Nghiên cứu chuyển gen kháng bệnh nấm vào một số giống cà chua thông qua vi khuẩn agrobacterrium tumefaciens

Luận văn, thạc sỹ, tiến sĩ, cao học, kinh tế, nông nghiệp

Bộ GIáO DụC Và ĐàO TạO TRƯờNG ĐạI HọC NÔNG NGHIệP Hà NộI Bùi Thị Lan Hơng Nghiên cứu chuyển gen kháng bệnh nấm vào một số giống cà chua thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens LUậN áN TIếN Sĩ NÔNG NGHIệP Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng Mã số : 62 62 05 01 Ngời hớng dẫn: PGS. TS. Lê Thị ánh Hồng PGS.TS. Nguyễn Hồng Minh Hà NộI - 2010 Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn tin s nụng nghip . i Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn tin s nụng nghip . i Lời cam đoan Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này là trung thực và cha đợc sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án này đ đợc cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận án đều đ đợc chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả Bùi Thị Lan Hơng Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn tin s nụng nghip . ii Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn tin s nụng nghip . ii Lời cảm ơn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Nguyễn Hồng Minh - Trởng Bộ môn Di truyền Chọn giống cây trồng- Trờng Đại học Nông Nghiệp Hà Nội và PGS.TS. Lê Thị ánh Hồng - Nguyên là Phó Viện Trởng Viện Di truyền Nông nghiệp là những ngời thầy đ tận tình giúp đỡ, hớng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi và chia sẻ những khó khăn cùng tôi trong suốt 5 năm liền thực hiện và hoàn thành luận án này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng lời cám ơn chân thành đến GS.TS. Trần Tú Ngà ngời đ hết lòng giúp đỡ chỉ bảo tôi những kiến thức về di truyền học, những tài liệu tham khảo chuyên môn quý giá và cũng luôn động viên tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án. Trong thời gian qua, tôi đ nhận đợc sự giúp đỡ quý báu của Ban lnh đạo Viện Di truyền Nông nghiệp, các cán bộ, các bạn bè đồng nghiệp trong Phòng Bệnh học Phân tử Thực vật và Bộ môn Di truyền và Công nghệ Lúa lai - Viện Di Truyền Nông Nghiệp, ban lnh đạo Viện Môi Trờng Nông Nghiệp, Bộ môn Môi Trờng Nông Thôn. Nhân dịp này tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo Viện Đào tạo Sau đại học, Khoa Nông học và Bộ môn Di truyền và Chọn giống Cây trồng - Trờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội đ tạo điều kiện giúp tôi hoàn thành tốt mọi mục tiêu nghiên cứu và mọi thủ tục để có thể hoàn thành luận án này. Tôi rất biết ơn những ngời thân trong gia đình tôi đ luôn bên tôi quan tâm và tạo điều kiện tốt cho tôi học tập và nghiên cứu. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu của các tập thể và cá nhân đ dành cho tôi. Tác giả Bùi Thị Lan Hơng Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn tin s nụng nghip . iii Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn tin s nụng nghip . iii Mục lục Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt vii Danh mục bảng ix Danh mục hình xi Mở đầu 1 1 Tính cấp thiết của đề tài 1 2 Mục tiêu của đề tài 2 3 ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án 2 4 Những đóng góp mới của luận án 3 5 Đối tợng và phạm vi nghiên cứu 3 Chơng 1 Tổng quan tài liệu 4 1.1 Cơ sở khoa học và thực tiễn của đề tài 5 1.2 Nguồn gốc, phân loại và giá trị dinh dỡng cây cà chua 6 1.2.1 Nguồn gốc cây cà chua 6 1.2.2 Phân loại cây cà chua 7 1.2.3 Giá trị của cà chua 8 1.3 Sự phân bố và sản xuất cà chua 9 1.3.1 Tình hình phân bố và sản xuất cà chua trên thế giới 9 1.3.2 Tình hình phân bố và sản xuất cà chua ở Việt Nam 10 1.4 Một số nghiên cứu về chọn tạo giống cà chua 11 1.4.1 Những nghiên cứu về chọn tạo giống cà chua theo các phơng pháp truyền thống 11 1.4.2 Nghiên cứu chọn giống bằng phơng pháp chuyển gen 15 1.5 Chiến lợc phòng chống bệnh nấm 21 Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn tin s nụng nghip . iv Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn tin s nụng nghip . iv 1.6 Chuyển nạp gen ở thực vật 29 1.6.1 Các phơng pháp chuyển nạp gen ở thực vật 29 1.6.2 Các phơng pháp chuyển gen ở thực vật 29 1.7 Kỹ thuật nuôi cấy in vitro ứng dụng trong công nghệ chuyển gen 33 1.7.1 ứng dụng nuôi cấy in vitro trong xây dựng các hệ thống tái sinh mạnh phục vụ cho thao tác gen 33 1.7.2 ứng dụng công nghệ in vitro trong việc nhân nhanh giống cây trồng mang gen chuyển và lu giữ các nguồn gen quý hiếm 35 1.8 Một số thành tựu về thu nhận cây trồng chuyển gen và khả năng ứng dụng 36 1.8.1 Một số thành tựu về cây trồng chuyển gen 36 1.8.2 Môi trờng pháp lý đối với cây trồng chuyển gen 37 Chơng 2 Vật liệu, nội dung và phơng pháp 40 2.1 Vật liệu nghiên cứu 40 2.2 Nội dung nghiên cứu 41 2.3 Phơng pháp nghiên cứu 44 2.4 Phơng pháp xử lý số liệu 50 Chơng 3 Kết quả nghiên cứu và thảo luận 51 3.1 Một số kết quả nghiên cứu quy trình tái sinh cây cà chua phục vụ cho công tác chuyển gen 51 3.1.1 ứng dụng kỹ thuật DAS-ELISA để kiểm tra tình hình sức khoẻ hạt cà chua trớc khi đa vào nuôi cấy In vitro 51 3.1.2 Nghiên cứu quy trình tái sinh cây cà chua phục vụ cho công tác chuyển gen 53 3.2 Những kết quả ban đầu về chuyển gen kháng nấm Glucanase vào 3 giống (dòng) cà chua 84 3.2.1 Khả năng tái sinh của hai giống cà chua Balan, H18 và dòng dại L. pennelli trong điều kiện không có kháng sinh 84 3.2.2 Tiền biến nạp 86 Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn tin s nụng nghip . v Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn tin s nụng nghip . v 3.2.3 Quá trình biến nạp gen kháng nấm Glucanase 86 3.2.4 Nghiên cứu khả năng tái sinh của các mẫu cấy trên môi trờng có chứa kháng sinh 87 3.2.5 Đánh giá hiệu quả biến nạp 95 3.2.6 Kiểm tra sự có mặt tạm thời của các gen chuyển 98 3.3 Kết quả chuyển gen defensin vào cà chua 103 3.3.1 Khả năng tái sinh cây in vitro của hai giống cà chua H18 và L. pennelli trong điều kiện không có kháng sinh 104 3.3.2 Tiền nuôi cấy và biến nạp 104 3.3.3 Quá trình biến nạp gen Defensin 105 3.3.4 Các kết quả nghiên cứu khả năng tái sinh của các mẫu cấy trên môi trờng có chứa kháng sinh 106 3.3.5 Đánh giá hiệu quả biến nạp 112 3.3.6 Kiểm tra sự có mặt tạm thời của các gen chuyển 114 3.4 Kết quả chuyển gen Chitinase vào cà chua p375 và Pháp lùn 118 3.4.1 Khả năng tái sinh của hai giống cà chua P375 và Pháp lùn trong điều kiện không có kháng sinh 118 3.4.3 Quá trình biến nạp gen Chitinase 119 3.4.3 Các kết quả nghiên cứu khả năng tái sinh của các giống sau khi biến nạp gen Chitinase 120 3.4.4 Hiệu quả biến nạp Chitinase vào c chua P375 và Pháp lùn 125 3.4.5 Kiểm tra sự có mặt tạm thời của gen chuyển 127 Kết luận và đề nghị 129 Kết luận 129 Đề nghị 130 Các công trình đã công bố có liên quan đến luận án 131 Tài liệu tham khảo 132 Phụ lục 143 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp . vi Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp . vi Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn tin s nụng nghip . vii Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn tin s nụng nghip . vii Danh mục các chữ viết tắt Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ ABA Abcisic acid BA Benzyladenine BAP 6-benzyl aminopurine BDĐ Bất dục đực BHPTTV Bệnh học Phân tử Thực vật bp Base pair (cặp nucleotide) CAMBIA Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture CaMV Cauliflower Mosaic Virus CchCG Cà chua chuyển gen Cd Kim loại nặng Cadmi Chi 11 Chitinase (gen) CP Coat Protein CPMV Virus khảm đậu mắt cua (Cowpea mosaic virus) DAS Double Antibody SADNwich DCCh Dòng cà chua DCChCG Dòng cà chua chuyển gen ELISA Enzym linked Immuno Sorbent Assay EtBt Ethidium bromide GA3 Gilberic Acid FEC Mô sẹo phôi xốp HCN Acid Cyanhydric HNL Hydroxynitrile lyase IAA Indolleacetic acid IBA Indole-3-butyric acid IgG kháng thể đặc hiệu kb Kilobase (s) Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp . viii Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp . viii kDa KiloDalton (S) INT-violet Iodonitrotetrazolium violet Ki Kinetin KLN Kim lo¹i nÆng LMV Lecttus mosaic virus MTF Metalloth ioneins MS Murashige ADN Skoog NAA Naphthalenacetic Acid NADP Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate PCR Polymerase Chain Reaction PNPP ParanitrophÐnyl phosphate PPO Polyphenol oxidase PVDF PolyVinylidene Dilfluoride PVX Potato Virus X PVY Potato Virus Y Sd §é lÖch chuÈn SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophores TBC TÕ bµo chÊt ToMV Tomato Mosaic Virus TMV Tobacco Mosaic virus vir Virulence (gen) v/v Thể tích / thể tích Z Zeatin Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn tin s nụng nghip . ix Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn tin s nụng nghip . ix Danh mục bảng STT Tên bảng Trang 3.1 Kết quả kiểm tra virus ToMV và TMV bằng kỹ thuật DAS- ELISA 52 3.2 Hiệu quả của thời gian xử lý lên tỷ lệ sống sót của hạt cà chua 54 3.3 ảnh hởng của các nồng độ và tổ hợp khác nhau của Kinetin với IAA và NAA lên quá trình tạo mô sẹo (callus) 57 3.4 ảnh hởng của các nồng độ và tổ hợp khác nhau của Zeatin với IAA và NAA lên quá trình tạo mô sẹo (callus) 59 3.5 ảnh hởng của các nồng độ và tổ hợp khác nhau của BA với IAA và NAA lên quá trình tạo mô sẹo (callus) 62 3.6 ảnh hởng của các tổ hợp, các nồng độ Kinetin lên quá trình tạo chồi 65 3.7 Kết quả nghiên cứu sự ảnh hởng của các tổ hợp, các nồng độ BA lên quá trình tạo chồi 67 3.8 Kết quả nghiên cứu sự ảnh hởng của các tổ hợp, các nồng độ Zeatin lên quá trình tạo chồi 69 3.9 ảnh hởng của các nồng độ và tổ hợp khác nhau của Kinetin với IAA và NAA lên quá trình nhân chồi. 72 3.10 Kết quả nghiên cứu sự ảnh hởng của các tổ hợp khác nhau của BA với IAA và NAA lên quá trình nhân chồi 74 3.11 Kết quả nghiên cứu sự ảnh hởng của các nồng độ và tổ hợp khác nhau của Zeatin với IAA và NAA lên quá trình nhân chồi. 77 3.12 ảnh hởng của các tổ hợp khác nhau của NAA kết hợp với một số Cytokinin (Kinetin, Zeatin và BA) lên quá trình tạo cây hoàn chỉnh 80 3.13 ảnh hởng của các nồng độ và tổ hợp khác nhau của chất kích thích sinh trởng IAA kết hợp với một số Cytokinin (Kinetin, Zeatin và BA) lên quá trình tạo cây hoàn chỉnh 82 . NGHIệP Hà NộI Bùi Thị Lan Hơng Nghiên cứu chuyển gen kháng bệnh nấm vào một số giống cà chua thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens LUậN áN TIếN Sĩ. quy trình chuyển gen kháng nấm Chitinas-Glucanas và Glucanase-Osmotin thông qua vi khuẩn Agrobacterrium tumefaciens vào một số dòng, giống cà chua nh P375