loại sản phẩm hàng hoá thương mại đa dạng về phương thức

sử dụng và cách chế biến như: ăn tươi cả quả với muối, làm sà lát, nấu chín (nấu canh, sào, làm phát xíu cà chua, sốt cà chua với trứng ), chế biến đồ hộp (paste, cà chua quả hộp, đồ uống cà chua, đặc biệt cà chua ketchup ăn với bánh mì và các loại spageti rất ngọt do vị của loài cà chua L pennelli), làm mứt, cà chua khô, phụ gia thực phẩm,

đặc biệt là thành phần trong nhiêu loại bánh như Pizza

có màu đỏ (carotenoide) là một chất chống ôxyhoá chứa một tỷ lệ rất cao: 30mg/200 ml nước sốt cà chua

Quả cà chua còn chứa đựng một loại ancaloide đó là solanin cũng như saponin, liên kết với hitadin và làm cho dễ tiêu hoá Và cà chua chính là một loại dược liệu có giá trị trên toàn thế giới, nhờ hàm lượng lycopen và chất mầu caroteinoide (chất chống ôxy hoá), theo các kết quả nghiên cứu cho thấy Lycopen đặc biệt trong cà chua nấu chín có thể phòng ngừa được ung thư tuyến tiền liệt, ung thư tuyến tuỵ (pancréas) và phòng ngừa được ung thư dạ dầy (Rick, 1978) [97], [62]

Mới đây trung tõm Nghiờn cứu John Innes, ủược Chớnh phủ Anh tài trợ, vừa cụng bố kết quả này trờn tạp chớ Nature Biotechnology ngày 26-10 Một giống cà chua do biến ủổi gien trở thành màu tớm và chứa nhiều chất chống ụ xy húa anthocyanins giỳp chống ung thư

1.3.1 Tình hình phân bố và sản xuất cà chua trên thế giới

Cà chua là loại cây rau quan trọng thứ hai trên thế giới, chỉ đứng sau cây khoai tây, được phân bố hầu như khắp các nước trên thế giới Đó là một loại cây rau

ăn quả dễ trồng và có giá trị dinh dưỡng cao, hàng năm trên thế giới trồng khoảng 3,7 triệu ha cà chua cho sản lượng khoảng trên 120 triệu tấn (Database, 2008) [32] Trung quốc là nước có diện tích và sản lượng cà chua lớn nhất trên thế giới với khoảng 1 255 100 ha và sản lượng tương ứng 31 644 040 tấn (năm 2005) và ấn Độ

là nước tăng nhanh cả về diện tích (300%) và năng suất (54%) so với năm trước Sáu nước đứng đầu sản xuất cà chua trên thế giới đó là: Trung quốc, Mỹ, Thổ Nhĩ Kỳ,

Ai cập ấn độ và ý Ngoài ra các nước tăng nhanh về diện tích còn có úc (15%), Indonexia, Brazil và Mexico Hà lan và Bỉ là hai nước đứng đầu về năng suất cà chua trên thế giới (4.961, 513 kg/ha)

Số liệu về diện tích cây trồng trong nhà lưới, có hệ thống tưới tiêu, chăm sóc hiện đại, tự động hoá sau đây cho thấy được mức độ đầu tư của các nước phát triển Muigai,2003 [84]: Hà Lan có 4.300 ha cà chua, ý có 3.500 ha, Anh có 1.640 ha, Pháp có 1.500 ha và hàng trăm ha trồng cà chua thuỷ canh [62] Một số nước chính

trong hệ thống các nước Francôphône có sản lượng cà chua lần lượt như sau: (sản lượng cà chua tính theo tấn năm 2006 (FAOSTAT-DataBase) [56]: Pháp: 843 220 tấn, Canada: 805 090 tấn Vương quốc Bỉ: 245 900 tấn, Thuỵ Sỹ: 29 600 tấn

Nhìn chung, những nước càng phát triển thì cho năng suất cao Ngược lại những nước nghèo thì sản xuất cho năng suất rất thấp Và đặc biệt, các nước Châu

á chính là nơi trồng cà chua nhiều nhất trên thế giới, ví dụ: Trung Quốc: 1 255 100

ha, ấn Độ: 350.000 ha, Philippine: 165.000, Thái lan; 12.000 ha, Việt Nam: 10 12.000 ha… Trong vùng nhiệt đới, Trung Quốc và ấn Độ là hai nước có diện tích trồng cà chua cao nhất còn Nhật Bản và Đài Loan là hai nước luôn dẫn đầu về năng suất [63], (Massaaki,2005) [76]

-1.3.2 Tình hình phân bố và sản xuất cà chua ở Việt Nam

Về tình hình sản xuất cà chua ở nước ta hiện nay có thể điểm ra một số nét chính sau:

Sản xuất và tiêu thụ: Cà chua được trồng ở hầu hết các tỉnh thành trên cả nước Cho đến nay cà chua ở nước ta sản xuất ra gần như chỉ để tiêu thụ tại chỗ mà vẫn chưa thể xuất khẩu do sản xuất chưa nhiều, mẫu m0, chất lượng cà chua nói chung chưa cao

Giống: Trước những năm 1990, chủ yếu là giống địa phương thích hợp với

điều kiện canh tác và tiêu thụ từng nơi Nhìn chung gần đây nhiều giống mới đ0

được chọn lọc, đưa vào sản xuất với năng suất với chất lượng đ0 được cải thiện

5901386, VL 2100, Red Crown Đặc biệt có những giống trái vụ: T12, RaMuna, KBT4, 386, Red Crown Theo kết quả điều tra của Phạm Đồng Quảng và cs năm

2004 cả nước ta có 115 giống cà chua được gieo trồng trong đó có 22 giống chủ lực,

10 giống có diện tích gieo trồng lớn nhất trên cả nước đứng đầu là M368 tiếp đến là giống cà chua Pháp, VL2000, TN002, các giống cà chua Mỹ, Ba lan, Red Crow, T42, VL2910 và giống của các công ty Trang Nông (Phạm Hồng Quảng, 2005)[17], (Dương Kim Thoa,2005) [27], (Dương Kim Thoa, 2005) [28]

Kỹ thuật canh tác: ở các vùng có lịch sử trồng cà chua lâu đời thì kỹ thuật

canh tác cà chua của nông dân là khá cao Ví dụ như tại Hà Nội, Hải Phòng, Hà Bắc, Hải Hưng, Hà Tây, Lâm Đồng Còn tại các vùng rau xa trung tâm thì người dân thiếu kinh nghiệm, các biện pháp canh tác còn nhiều lạc hậu Điều này dẫn đến sự chênh lệch về năng suất và chất lượng của cây cà chua Nhìn chung, về kỹ thuật hiện nay còn có những khó khăn trong việc: phòng trừ sâu bệnh, cỏ dại và điều kiện môi trường khắc nghiệt (Ngô Thị Hanh, 2001) [4], (Lê Thị Khánh, 2005)[9]

Quan sát thực tế, chúng tôi nhận thấy việc trồng cà chua hiện nay ở nước ta

có một số thuận lợi và khó khăn chính sau:

Về mặt thuận lợi: Nhìn chung nước ta có vụ Đông Xuân thời tiết khá thuận lợi cho việc sản xuất cà chua, nhất là các tỉnh phía Bắc kéo dài đến Bình Định, Phú Yên Ngoài ra, ở nước ta hiện đang có một số giống mới và một số biện pháp canh tác tốt có thể đạt năng suất 40-50 tấn/ha/vụ (Nguyễn Văn Thắng và cs, 2000)[24]

Về mặt khó khăn: Chúng ta gặp phải hầu hết những khó khăn mà vùng nhiệt

đới gặp phải như giống, sâu bệnh, kỹ thuật canh tác, thị trường công nghệ sau thu hoạch và sản xuất trái vụ… Hiện nay một vấn đề phát sinh nữa là tồn dư kim loại nặng (KLN) trong đất, nước và không khí Đối với sự nghiên cứu, sản xuất cây cà chua vẫn còn nhiều vấn đề cần được đầu tư và nghiên cứu (Trần Khắc Thi và cs, 2001) [25], (Đào Xuân Thảng và cs, 2003) [23]

1.4.1 Những nghiên cứu về chọn tạo giống cà chua theo các phương pháp

truyền thống

Chọn giống ưu thế lai

Hiệu quả ưu thế lai của cà chua được phát hiện từ đầu thế kỷ 20 Sử dụng ưu thế lai được phổ biến trong sản xuất nhờ có ưu thế lai của F1 về năng suất, chỉ số chín sớm, chất lượng quả, độ đồng đều của quả và khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi tốt hơn bố mẹ Con lai F1 cho phép nâng năng suất cây trồng lên tới 25-30% và cao hơn (Kiều Thị Thư, 1998) [26]; (Verna, 1990) [54]

Một loạt các nghiên cứu về ưu thế lai, năng suất, hàm lượng chất khô, độ dày của quả và mối quan hệ giữa ưu thế lai và đa dạng di truyền được nghiên cứu rất

công phu, có những thành công nhất định Hiện nay, hàng loạt các giống lai đang

được sản xuất đại trà có năng suất cao, phẩm chất tốt

DV 2962 là giống cà chua lai F1 có nguồn gốc từ ấn Độ, được h0ng Seminis nhập về Việt Nam và do Cty TNHH TM & SX hạt giống cây trồng Đất Việt độc quyền phân phối Sau 2 năm (2005-2006) trồng thử nghiệm thành công ở một số tỉnh vùng Đồng Bằng Sông Hồng (ĐBSH) với nhiều thời vụ khác nhau, đầu năm nay, công ty Đất Việt đ0 đưa ra khuyến cáo bà con nông dân nên trồng giống cà chua có nhiều ưu điểm này

ứng dụng ưu thế lai trong chọn giống cà chua được tiến hành trên nhiều nước Bungary là nước đầu tiên sử dụng ưu thế lai ở cà chua, hiện nay hầu như trên toàn bộ diện tích gieo trồng đang sử dụng phổ biến là các giống lai F1

Hàng năm các công ty rau hoa quả ở Hà lan đ0 đưa ra hàng loạt các con lai

có ưu thế lai cao ra thị trường Ngoài ra, có các công ty ở Nhật, Pháp… đ0 giới thiệu nhiều giống cà chua có năng suất cao, phẩm chất tốt, chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trường, có dạng quả và màu sắc hấp dẫn (MacuaJ.I,2002) [74]

Từ trước năm 1995, các nghiên cứu về tạo giống cà chua ưu thế lai ở nước ta

đ0 được đề cập Sau 1995, vấn đề này mới được phát triển mạnh, nghiên cứu các công nghệ sản xuất hạt giống cà chua lai khác nhau, tới năm 1998 Đại học Nông nghiệp I - Hà nội đ0 đưa ra quy trình sản xuất hạt giống cà chua lai trên quy mô đại trà (Nguyễn Hồng Minh, 2006)[11], cũng từ năm đó giống cà chua lai HT7 được

đưa ra Sau đó năm 2000, phát triển diện tích lớn nhiều năm liên tục (Nguyễn Hồng Minh và cs)[12] Năm 2004, đưa ra sản xuất giống cà chua HT21(Nguyễn Hồng Minh, 2006) [13] và tiếp theo là các giống HT42, HT160 các giống trên có nhiều

ưu điểm về ngắn ngày, năng suất chất lượng tốt, chịu nóng cạnh tranh được với các giống nhập nội để phát triển sản xuất (Nguyễn Hồng Minh, 2006)[11] Bên cạnh các giống cà chua lai trên một số giống chọn lọc khác được đưa ra như PT18 (Dương Kim Thoa và cs, 2005) [28], C95 (Đào Xuân Thảng và cs, 2003) [23], VT3 (Đào Xuân Thảng và cs, 2003) [22] và một số giống khác

Chọn lọc giao tử

Vấn đề chọn lọc giao tử và hợp tử trong chọn tạo giống cà chua cũng được

đặt ra trong những năm của cuối thể kỷ 20, nhằm tạo nhanh các giống thích ứng với các điều kiện bất lợi của môi trường, đặc biệt là nhiệt độ cao và một số các yếu tố kích thích khác

Một trong những phương pháp thay đổi cường độ chọn lọc giao tử là làm tăng sức sống của giao tử, bằng kích thích tia cực tím Thụ phấn bằng phấn được kích thích làm tăng số lượng hạt trong quả và làm tăng trọng lượng quả so với đối chứng

Thụ phấn bằng số lượng phấn hạn chế là một trong những phương pháp làm giảm cạnh tranh giao tử Từ đó làm giảm sự đào thải của hạt phấn tái tổ hợp

Thay đổi cấu trúc quần thể phân ly có thể bằng kích thích sức sống của hạt F1 Xử lý hạt bằng dung dịch CuSO4 (0,2%), axit boric (0,02%), tia cực tím đ0

được nghiên cứu bởi Garbuz từ những năm 1987

Sức sống giao tử của hạt phấn có thể tăng lên nhờ sử dụng các chất hoạt tính sinh học như vitamin B1, B6, IAA, GA và các glycozid

Với cà chua, bằng cách chọn lọc hạt phấn chống chịu với nhiệt độ cao có thể làm tăng sự chống chịu ở giai đoạn sinh dưỡng Sự chọn lọc này cần được tiến hành bắt đầu từ cây F1 trong lai khác loài, cùng loài giống như lai giữa các giống

Như vậy, bằng phương pháp chọn lọc giao tử và hợp tử có thể làm tăng phổ biến dị, di truyền, phục vụ cho chọn lọc và tạo các kiểu gen chống chịu với các điều kiện bất thuận, đặc biệt là yếu tố nhiệt độ

Phương pháp phân tích tổng hợp

Có hiệu quả nhất trong thực tế chọn giống cà chua là phương pháp phân tích tổng hợp, tức là lai tạo kết hợp với chọn lọc liên tục những cây có ít nhất các tính trạng không có lợi Trong chọn mẫu để lai cần chú ý đến các tính trạng bổ sung cho nhau giữa hai bố mẹ Các tính trạng đó cần có trong giống mới và trong giống lai Chính vì vậy, cần đưa vào trong chương trình lai tạo không những các giống, các dòng chọn lọc, các dạng cà chua trồng, các dạng bán hoang dại mà cả các loài khác của chi Lycoppersicon

Chọn lọc cá thể

Trong chọn giống cà chua thường sử dụng chọn lọc cá thể nhiều lần Phương

pháp này cho phép nghiên cứu di truyền các tính trạng có hiệu quả trong chọn giống thực nghiệm

ở đa số các trung tâm nghiên cứu khoa học ở Liên xô (cũ), sự lai các giống

cà chua chọn lọc với các giống địa phương, các dòng khác nhau về tính trạng quý

được tiến hành trên quy mô lớn Bằng phương pháp này đ0 tạo ra nhiều giống mới: Maiac 12/24-4, padarok 105, kolkhowui 34

Lai một lần các giống cà chua và các dòng khác nhau về năng suất, các tính trạng khác thường không nhận được kiểu gen mong muốn Sử dụng lai nhiều lần,

đặc biệt kết hợp chọn lọc ở các giai đoạn trung gian đ0 thúc đẩy hoàn thiện các tính trạng cần thiết

Trong chọn giống cà chua phương pháp một hạt từ chọn lọc cây ưu tú (SSDES) hiệu quả hơn phương pháp chọn lọc hỗn hợp, chọn lọc dòng thuần và chọn lọc nhóm theo tính trạng: Số quả trên cây, năng suất cá thể, ra hoa sớm, trọng lượng quả và kháng héo vi khuẩn

Lai hữu tính

Nhìn chung, các giống cà chua mới được tạo ra phần lớn là sử dụng phương pháp lai hữu tính So sánh với các phương pháp khác, phương pháp lai hữu tính vẫn hiệu quả hơn ở trên đối tượng cây cà chua Bằng phương pháp này đ0 phục tráng nhiều tính trạng nông học quý hiếm như năng suất, chín sớm, kích thước quả, hàm lượng các chất sinh học quý là tính trạng đa gen (Trần Văn Lài và cs,2005) [10]

Bên cạnh phương pháp lai hữu tính là phương pháp dung hợp tế bào trần kết hợp được tính chống chịu của L.peruvianum với dung lượng tái sinh cây của L.esculentum ở con lai của chúng Đa số các con lai này là tứ bội (xn=4x=48) có một số con lai lục bội, chứa 2 genom của L.esculentum và 4 genom của L.peruvianum

1.4.2 Nghiên cứu chọn giống bằng phương pháp chuyển gen

Cà chua là một cây mô hình về kiểu di truyền trong các nghiên cứu cải tạo giống cho nhiều loại cây trồng 2 lá mầm (Mc Cormick và cộng sự,1986);[78] Những nghiên cứu cơ bản và ứng dụng thành công trong vấn đề chuyển gen cây cà chua là rất cần thiết Đ0 có nhiều thành công trong chọn tạo giống cà chua bằng con

đường chuyển gen và các giống mới này đ0 được phê chuẩn là an toàn cho người tiêu dùng và cho môi trường và đ0 được đưa ra sản xuất Tuy nhiên, các nghiên cứu này đối với cây cà chua chưa đạt đến mức thuần thục và hiệu quả cao như một số cây khác (Van Roekel et al 1993) [111], (Frary ADN Earle 1996)[58],

Báo cáo đầu tiên về chuyển gen vào cà chua là của McComick và cs (1986)[78] và từ đó một số bài báo về chuyển gen đ0 được công bố: Chyi ADN Phillips 1987[48], Fillatli và cs 1987[57], Fischoff và cs 1987, Dellannay và cs 1989, Van Roakel và cs 1993 [111], Agharbaoui và cs 1995, Frary và Earle 1996 [58], Ling và

cs 1998, Tabaeizadeh và cs 1999, Vidya và cs 2000 [113], Hu và Phillips 2001[66]; (McComick và cs,1991)[79].v.v Trong các tài liệu tham khảo đ0 có rất nhiều bài báo chỉ ra những khó khăn đối với quá trình chuyển gen vào cây cà chua

Công nghệ chín chậm (DR-Delayed Ripening) đ0 được áp dụng cho cà chua,

đu đủ và dưa hấu Một ứng dụng đáng chú ý của công nghệ DR là hiện trong nghề trồng hoa đang áp dụng công nghệ này để thử nghiệm nhằm làm chậm quá trình héo của hoa Các nhà khoa học đ0 nghiên cứu đề ra phương pháp làm chậm quá trình chín của quả giúp nông dân có thể chủ động tiêu thụ nông sản và đảm bảo cho người tiêu dùng có thể sử dụng những sản phẩm còn tươi

Các nhà khoa học trên thế giới đ0 dùng công nghệ biến đổi gen để điều khiển sự tổng hợp ethylene Lượng ethylene được tạo ra có thể được điều khiển bằng cách

“đóng” hoặc làm giảm sự tạo thành ethylene trong quả theo nhiều cách Hoặc cũng có thể điều khiển việc nhận ethylene hay ức chế hoạt tính của polygalacturonase (PG) (Bleecker, 2000) [42]

Cây trồng GM đầu tiên được chấp nhận trên thị trường là dòng cà chua 89564-2 (FlavrSavr) Chúng được tạo ra bởi Công ty Calgene-Mỹ, được phê chuẩn là

CGN-không ảnh hưởng đến môi trường vào năm 1992 và vào năm 1994, được phê chuẩn

sử dụng là thức ăn cho nguời và động vật ở Mexicô dòng cà chua này được phê chuẩn là thức ăn cho người và động vật cũng như an toàn cho môi trường vào năm

1995, Canada phê chuẩn là thực phẩm cũng vào năm 1995 Nhật Bản phê chuẩn an toàn môi trường năm 1996 và sử dụng là thực phẩm năm 1997 Dòng cà chua này

được đưa vào một gen làm cho quả cà chua mềm chậm hơn so với các giống cà chua thông thường (chín chậm), gen được dùng là gen m0 hoá polygalacturonase (PG) thuộc anti-sens, gen này có khả năng làm giảm hoạt hoá của enzyme polygalacturonase (PG), chính enzyme PG chịu trách nhiệm cho việc phân giải pectin, là chất duy trì độ cứng cho thành tế bào thực vật Việc phân giải pectin xảy

ra lúc bắt đầu quá trình chín, làm cho mềm quả Để tạo ra quả chín chậm bằng phương pháp này, các nhà khoa học đ0 chuyển gen anti-sens hoặc một đoạn bản sao của gen PG vào trong bộ gen cà chua dẫn đến sự ức chế sự tạo ra enzyme polygalacturonase (PG) Gen đánh dấu kháng kháng sinh được dùng trong quá trình chuyển gen này là gen neo giải m0 enzyme neomycin phosphotransferase II (NPTII) (có nguồn gốc từ Escherichia coli) Promotor được sử dụng là CaMV 35S và manopine synthase (A tumefaciens) (Frary 1996) [58]; Hu, 2002 [64]…

Sau khi tiến hành nghiên cứu công nghệ chín chậm và các sản phẩm của nó, các cơ quan quản lý của Hoa kỳ đ0 kết luận rằng công nghệ chín chậm là an toàn

Cà chua tạo ra nhờ công nghệ này có thành phần dinh dưỡng giống như cà chua thông thường và không có sự sai khác về mức độ dị ứng cũng như độc tố so với quả

cà chua bình thường Ngoài ra các thử nghiệm đồng ruộng cũng cho thấy cà chua chín chậm không gây ra bất kỳ một sự đe doạ nào tới những sinh vật có ích khác Giống cà chua này được dán nh0n là cà chua chuyển gen và có giá cao hơn vì nó

được cải thiện có mùi vị thơm, ngon hơn Đoạn gen được đưa vào cơ thể biến đổi gen là ổn định, tuy nhiên vào thời điểm này, Công ty Calgene chưa có các kỹ thuật

để cà chua FlavrSavr giữ nguyên chất lượng ổn định như các nh0n mác đ0 quảng cáo Vì vậy nó chỉ tồn tại trong thời gian và rồi không thấy có mặt trên thị trường (Agbios GM-Database, 2008)[32] Sau cà chua FlavrSavr các dòng (giống) cà chua chín chậm (DR) khác cũng được chấp nhận ở Hoa kỳ, Canada, Nhật và Mexico, có

một sản phẩm cà chua purée cũng đ0 được chấp nhận ở thị trường châu âu trong một thời gian

Cũng dựa trên công nghệ chín chậm (Delayed Repening - DR), dòng cà chua chuyển gen 1345-4 (Lycopersicon esculentum) được tạo ra bởi Công ty DNA Plantt Technology Corporation (Mỹ) Dòng này được tạo ra từ dòng cà chua ban đầu có tên là: 91103-114 thông qua kỹ thuật chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium Dòng cà chua này có chứa gen tổng hợp ACC m0 hoá 1-Aminocycloproparane -1-Carboxyllic Axit, gen này được tách từ cà chua Enzyme nội sinh này chịu trách nhiệm việc chuyển hoá S-adenosylmethionin (SAM) thành ACC, làm chậm quá trình sinh tổng hợp ethylene Gen đánh dấu kháng kháng sinh

được dùng trong quá trình chuyển gen này là gen neo giải m0 enzyme neomycin phosphotransferase II (NPTII) (có nguồn gốc từ Escherichia coli) Promotor được sử dụng là CaMV 35S và nopaline synthase (nos) (có nguồn gốc từ A tumefaciens)

Dòng cà chua 1345-4 đ0 được Mỹ cho thử nghiệm ngoài đồng ruộng năm

1992, có khả năng vận chuyển xa và bảo quản lâu hơn các loại cà chua khác vì quá trình sinh tổng hợp ethylene bị chậm lại Chúng được cơ quan Quản lý Thuốc và lương thực Mỹ (US FDA) phê chuẩn làm thực phẩm 1994 và phê chuẩn là an toàn môi trường năm 1995 ở Canada phê chuẩn làm thực phẩm năm 1995 và ở Mexico

được phê chuẩn như một thực phẩm năm 1998 (Agbios GM-Database, 2008) [32]

Một dòng cà chua có khả năng chín chậm khác là dòng 35-1N (Lycopersicon esculentum) cũng được ra đời nhờ công nghệ DR Dòng này đ0 được tạo ra từ dòng

cà chua Chery đỏ, quả to, thông qua kỹ thuật chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium, sử dụng vectơ nhị nguyên từ công ty Agritope Inc Mỹ Dòng cà chua này có chứa bản dịch của gen sam-K đ0 sửa đổi ở vùng 5’ với trình tự liên ứng Kozac Gen sam-K được tách từ E.coli bacteriophage T3, gen này m0 hoá enzyme hydrolaza S-adenosylmethionin (SAMase), enzyme nội sinh này chịu trách nhiệm việc chuyển hoá S-adenosylmethionin (SAM) thành ACC, làm chậm quá trình sinh tổng hợp ethylene SAM đóng một vai trò trung tâm trong rất nhiều bước của quá trình sinh tổng hợp ở thực vật Sự biểu hiện của gen sam-K dưới sự kiểm soát của một cơ quan đặc biệt ở quả và một promotor tạm thời Gen đánh dấu được dùng trong trường hợp này cũng là gen neo (tách từ E coli), promoter sử dụng cho gen

này nopaline synthase (nos) (A tumefacien) Năm 1996 dòng cà chua này được Mỹ phê chuẩn sử dụng như nguồn thức ăn và an toàn về môi trường

Gen kháng côn trùng

Một sản phẩm cà chua nữa cũng đ0 được tạo ra nhờ công nghệ biến đổi gen

đó là dòng cà chua 5345 do Công ty Monsanto tạo ra Dòng cà chua 5345

chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Chúng được cơ quan quản lý Thuốc và Lương thực Mỹ (US FDA) cho phép trồng và thử nghiệm

ở Mỹ vào năm 1994 Dòng cà chua này có chứa gen cry 1 Ac (gen này được tách từ

vi khuẩn đất Bacillus thuringiensis subsp Kursta (Bt.k), train HD73), gen này m0 hoá protein kháng sâu bọ Cry1Ac delta-endotoxin Gen đánh dấu là gen kháng kháng sinh (neo) giải m0 enzyme neomycin phosphotransferase II (NPTII) (có nguồn gốc từ Escherichia coli) và sử dụng một enzyme khác như là một marker chọn lọc vi khuẩn, 3’’ (9)-O-"(9)-O-aminoglycoside adenylyltransferase (AAD) Gen m0 hoá AAD không biểu hiện trong thực vật, nó được sử dụng trong quá trình phát triển chọn lọc các dòng vi khuẩn mà đ0 được biến nạp với các ADN của plasmid đ0 được tái tổ hợp Promotor được dùng trong trường hợp này là CaMV35S, nos promotor và promotor vi khuẩn Protein Cry1Ac tỏ ra hoạt tính kháng có tính chọn lọc cao, dòng 5345 có khả năng kháng được 1 số loài trong họ sâu bọ cánh vẩy và không hạn chế với sâu đục ngọn thuốc lá (tobacco budworm), sâu đục quả cây bông (cotton bollworm) và sâu hại cây hoa cẩm chướng (pink bollworm) Dòng

cà chua này được phê chuẩn ở Mỹ về an toàn môi trường và làm thực phẩm 1998 và phê chuẩn ở Canada như một thực phẩm năm 2000 (Agbios GM Database, Product Description 5345, 2008)[36]

Mặc dù có những thành công trong chuyển gen vào cà chua, có nhiều kết quả

và nhiều nghiên cứu rất công phu, nhưng hầu hết các quy trình từ nuôi cấy mô đến chuyển gen đều rất cồng kềnh, nặng nề và hầu như dựa quá nhiều vào yếu tố khác như các dung dịch huyền phù của thuốc lá, hay các lớp mỏng tế bào của hoa dạ yến thảo Những công thức về môi trường nuôi cấy rất mất thời gian, hoặc liên tục phải cấy chuyển, nếu không sẽ có nhiều biến dị đáng kể xẩy ra Các điều kiện tối ưu cho

chuyển gen cũng rất tản mạn, chưa được hệ thống hoá Vì vậy năm 2003, Park và

cs đ0 báo cáo các kết quả nghiên cứu về chuyển gen với 5 giống cà chua thương mại thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens Tác giả đ0 sử dụng nhiều loại mẫu cấy khác nhau: lá mầm, trụ lá mầm và lá thật với tuổi cây rất non, đặc biệt sử dụng nhiều môi trường tái sinh khác nhau Mục đích loại bớt những bước không cần thiết, nghiên cứu các môi trường làm đơn giản hơn và hiệu quả hơn quy trình tái sinh cây con trước và sau chuyển gen để có thể tăng hiệu quả gen chuyển và mong muốn tìm ra được môi trường tái sinh cây cà chua hiệu quả Tác giả đưa ra được một quy trình tương đối hệ thống có thể áp dụng cho các nghiên cứu chuyển gen cây cà chua nói chung Mặc dù các nghiên cứu của Park và cs 2003 [107] rất hệ thống và tần số biến nạp cao ở cả 5 giống được sử dụng trong nghiên cứu trên 20% Điều đặc biệt ở môi trường tái sinh không cần phải có những phụ gia như các dịch huyền phù của cà chua hay các lớp mỏng tế bào của cây thuốc lá và cây dạ yến thảo Các quy trình này có thể thực hiện rộng tới 5 giống cà chua thương mại, nhưng đó là các giống cụ thể của từng vùng sản xuất, từng kiểu gen riêng biệt Tuy nhiên Park và cs chưa đề cập đến các dạng hoang dại, đó là một nguồn gen vô cùng phong phú cho công tác chọn tạo giống cà chua, nghiên cứu của tác giả là chuyển gen chỉ thị GUS, với chủng vi khuẩn LBA4404 mang vector pBI121

Việc sử dụng các kỹ thuật khác nhau để kiểm tra sự có mặt tạm thời của gen chuyển là một trong những khâu cần thiết để xác nhận sự thành công của chuyển gen và nhân nhanh các vật liệu được chuyển gen cũng như xác định các hiệu quả của gen chuyển trong cây cà chua được chuyển gen Theo các nghiên cứu của Z.K Punja, 2001; Schlumbaum, A và cs, 1986: gen Chitinase có nguồn gốc khác nhau khi có mặt trong cây cà chua làm giảm mức độ gây bệnh của nhiều loại nấm như Botrytis cinerea, Rhizoctonia, chúng cũng làm giảm sự phát triển của Verticillium dahliae chủng 1 và 2 Sự biểu hiện của Glucanase ở các cây chuyển gen cũng gần giống như sự biểu hiện của Chitinase Sự kết hợp giữa Chitinase và Glucanase cho hiệu suất cao hơn trong việc phòng ngừa sự phát triển của các nấm gây bệnh với phổ rộng hơn so với dùng từng gen đơn lẻ (Lawrence và cs, 2000) [70] Osmotin là một protein 24- kDa thuộc họ PR - 5, nó có hoạt tính kháng nấm, khi kết hợp với

Chitinase và β - 1,3 - Glucanase thì giảm sự mẫn cảm với nấm Fusarium oxysporum f.sp (Van Roekel et al, 1993) [111] Sự có mặt của Osmotin trong cà chua chuyển gen làm chậm sự phát triển của nấm gây bệnh Phytophthora infestans

Cho đến nay, ở Việt Nam các nghiên cứu về chuyển nạp gen vào cây trồng chủ yếu được tiến hành ở Viện Di Truyền Nông Nghiệp, Viện Công Nghệ Sinh Học, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Viện Sinh Học Nhiệt Đới và một số cơ quan khác Một số dự án quốc gia và quốc tế cũng đ0 và đang tài trợ cho hướng nghiên cứu chuyển nạp gen Chúng ta đ0 bước đầu thành công trong việc chuyển một số gen có ý nghĩa kinh tế như kháng thuốc diệt cỏ, kháng sâu, bệnh, pro- vitaminA,… vào cây lúa, bắp cải, ngô, đu đủ, cây hoa Tuy nhiên những thành công này mới chỉ

Phòng Bệnh học Phân tử Thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp với sự giúp

đỡ của Viện Nghiên cứu Khoa học Nông nghiệp Pháp (INRA), đ0 thu được vector

có chứa gen Capside Protein (CP) kháng virus, đ0 chuyển thành công vào cây cà chua, khi có mặt của gen này trong cây cà chua thì nó có khả năng kháng bệnh virus Y khoai tây (Astier,2001) [37]

Viện Di truyền Nông nghiệp đ0 thu thập được vector mang gen Glucanase, Chitinase, CP, Cry và các vật liệu này đang được lưu giữ tại Phòng Bệnh học Phân

tử Thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp

L0 Tuấn Nghĩa và cs năm 1995 [15], đ0 xây dựng quy trình chuyển gen chỉ thị thông qua Agrobacterium, các tác giả cũng đ0 chọn được chủng Agrobacterium LBA 4404 là chủng thích hợp cho việc chuyển gen chỉ thị vào 7 giống cà chua Việt nam Đ0 thu được tần số biến nạp cao: 7,98% đối với mẫu là mô lá, còn đối với mẫu

Chuyển gen là một công cụ bổ sung cho chọn tạo giống truyền thống và có thể giúp cho việc mở rộng các nguồn gen có lợi sang các giống khác Hiện nay có nhiều phương pháp chuyển gen khác nhau được áp dụng thành công trên nhiều loại cây trồng

và đang từng bước được tối ưu hóa trong các phòng thí nghiệm khác nhau trên thế giới Mặc dù có những thành công trong chuyển gen vào cà chua, có nhiều kết quả và nhiều nghiên cứu rất công phu, nhưng hầu hết các quy trình từ nuôi cấy mô đến chuyển gen

đều rất cồng kềnh, nặng nề và chưa đề cập đến các dạng hoang dại, đó là một nguồn gen vô cùng phong phú cho công tác chọn tạo giống cà chua

Khai thác hệ thống những chiến lược khác nhau nhằm thu được những cây chuyển gen kháng với bệnh nấm bắt đầu thu được kết quả trong một số cây mẫu như thuốc lá, khoai tây, lúa

Có ba chiến lược phòng chống bệnh nấm có hiệu quả nhất, đó là:

(1) Chiến lược protein kháng nấm, (2) chiến lược phytoalexin kháng nấm, (3) các gen kháng đặc trưng với nòi và sự tái sinh nhân tạo của các tế bào quá mẫn cảm Một trong những chiến lược hiệu quả nhất đó là:

1 Chiến lược thứ nhất: Chiến lược protein kháng nấm

Trong những năm qua, cơ chế bảo vệ của cây trồng phản ứng lại nấm gây bệnh đ0 được nhiều nơi nghiên cứu Rõ ràng, cây trồng trong quá trình tiến hoá đ0 phát triển được cơ chế bảo vệ một cách hiệu quả với sự tham gia biểu hiện của rất nhiều gen liên quan Một số gen thực vật đóng một vai trò quan trọng trong cơ chế bảo vệ thực vật khi mà các gen này m0 hoá cho một số chuỗi peptit kháng vi sinh vật Chúng biểu hiện một cách ổn định, thường nằm trong các tầng lớp tế bào mỏng phía ngoài bao quanh các cơ quan cây [94] Chitin và β-1,3-glucans là các polisacarit cấu thành chủ yếu của thành tế bào nhiều loại nấm Sự vững chắc về mặt

N-acetylglucosamin) Việc xử lý hệ sợi của nấm với Chitinase dẫn đến các tế bào bị phá vỡ tại đỉnh sinh trưởng của sợi nấm Do vậy, chiến lược đầu tiên là đưa vào trong cây trồng một gen của một protein có những hoạt động phá vỡ thành tế bào nấm Những enzym hay dùng nhất là endochitinases và β-1,3-endoglucanases cả hai thuộc nhóm các protein liên quan đến sự phát sinh bệnh xuất hiện tự nhiên của cây (PR-Pathogenesis-related protein of plant), được cho là ức chế sự sinh trưởng của nấm, khi chúng tích tụ lại thì có những phản ứng bảo vệ của cây trồng, liên quan đến khả năng huỷ hoại thành tế bào nấm (Rho, 2001) [96] Những gen này có nguồn gốc

từ đậu đỗ, từ đại mạch, từ cỏ ba lá hay là từ lúa, chúng đ0 được chuyển vào cây thuốc lá (Binns và cs,1988)[41], (Rosen và cs,2003) [103]

Bốn loại (I-IV) endochitinase, trong đó có ba loại chính (I-III) βendoglucanase đ0 được mô tả Các loại hydrolas I đ0 được định khu trong các không bào của cây và đ0 chứng tỏ là có ảnh hưởng ức chế mạnh lên sự sinh trưởng của nấm in vitro Sự ức chế sẽ rõ ràng hơn nhiều khi ứng dụng hỗn hợp hai kiểu hydrolase, cho thấy các protein hoạt động hợp lực Ngược lại, loại hydrolas I tương

-1,3-tự như các protein loại I trên cơ sở cấu trúc ban đầu của chúng nhưng lại được định khu ngoài tế bào, không có ảnh hưởng để có thể so sánh được đối với sự sinh trưởng của nấm in vitro, không một mình mà cũng không kết hợp với các protein khác (Zupan,1995)[115]

Chitinase (enzym tổng hợp chitin) nói chung được tìm thấy ở mức thấp hoặc ở mức cơ bản trong các cây khoẻ mạnh Sự biểu hiện của nó tăng lên khi nguồn bệnh tấn công(Suzane,2001) [108] Do kết quả của sự tương tác giữa vật chủ và nguồn bệnh phụ thuộc lớn vào tính nhanh chóng và cường độ của sự hoạt hoá phản ứng bảo vệ Broglie và cs đ0 kết hợp gen CH 5B endochitinase ở cây đậu, m0 hoá một protein loại

I với đoạn promoter của gen CaMV 35S dẫn đến sự biểu hiện về cấu trúc cao trong sự

đa dạng lớn của các kiểu tế bào ở trạng thái không bị nhiễm, các cây thuốc lá chuyển gen thuần chứa các cấu trúc ảo cho thấy hoạt lực của enzym tổng hợp chitin ở các rễ của các cây đối chứng tăng lên 2-4 lần và ở các lá là 23-44 lần (De Haan,1996)[53]

Đối với đánh giá bệnh thực vật, các cây này được trồng với sự có mặt của Rhizoctonia solani, một loại nấm nhiễm từ đất, có chitin đặc hữu gây nhiễm với nhiều loại cây trồng (Lawrence, 2000)[70] Tỷ lệ chết của các cây con hay sự hao hụt trọng lượng tươi của rễ đ0 giảm một cách rõ ràng ở các cây chuyển gen khi so sánh với các cây đối chứng Điều này phụ thuộc vào việc biểu hiện số lượng chitinase từ cây đậu Khi các cây chitinase-35S được nhiễm với các nguồn nấm bệnh không có cấu trúc chitin như là Phythium aphanidermatum, sự sống sót không khác

so với các cây đối chứng Một ảnh hưởng tương tự lên mức độ kháng với Rhizoctonia

chuyển gen của cả hai loài, quy mô của sự kháng bệnh phụ thuộc vào tổng số chất lây nhiễm nấm được sử dụng, sự phân loại về tính chất chống chịu định lượng Các tác giả cho rằng tác động ức chế lên sự sinh trưởng của nấm có thể do sự thuỷ phân của các

enzym xúc tác thuỷ phân chitin mới tạo thành enzym xúc tác gây ra và sự phá vỡ như

là kết quả của các đỉnh sợi nấm sinh trưởng Sự bảo vệ chống lại Rhizoctonia solani cũng đ0 được ở cây thuốc lá chuyển gen bằng biến nạp với một cấu trúc ảo kết hợp promoter CaMV 35S với một gen chitinase từ vi khuẩn Serratia marcescens

Có một câu hỏi là liệu một mình kỹ thuật biểu hiện chitinase có thể tạo ra sự kháng các loại nguồn bệnh nấm có chitin hay không? Ví dụ khi các cây thuốc lá chuyển gen mang chitinase loại I từ cây thuốc lá dưới sự kiểm soát của promoter CaMV 35S, không tỏ ra tính tăng tính kháng với các loại nấm Cercospora nicotiana cũng chứa chitin cho dù hầu hết các cây chuyển gen biểu hiện chitinase hoạt tính enzym (enzymatically active chitinase) ở mức cao trong các gian nội bào của lá Vì vậy, các tác nhân khác ngoài chitinase dường như là hạn chế trong việc bảo vệ chống lại nguồn bệnh này Mặt khác, để hạn chế sự lan truyền của các nguồn bệnh này, protein kháng nấm có thể được nhằm tới khoảng không gian ngoại bào - vị trí thuận lợi hơn cho sự sinh trưởng của nấm Cercospora và một vài loại nấm gây bệnh khác Trong khi thử nghiệm để xác định đích hydrolase loại I ở bên ngoài tế bào, Carnelissen và cs đ0 biến đổi một chitinase và một β-1,3-glucanase từ cây thuốc lá Trong các cây chuyển gen, hai enzym thuỷ phân đ0 được phát hiện bên ngoài tế bào

và cả hai vẫn giữ được hoạt tính kháng nấm của chúng trong vitro hoạt tính đ0 được tăng cường khi ứng dụng kết hợp các protein (Cangecose,1987)[53]

Nhóm J.Ryals tại CIBA, Research Triangle Park (USA) đ0 thông báo về sự bảo

vệ của các cây thuốc lá chuyển gen chống lại các nguồn bệnh nấm đủ loại như là kết quả của sự biểu hiện ở mức cao các protein kết hợp với tính kháng được nội hấp (synthetic acquired resistance-SAR) trong các cây này Đa số các protein SAR này thuộc về nhóm các protein PR Điển hình là sự tích luỹ mRNA của chúng không chỉ trong các lá sơ cấp bị nhiễm bệnh mà còn trong các lá thứ cấp không bị nhiễm Mục

đích của nghiên cứu này là bảo vệ trên một phạm vi rộng chống lại các nguồn bệnh bằng việc kết hợp sản xuất quá mức các protein SAR trong các cây chuyển gen

Các protein bất hoạt Riboxom từ thực vật (Riboxom - inactivating proteins, RIPs) đ0 cho các khả năng khác tiến gần đến thử nghiệm để hạn chế một cách đặc hiệu quá trình trao đổi chất của nấm Các enzym này hạn chế việc tổng hợp protein

trong các tế bào đích nhờ sự phân tách N-glycosidic của ARN 28 S Có hai dạng RIP: Dạng một, protein chuỗi đơn, và dạng hai, protein bao gồm hai chuỗi, một chuỗi tạo ra galactose - một dạng lectin đặc trưng có thể gắn với bề mặt tế bào Gần

đây cho biết RIPs nằm trong số các độc tố tự nhiên hiệu lực nhất, mà được biết đến nhiều nhất trong số này là ricin RIPs không cản trở chức năng của “bản thân” các ribosome nhưng lại gây ra các hoạt động ức chế khác nhau về phía các ribosome của các loài có họ hàng xa, kể cả các ribosome nấm Kiểu RIP I được tinh chế từ lúa đại mạch ức chế sự sinh trưởng của nấm in vitro, và tác dụng của nó càng được tăng cường nhờ các enzyme tổng hợp chitin và β-1,3-glucanase loại I Đặc tính này của RIPs đ0 được Logemann và cs, sử dụng để tăng cường tính kháng với nấm Rhizoctonia Solani ở cây thuốc lá được chuyển gen Gen RIP dạng I ở đại mạch đ0

được đưa vào dưới sự kiểm soát của promoter wun 1 tách từ khoai tây làm trung gian

điều hoà giữa vết thương và tác nhân cảm ứng bệnh, nó giải m0 trong biểu bì của lá, thân và rễ của thuốc lá biến nạp Broglie và cs phát hiện thấy các thế hệ được biến

chitinase mạnh hơn, cho các tỉ lệ sống sót cao hơn và phát triển tốt hơn trong đất bị nhiễm nặng với Rhizoctonia Solani so với các cây đối chứng Ngược lại, các cây chuyển gen không được bảo vệ kháng lại Pythium aphnidermatum - một tác nhân gây bệnh mà thành tế bào của nó không chứa chitin (Hamilson,1997) [60], (Hooykaas, 1992)[61]

Các tác giả đ0 cho thấy là ARNm RIP và protein tích luỹ lại trong lá của các cây chuyển gen này nhằm phản ứng lại các tổn thương Tuy nhiên, số liệu chứng tỏ

sự tương quan giữa mức độ biểu hiện của cấu trúc tổng hợp và mức độ kháng đ0 không được công bố Trong khi đó, một số lượng lớn các protein có tác dụng ức chế

sự sinh trưởng của các nấm in vitro đ0 được nhận biết từ thực vật Trong số này có Osmotin, một protein không bào được tạo ra từ cây thuốc lá để phản ứng lại stress mặn và các protein giầu cystein, cơ bản, trọng lượng phân tử thấp từ các nguồn gốc khác nhau (Martin,1991) [75] Hơn nữa, các vi sinh vật như nấm Aspergillus ginanteus, cũng tạo ra các peptid kháng nấm như thế Chức năng của các protein này trong cây chuyển gen vẫn đang được kiểm tra (Cangelosi,1990) [45];

(Carrington,1990) [47]

Trong số các chuỗi peptit kháng vi sinh vật do thực vật sản sinh ra trong quá trình bảo vệ, người ta biết đến thionine giàu amino acid cysteine, các protein đóng vai trò vận chuyển lipid, các chất bảo vệ (Defensins), và gần đây nhất là một chất mới được phát hiện từ rắn Protein Defensine là những thành phần trong hệ thống miễn dịch bẩm sinh thực vật

Protein Defensine thực vật có trọng lượng phân tử nhỏ (<10 kDa), thành phần protein cơ bản cao và thường chứa đựng một lượng cystein lắng đọng (điển hình là 4, 6 hoặc 8) Đặc tính tốt nhất là khả năng ức chế của nó với các hiệu lực khác nhau và các phổ nấm hại khác nhau

Dựa trên ảnh hưởng của defensine thực vật lên sự phát triển và hình thái học của nấm Fusarium culmorum, nó được phân loại thành 2 nhóm Defensine tạo hình gây giảm sự kéo dài sợi nấm nhưng kèm theo tăng tạo nhánh của sợi nấm, nhưng ngược lại Defensine không tạo hình sẽ gây giảm tốc độ kéo dài sợi nấm, nhưng không gây ra sự méo mó hình dạng Defensine thực vật mà chúng tôi sử dụng trong thí nghiệm này là Defensine tạo hình Rs-AFP2 Cơ chế chính xác về khả năng ức chế sự phát triển của nấm hại chưa được hiểu biết hết, nhưng nhìn chung đều chấp nhận rằng chúng hoạt động ở vị trí màng nguyên sinh chất

Dựa trên cơ sở nấm phát triển từ đỉnh và đòi hỏi sự duy trì gradient nồng độ

làm thay đổi tiềm năng màng tế bào cũng như thay đổi sự thẩm thấu màng tế bào

Hiện giả định có 2 cơ chế kháng vi sinh vật của những peptid cation như vậy Những thành công ban đầu trong việc chuyển gen tạo ra cây trồng có sức đề kháng nhiều loại bệnh đ0 được ghi nhận Các chất bảo vệ cây là các peptit có từ 45 đến 54 amino acid với tám amino acid Cysteine có mối liên kết đôi lưu huỳnh đóng vai trò quan trọng cho hoạt tính sinh học của các chất bảo vệ Các chất bảo vệ này đầu tiên

được phát hiện trong hạt, nhưng sau đó người ta đ0 phát hiện ra chúng còn có mặt

đồng thời trong rất nhiều cơ quan cây và các loại mô trong cây Những hoạt tính kháng nấm hại cây của các chất bảo vệ này mạnh hay yếu phụ thuộc rất nhiều vào từng loại nấm gây bệnh (Terras G và cộng sự, 1995)[110] Việc chuyển những gen

quy định tổng hợp những chất này vào cây đ0 được sử dụng rất thành công trong việc nâng cao sức kháng bệnh của cà chua đối với các loài nấm Alternaria và Oidium (Veluthambi,2003)[112]

2 Chiến lược thứ hai: chiến lược các phytoalexin kháng nấm

Trong nhiều hệ thống kí chủ/ tác nhân bệnh, người ta đ0 phát hiện ra mối tương quan giữa nồng độ của các phytoalexin và tính kháng với các tác nhân bệnh

đặc biệt Những điều tra nghiên cứu đ0 tìm thấy chứng cớ về mặt di truyền cho mối quan hệ nhân quả của sự tương tác giữa cây đậu Hà Lan và Nectria haematococca Trong trường hợp này, tính kháng của cây chủ bị yếu hẳn đi do có mặt của gen pda của nấm, giải m0 một enzym pisatin demethylas nó khử độc tố phytoalexin pisatin từ cây đậu Hà Lan

ở Vitis vinifera và Picea sitchensis, các stllbene có liên quan đến tính kháng, chống lại sự tấn công của nấm Các tín hiệu sinh vật (biotic) và không sinh vật (abiotic) khác nhau đ0 được thể hiện để kích thích sự tích lũy của chúng, và để hoạt hóa các gen cho các enzym then chốt điều khiển quá trình sinh tổng hợp của chúng, phenylalanin- ammonialyas và enzym tổng hợp từ stillben Hầu hết các cây trồng ví

dụ như thuốc lá, chứa các tiền chất cho sự hình thành stillbene nhưng lại thiếu enzym tổng hợp stillbene Sau khi chuyển một gen synthas stillben từ cây nho sang cây thuốc lá, các cây chuyển gen đ0 biểu hiện gen ngoại lai khi phản ứng với việc sử lí các nấm xâm nhập hoặc sau khi nhiễm với nguồn bệnh nấm botrytis cinerea trên phạm vi rộng và đ0 tích lũy stillbene resveratrol Khi so sánh với các cây đối chứng,

2 trong số 3 dòng thuốc lá chuyển gen mang gen tổng hợp stillben lấy từ cây nho thì

tỉ lệ phần trăm vùng lá bị bệnh đ0 giảm sau khi nhiễm với Botrytis cinerea Hiện tượng các bệnh ít xảy ra trên lá tương quan trực tiếp với số resveratrol được tích lũy với sự hoạt hóa gen tổng hợp stillben Các tác giả cũng đ0 đưa ra các bằng chứng về các kiểu hình có tính kháng tăng cường được di truyền ổn định ở đời con F1 (Zang,1999) [114] Điều này cho thấy có vẻ như là ít nhất ở một vài hệ thống bệnh,

sự tổng hợp các phytoalexin đóng một vai trò quyết định cho sự bảo vệ của cây chủ

Để quyết định xem liệu chiến lược này có thể ứng dụng chung để làm tăng tính kháng bệnh hay không, các nhà khoa học vẫn tiếp tục phân tích sự phản ứng của các