Tóm tắt luận văn Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu chuyển gen kháng bệnh nấm vào một số giống cà chua thông qua vi khuẩn Agrobacterium Tumefaciens

32 69 0
Tóm tắt luận văn Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu chuyển gen kháng bệnh nấm vào một số giống cà chua thông qua vi khuẩn Agrobacterium Tumefaciens

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

Luận án xác định các môi trường nuôi cấy, tái sinh cây, thiết lập hệ thống biến nạp các gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium Tumefaciens nhằm thu nhận các cây tái sinh mang các gen chuyển ở một số giống cà chua. Mời các bạn cùng tham khảo luận án để nắm chi tiết nội dung nghiên cứu.

Bộ GIáO DụC Và ĐàO TạO TRƯờNG ĐạI HọC NÔNG NGHIệP H NộI Bùi Thị Lan Hơng Nghiên cứu chuyển gen kh¸ng bƯnh nÊm vμo mét sè gièng cμ chua thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens Chuyên ngành: Di truyền chọn giống trồng Mã số : 62 62 05 01 tóm tắt LUậN áN TIếN Sĩ NÔNG NGHIệP Ngời hớng dẫn : PGS TS Lê Thị ánh Hồng PGS.TS Nguyễn Hồng Minh H NộI - 2010 Công trình hoàn thành tại: TRƯờNG ĐạI HọC NÔNG NGHIệP Hà NộI Ngời hớng dẫn khoa học: PGS.TS Lê Thị ánh Hång PGS.TS Ngun Hång Minh Ph¶n biƯn 1: PGS.TS Nguyễn Thị Ngọc Huệ Trung tâm Tài nguyên thực vật Phản biện 2: TS Đặng Trọng Lơng Viện Di truyền nông nghiệp Phản biện 3: PGS.TS Ngô Bích Hảo Trờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội Luận án đợc bảo vệ hội đồng chấm luận án cấp Trờng họp tại: Trờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội Vào hồi 8h30', ngày 23 tháng 11 năm 2010 Có thể tìm hiểu luận án th viện: - Th viện Quốc gia Việt Nam - Th viện Trờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội Mở đầu Tính cấp thiết đề tài Cây cà chua (Lycopersicon esculentum Mill) trồng đợc nhập nội vào nớc ta 100 năm trớc Hiện nay, đờng nhập nội giống, thu thập đợc tập đoàn gen khoảng 1000 mẫu giống cà chua khác tập trung Viện Nghiên cứu, trờng Đại học, tØnh N−íc ta ®iỊu kiƯn thêi tiÕt nãng Èm, ma nhiều điều kiện thuận lợi cho nhiều loại bệnh phát sinh gây hại cho C Chua điều kiện vờn ơm đồng ruộng Các loại bệnh hại không ảnh hởng lên suất mà ảnh hởng nghiêm trọng lên chất lợng quả, giảm khả thơng phẩm Vì hàng năm ngời sản xuất cà chua phải sử dụng lợng thuốc BVTV lớn để bảo vệ suất chất lợng qu mình, làm ô nhiễm môi trờng Những giống cà chua có khả kháng đợc nhiều loại bệnh khác giúp nhiều cho ngành sản xuất cà chua nói chung, vấn đề có ý nghĩa lớn nông nghiệp Chuyển gen công cụ hiệu bổ sung cho chọn tạo giống truyền thống giúp cho việc mở rộng nguồn gen có lợi sang giống khác Công nghệ chuyển gen cung cấp lợi việc chuyển gen đơn chí gen số lợng, tránh đợc khó khăn mà phơng pháp chọn tạo giống truyền thống phải đơng đầu Cho đến nhà khoa học chuyển thành công số gen vào cà chua nhằm tạo giống cà chua có suất chất lợng cao Các vector đợc cắt, sửa chữa có tiềm to lớn tiếp tục bổ sung cho phơng pháp chuyển gen qua Agrobacterium Frary Earle (1996) Chính thực đề tài: Nghiên cứu chuyển gen kháng bệnh nấm vào số giống cà chua thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Mục tiêu đề tài Xác định môi trờng nuôi cấy, tái sinh cây, thiết lập hệ thống biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens nhằm thu nhận tái sinh mang gen chuyển số giống cà chua Nội đung đề tài Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Xác định môi trờng nuôi cấy in vitro thu cà chua tái sinh để ii phục vụ cho chuyển nạp gen 1.1 Kiểm tra tình trạng bệnh vật liệu cà chua trớc đa vào nuôi cấy mô in vitro b»ng kü tht ELISA t¹i ViƯt Nam 1.2 Xác định môi trờng nuôi cấy tạo mô sẹo tối u từ mẫu cấy khác (lá mầm, trụ mầm thật non) số dòng, giống cà chua thí nghiệm 1.3 Nghiên cứu số yếu tố cho khả cao tái sinh in vitro từ mẫu cấy khác (lá mầm, trụ mầm thật non) số dòng, giống cà chua Đây nghiên cứu làm sở cho thành công biến nạp gen Nội dung 2: Nghiên cứu chuyển gen kháng nấm Glucanase- Osmotin vào giống cà chua Balan, H18 dòng dại L.pennelli Nội dung 3: Nghiên cứu chuyển gen Defencin kháng nấm vào cà chua H18 dòng dại L.pennelli Nội dung 4: Nghiên cứu chuyển gen Chitinase vào cà chua P375 giống Pháp lùn ý nghÜa khoa häc vµ thùc tiƠn cđa ln án: - Đã xác định đợc điều kiện qui trình tái sinh cà chua in vitro ứng dụng cho chuyển nạp gen mục tiêu nghiên cứu khác - Đã góp phần xác định đợc hiệu sử dụng vector đúp hữu ích (Vector mang gen Chitinas-Glucanas vµ vector mang gen Glucanase- Osmotin) chun nạp gen vào số giống cà chua nghiên cứu - Đây tài liệu có hàm lợng khoa häc tèt vỊ c«ng nghƯ nu«i cÊy in vitro, chun nạp gen cà chua Chúng có giá trị tham khảo nghiên cứu công nghệ sinh học nông nghiệp ứng dụng công tác giảng dạy trờng đại học Những đóng góp luận án 5.1 Luận án xác định đợc môi trờng nuôi cấy nhằm thu nhận cà chua tái sinh giống P 375, H18, Ba lan giống Pháp lùn, đặc biệt loài cà chua dại L pennelli 5.2 Lần Việt nam thực thành công quy trình chuyển gen kháng nấm Chitinas-Glucanas Glucanase-Osmotin thông qua vi khuẩn Agrobacterrium tumefaciens vào số dòng, giống cà chua nh P375 H18 để tạo giống kháng nấm 5.3 Đã tạo đợc số dòng cà chua kháng nấm mang gen kh¸ng nÊm nh− Defensin (gièng H18), Chitinase (gièng P375), Glucanase (gièng Balan) Sù cã mỈt cđa gen chun đợc kiểm tra phơng pháp định tính (sinh học) phân tử iii Đối tợng phạm vi nghiên cứu 6.1 Đối tợng nghiên cứu: -Đề tài sử dụng chủng vi khuẩn : +Chñng vi khuÈn Agrobacterium tumerfaciens EHA 105 + Chñng vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens LBA4404 -Các giống cà chua: +Ba lan, Pháp lùn, P375 , H18 dòng cà chua dại L Pennelli 6.2 Phạm vi nghiên cứu: - Nghiên cứu đa môi trờng tạo callus tái sinh có hiệu phục vụ cho thí nghiệm chuyển nạp gen - Thực qui trình chuyển nạp gen nhằm thu đợc cà chua tái sinh mang gen chuyển thẩm định có mặt chúng phơng pháp thị phân tử 6.3 Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Phòng Bệnh Học Phân Tử Viện Di Truyền Nông nghiệp Từ Liêm Hà Nội Trại Thực nghiệm Viện Di truyền Nông nghiệp Văn Giang Hng Yên Thời gian nghiên cứu: 2004-2008 Bố cục luận án Nội dung luận án đợc thể 129 trang, gồm trang mở đầu, 35 trang tổng quan, 11 trang vật liệu, nội dung phơng pháp nghiên cứu, 77 trang kết nghiên cứu thảo luận, trang kết luận đề nghị, tài liệu tham khảo với 30 tài liệu tiếng Việt, 85 tài liệu tiếng Anh Kết nghiên cứu có 19 bảng, 11 biểu đồ, 43 hình hình ảnh thí nghiệm Phần phụ lục bao gồm bảng, kết phân tích xử lý số liệu CHƯƠNG tổNG QUAN TI LIệU Trên sở tổng hợp phân tích nhận thấy rằng: Công tác tạo, chọn giống cà chua nớc ta đợc quan tâm trọng ý nghĩa kinh tế loại Các giống cà chua chủ yếu đợc chọn tạo theo phơng pháp truyền thống nhập nội lai tạo Chuyển gen công cụ bổ sung cho chọn tạo giống truyền thống giúp cho việc mở rộng nguồn gen có lợi sang giống khác Mặc dù có thành công chuyển gen vào cà chua, có nhiều kết nhiều nghiên iv cứu phức tạp nhiều công đoạn nhng hầu hết quy trình từ nuôi cấy mô đến chuyển gen cồng kềnh, nặng nề cha đề cập đến dạng hoang dại, nguồn gen vô phong phú cho công tác chọn tạo giống cà chua Có nhiều phơng pháp chuyển gen khác nhau: chuyển gien trực tiếp gián tiếp Trong phơng pháp chuyển gen chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium phơng pháp tối u thờng đợc sử dụng hai mầm Để thực thành công nghiên cứu chuyển gen khâu quan trọng tái sinh in vitro, hệ số tái sinh cao hiệu chuyển gen lớn, đồng nghĩa với hệ số chuyển gen thu đợc cao Một số trồng sản phẩm nông nghiệp biến đổi gen đợc nhập vào nớc ta qua đờng thức không thức Đang tồn thực trạng việc xác định đánh giá trồng biến đổi gen đợc thực với chuyển gen đợc tạo Việt Nam, quan tạo chúng, nguồn trồng sản phẩm biến đổi gen nhập nội vòng kiểm soát CHƯƠNG VậT LIệU, NộI DUNG V PHƯƠNG PHáP nghiên cứu 2.1 Vật liệu nghiên cứu Các giống, dòng cà chua đợc sử dụng: - Balan, Pháp lùn: Các giống đợc trồng sản xuất từ lâu - P375, H18: Nhập nội từ Đài loan - Dòng cà chua dại L.pennelli (dòng có chứa gen bất dục đực TBC) đợc cung cấp từ AVRDC (Đài loan), với mục đích nghiên cứu làm vËt liƯu t¹o gièng −u thÕ lai KiĨm tra ®é nhiƠm bƯnh virus cđa gièng chóng t«i sư dơng hạt giống từ nguồn khác : Từ Viện Di truyền Nông nghiệp, trung tâm AVRDC số đợc lấy từ trạm giống - Hai Virus đợc nghiên cứu thí nghiệm loại virút lan truyền qua hạt + Virus gây bệnh khảm cà chua (Tomato Mosaic Virus - ToMV) Đợc miêu tả Broadbent, (1976) v + Virus gây bệnh khảm thuốc (Tobacco Mosaic virus - TMV) Đợc miêu tả Samuel G., (1934) Cả hai thuộc nhóm Tobamovirus - Các loại kháng thể đặc hiệu (IgG) kháng thể có gắn enzyme virut ToMV TMV đợc cung cấp từ Hãng Bio-RAD, Pháp Chủng vi khuẩn Vector mang gen kháng nấm: - Chủng vi khuÈn Agrobacterium tumefaciens EHA105 cã chøa plasmid pCAMBIA 1300 GLU-AP (Osmotin), mang gen kháng nấm: Glucanase-Osmotin, Chitinase gen kháng Hygomicine (hpt) Gen hpt có promoter 35S, gen Glucanase-Osmotin có promoter A9, promoter hoạt động mạnh genome thực vật, - Chủng vi khuÈn Agrobacterium tumefaciens LBA4404, cã chøa vector pBI121 mang gen kháng nấm: Defensin gen kháng Kanamicin (nptII) Gen nptII cã promoter Nos, cßn gen Defensin cã promoter CaMV35S, promoter hoạt động mạnh genome thùc vËt 2.2 Néi dung nghiªn cøu: Néi dung 1: Xác định môi trờng nuôi cấy in vitro thu cà chua tái sinh phục vụ cho chuyển nạp gen a ứng dụng kỹ thuật DAS-ELISA để kiểm tra tình hình nhiễm bệnh virus hạt cà chua trớc đa vào nuôi cấy In vitro b Nội dung phục vụ cho nghiên cứu tái sinh cà chua in vitro Nghiên cứu công thức khử trùng mẫu Nghiên cứu khả phát sinh mô sẹo (callus) quan khác Nghiên cứu khả phát sinh chồi quan khác Nghiên cứu khả nhân chồi quan khác Tạo hoàn chỉnh Nội dung 2: Nghiên cứu chuyển gen Glucanase-Osmotin vào giống cà chua Balan, H18 dòng dại L pennelli Xây dựng quy trình chuyển gen Glucanase-Osmotin vào cà chua thông qua chủng vi khuẩn Vector mang gen kh¸ng nÊm: - Chđng vi khn Agrobacterium tumefaciens EHA105 cã chøa plasmid pCAMBIA 1300 GLU-AP (Osmotin), mang gen kh¸ng nấm: Glucanase-Osmotin gen kháng Hygomicine (hpt) Gen hpt có promoter 35S, gen Glucanase-Osmotin có promoter A9, promoter hoạt động mạnh genome thực vật vi Đánh giá hiệu suất chuyển gen kiểm tra có mặt tạm thời gen chuyển Thu đợc cà chua có gen Glucanase-Osmotin Nội dung :Nghiên cứu chuyển gen Defencin kháng nấm vào cà chua H18 Licopersicon pennelli Nghiên cứu trình chuyển gen Defensin vào cà chua thông qua chủng vi khuẩn Vector mang gen kháng nấm sau: - Chñng vi khuÈn Agrobacterium tumefaciens LBA4404, cã chøa vector pBI121 mang gen kháng nấm: Defensin gen kháng Kanamycin (nptII) Gen nptII cã promoter Nos, cßn gen Defensin có promoter CaMV35S, promoter hoạt động mạnh genome thực vật Đánh giá hiệu suất chuyển gen kiểm tra có mặt tạm thời gen chuyển Thu đợc cà chua cã gen Defensin Néi dung 4: Nghiªn cøu chun gen Chitinase vào cà chua giống P 375 Và Pháp lùn Xây dựng quy trình chuyển gen Chitinase vào cà chua thông qua vi khuẩn vector sau: - Chñng vi khuÈn Agrobacterium tumefaciens EHA105 cã chøa plasmid pCAMBIA 1300 CHI-GLU, mang gen kháng nấm: Chitinase gen kháng Hygomicine (hpt) Gen hpt cã promoter 35S, cßn gen Chitinase có promoter A9, promoter hoạt động mạnh genome thực vật, Đánh giá hiệu suất chuyển gen kiểm tra có mặt tạm thời gen chuyển Thu đợc cà chua có gen Chitinase 2.3 Các phơng pháp nghiên cứu - Phơng pháp DAS-ELISA (Double Antibody SADNwich-Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) (Clark Adams 1977) kỹ thuật miễn dịch liên kết Enzyme dạng cặp chả đợc sử dụng rộng rãi để phát tác nhân gây bệnh thực vật Phơng pháp DAS-ELISA: gồm bớc thực hiƯn (phơ lơc I) 2.3.1 Chn bÞ mÉu cho phÐp thử ELISA - Hạt thu thập từ nguồn khác Mỗi nguồn thu thập đợc phân lô/giống (12 000 hạt/lô), mẫu lấy 4000 hạt nghiền dung dịch đệm P.B.S.-T + P.V.P - Kháng thể đặc hiệu kháng thể có gắn enzyme đợc pha loãng dung dÞch P.B.S.-T + 2% P.V.P theo tû lƯ cho sẵn hãng - Chất màu: hoà viên /5 ml dung dịch đệm Substrat vii 2.3.2 Phơng pháp nuôi cấy mô Dựa vào tài liệu tham khảo Murashige ADN Skoog (MS-1962) tài liệu tham khảo Peres L cs 2002, Sung H Park (2003), Moghaieb R vµ cs (2004) vµ N Gorinnova vµ cs (2005) 2.3.2.1 Khử trùng mẫu - Hạt cà chua cho vào ống đong 30 ml cồn ethanol 70% để khử trùng bề mặt phút Sau hạt đợc xử lý với dung dịch Hypoclorit calcium 10% cho thêm giọt Tween 20 với thời gian khác nhau: 10, 15 20 phút, mẫu đợc rửa lại lần với nớc cất lần vòng 30 phút hạt đợc gieo lên môi trờng gieo hạt pH 5,7, chúng đợc đặt điều kiện t0 = 250C 2, ánh sáng tự nhiên 2.3.2.2 Nghiên cứu khả tạo mô sẹo (callus) Mỗi thí nghiệm dùng 150 chồi (50 chồix3 lần nhắc lại) Sau hạt cà chua đợc gieo đĩa petri, chúng nẩy mầm đợc 10-12 ngày mầm, thật trụ mầm đợc cắt nhỏ đa vào nuôi cấy môi trờng tạo mô sẹo Các mẫu cấy đợc đặt điêu kiện t0 = 25 20C, để từ 7-10 ngày tối, sau đa ánh sáng tự nhiên Kết đợc ghi lại sau tuần nuôi cấy 2.3.2.3 Nghiên cứu khả tạo chồi, nhân chồi tạo hoàn chỉnh Các mẫu tạo callus đợc tách cấy chuyển sang môi trờng tạo chồi sau 4-5 tuần chồi đợc tách chuyển sang môi trờng nhân chồi, sau chúng đợc chuyển sang môi trờng tạo hoàn chỉnh 2.3.2.4 Phơng pháp thống kê: Chúng theo dõi hệ số nhân chồi trung bình/ mẫu phận trụ mầm, thật mầm giống độ lệch chuẩn trung bình lần nhắc lại đợc tính toán theo chơng trình IRRISTAT 4.0 2.3.3 Phơng pháp thí nghiệm chuyển gen Chuyn gen gián tip qua Agrobacterium tumefaciens (dựa theo quy trình cđa Swapan K Datta vµ cs 1997, cđa Sung H Park 2003 Pravda S vµ cs (2005) vµ N Gorinova (2005) Kiểm tra có mặt tạm thời gen chuyển Sử dụng kỹ thuật PCR với mồi đặc trng Các mồi đặc trng (chuyển gen Glucanase) Các mồi ®Ỉc tr−ng (chun gen Defensin) HPT5 5’-CTGCCTGAAACCGAACTGC-3’ NPT5': HPT3 5’-CTTCTGCGGGCGATTTGTG- 3’ 5’CCGCCGATGACGCGGGACAAGCC-3’ viii NPT3': 5’GGTCCGCCACACCCAGCCGGCCA-3’ GL.F: 5’-GGGGCTCAATCGATAGGTGGT-3’ Def.F: 5’-AGTCGAGTGAGATGAATAAA-3’ GL.R: 5-GCCGACAGTGGTCCCAAAGAT-3 Def.R: 5-CTCTTTATTCATCTCACTCGACT-3; AP.F: 5- ATGGGCAACTTGAGATCTTCT-3 Các mồi đặc trng (chuyển gen Chitinase) AP.R: 5-GCCGACAGTGGTCCCAAAGAT-3 CHI.F: 5-ATGGGGAAGAATAGGATGATG-3 CHI.R: 5-GCCGACAGTGGTCCCAAAGAT-3 CHƯƠNG KÕt qu¶ NGHI£N CøU vμ th¶o luËn 3.1 Mét số kết nghiên cứu quy trình tái sinh cà chua phục vụ cho công tác chuyển gen 3.1.1 ứng dụng kỹ thuật DAS-ELISA để kiểm tra tình hình nhiễm bệnh virus cà chua trớc đa vào nuôi cấy In vitro Mẫu hạt đợc thu thập từ nguồn khác nhau: Sản xuất từ trạm giống cung cấp cho ngời trồng rau Tây Tựu, chợ bởi, kiểm tra tình trạng sức khoẻ trớc đa vào nuôi cấy Hạt đợc thu thập từ tập đoàn cà chua Viện Di truyền Nông nghiệp đợc kiểm soát khâu sản xuất thu hái, song qua kiểm tra ELISA Kết cho thấy hạt cà chua thị trờng tự có mặt virút ToMV TMV, nh hai bệnh có mặt trình sản xuất cà chua Có thể việc loại bỏ bị nhiễm bệnh đợc nghi nhiễm bệnh trình sản xuất cha thật triệt để, nên trình thu hoạch để lấy hạt có sơ xuất nên thu bị bệnh Còn hạt cà chua đợc thu từ tập đoàn cà chua Viện Di truyền Nông nghiệp, dòng cà chua dại L.pennelli đợc cung cấp từ AVRDC (Đài loan) đợc kiểm soát chặt chẽ trình sản xuất thu hái, không thấy có mặt bệnh virút này, rủi ro việc thu có mang mầm bệnh đợc loại trừ Qua kết nghiên cứu cho thấy độ xác độ nhậy phép thử DASELISA thật đáng tin cậy Các mẫu bệnh đợc sử dụng để đa vào thí nghiệm biến nạp gen 3.1.2 Một số kết Nghiên cứu quy trình tái sinh cà chua phục vụ cho công tác chuyển gen xvi khuẩn trình biến nạp Cũng nh quan sát ảnh hởng loại kháng sinh sử dụng lên hiệu biến nạp Các mẫu đợc dùng chuyển gen mầm (LM) trụ mầm (TLM) 3.2.1 Quá trình biến nạp gen kháng nÊm Glucanase (Dùa theo quy tr×nh cđa Swapan K Datta vµ cs 1997, cđa Sung Park vµ cs, 2003 vµ N Gorinova (2005) Các mẫu trụ mầm mầm sau kết thúc tiền nuôi cấy, chúng đợc gây vết thơng tạo điều kiện cho tiếp xúc vi khuẩn đặt mẫu cấy vào dung dịch vi khuẩn môi trờng MS1 lỏng ®Üa petri víi nång ®é kh¸c (1:10; 1:15 1:20), lắc nhẹ khoảng 5-7 phút để làm tăng khả tiếp xúc tế bào chủ vi khuẩn Sau mẫu đợc làm khô giấy thấm whatman (quá trình nhằm loại bỏ bớt vi khuẩn bám nhiều bề mặt mẫu, øc chÕ sù t¸i sinh cđa mÉu) råi chun chóng sang môi trờng có chứa 250 mg/l Acetosiringone để đồng nuôi cấy Quá trình đồng nuôi cấy trì nhiƯt ®é 25 oC +1, tèi víi thêi gian khác nhau: 36 tiếng 48 tiếng 60 tiếng Các mẫu đối chứng đợc tiến hành đồng thời bớc loại trừ công đoạn lây nhiễm nuôi chung với vi khuẩn Bên cạnh mẫu biến nạp tiến hành thí nghiệm đối chứng với mẫu không biến nạp môi trờng tạo callus tạo chồi 3.2.2 Nghiên cu kh nng tái sinh ca mẫu cấy môi trờng có chứa kháng sinh a Tạo mô sẹo tái sinh chồi Sau nuôi chung, mẫu biến nạp đợc chuyển sang môi trờng chọn lọc MS1 có bổ sung đồng thời loại kháng sinh: Cefotaxime (250 mg/l) Hygromicin (50 mg/l) Sau ba tuần đợc nuôi cấy tối, callus có khả sống sót môi trờng chọn lọc đợc tiếp tục chọn lọc vòng môi trờng chọn lọc MS1 với kháng sinh tơng ứng, với thời gian chiếu sáng 15/24 nhiệt độ nuôi 250C 20C b ảnh hởng kháng sinh lên khả tái sinh Các thí nghiệm biÕn n¹p víi gen Glucanase-Osmotin sư dơng chđng vi khn EHA105 cã chøa plasmid pCAMBIA 1300 GLU-AP, mang gen kháng nấm Glucanase-Osmotin gen đánh dấu chọn lọc kháng Hygomicyne (hpt) Gen hpt cã promoter 35S, cßn gen Glucanase-Osmotin có promoter A9, sau 3-4 tuần nuôi cấy môi tr−êng t¸i sinh chåi tÝnh kh¸ng víi kh¸ng sinh Hygromycin đợc bắt đầu biểu Chúng tiến hành kiểm tra đánh giá mẫu biến nạp quan sát thấy: xvii Những kết thí nghiệm cho thấy giảm đáng kể khả tái sinh chồi giống sau đợc biến nạp nuôi cấy môi trờng chọn lọc có chứa kháng sinh Vi khuẩn Agrobacterium d thừa tồn đọng môi trờng nuôi cấy có chứa gen gây độc vir ức chế sinh trởng phát triển tế bào, chí làm chết tế bào c ảnh hởng nồng độ vi khuẩn thời gian đồng nuôi cấy lên khả tái sinh Trong trình biến nạp gen Glucanase vào giống cà chua Balan, H18 dòng L Pennelli nồng độ vi khuẩn dạng huyền phù đợc hoà loãng với tỷ lệ khác nhau, tơng ứng 1:10; 1:15; 1:20 Theo dõi thí nghiệm cho thấy sử dụng nồng độ tế bào vi khuẩn 1:15 (tơng đơng nồng độ vi khuẩn đo b−íc sãng 600 nm víi OD = 0,3) cho thÊy nồng độ vi khuẩn thích hợp cho hiệu biến nạp cao (bảng 3) Quan sát chồi tái sinh môi trờng có chứa kháng sinh Hygromycin cho thấy: - Đối với giống Balan: Nhiều callus khả tái sinh chết Tỷ lệ tái sinh chồi sau biến nạp không cao (bảng 3) Các chồi sống sót phát triển khoẻ, đẹp có mầu xanh - Đối với giống H18: Callus khoẻ, nhng chết nhiều Giống cho tỷ lệ tái sinh chồi sau biến nạp không cao (bảng 15), chồi không khoẻ đẹp, bị cháy đầu - Dòng L.pennelli sau biến nạp tỷ lệ tái sinh đạt thấp (bảng 3) callus bị bạch tạng, không hình thành chồi hoàn chỉnh 3.2.3 Đánh giá hiệu biến nạp Sau 3-4 lần cấy chuyển sống sót môi trờng có chứa kháng sinh đợc thống kê để đánh giá hiệu biến nạp Kết đánh giá hiệu biến nạp đợc trình bầy bảng 3.3 Bảng 3.3 Hiệu biến nạp gen với nồng độ vi khuẩn thời gian xử lý khác c chua Balan, H18 dòng L Pennelli Dòng/ CT Giống (Nång (MÉu ®é chun) VK) Gièng Balan Sè mÉu thÝ nghiƯm Sè mÉu t¸i sinh sau Tỉng Tû lƯ Tỉng Hiệu đồng nuôi cấy (chồi) tái chồi suất 36 48 60 t¸i sinh t¸i sinh chun tiếng tiếng tiếng sinh (%) sống sót (%) xviii Trụ mầm Lá mầm 1: 10 1: 15 1: 20 1: 10 1: 15 1: 20 Tổng Giống H18 Trụ 1: 10 mầm 1: 15 1: 20 Lá mầm 1: 10 1: 15 1: 20 Tổng Dòng L pennelli Trụ mầm Lá mÇm Tỉng 1: 10 1: 15 1: 20 1: 10 1: 15 1: 20 228 264 288 282 291 276 1638 1 11 27 2 10 16 44 267 291 279 282 276 285 1635 1 2 2 10 24 1 279 291 285 294 282 285 1522 2 17 0 1 0,88 3,79 2,08 1,77 5,50 2,17 12 26 0,44 2,27 0,34 1,04 4,12 1,09 5 12 41 0,75 3,09 1,79 1,77 4,35 2,10 11 25 0,0 1,72 1,08 1,42 3,98 2,10 28 0,36 2,06 1,05 0,68 2,84 Các callus sau cấy chuyển nhiều lần bị nhạt dần chồi khả phát triển thành hoàn chỉnh Qua số liệu bảng 3.3 cho thấy kết chuyển gen vào giống cà chua Balan, H18 dòng dại L Pennelli hiệu suất chuyển phụ thuộc vào phản ứng giống nồng độ chủng vi khuẩn nh loại kháng sinh sử dụng Tuy nhiên chúng có chung quy luật hiệu biến nạp đạt cao nhất: (1) mẫu mầm sau đến mẫu trụ mầm, (2) với nồng độ vi khuẩn 1:15 (tơng đơng OD 600nm = 0,3), (3) Với thời gian đồng nuôi cấy 48 tiếng Giống Balan cho hiệu biến nạp cao tơng ứng: mầm đạt 4,12% trụ mầm đạt 2,27% Các chồi phát triển khoẻ môi trờng chọn lọc Đặc biệt mẫu callus dòng L Pennelli cho thấy phản ứng kiểu gen dòng L Pennelli mạnh với kháng sinh sử dụng (Cefotaxime Hygromycin) nh− chñng vi khuÈn EHA 105 chøa plasmid pCAMBIA 1300 hiệu biến nạp L Pennelli đợc coi không 11 cà chua chuyển gen đợc nuôi cấy môi trờng chọn lọc phân xix lập sau chuyển môi trờng tạo hoàn chỉnh (MS 91962) + mg/l K + 1mg/l IAA) chøa 50 mg/l Hygromycin 250 mg/l Cefotaxime đợc đánh sè thø tù tõ (CGH181- CGH184) vµ (CGBL5- CGBL11) 3.2.4 Kiểm tra có mặt tạm thời gen chuyển 11 cà chua chuyển gen đợc nuôi cấy môi trờng chọn lọc sau bị nhiễm lại 10 (CGgH182- CGgH184) (CGgBL5CGgBL11).Trong thí nghiệm sử dụng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) với cặp mồi đặc hiệu Kỹ thuật PCR kỹ thuật phân tích di truyền đại đợc sử dụng rộng rãi di truyền phân tử mang lại hiệu cao Kim tra s có mặt tạm thời ca gen hpt Trước kiểm tra gen kh¸ng nÊm, chóng thc hin kim tra có mặt tạm thời gen hpt, sử dụng phơng pháp PCR để kiểm tra có mặt tạm thời gen kh¸ng kh¸ng sinh hpt, sư dơng Marker chn kb Cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn gen hpt đợc sử dụng là: HPT5: 5-CTGCCTGAAACCGAACTGC-3 HPT3: 5-CTTCTGCGGGCGATTTGTG- Mẫu: (+): Đ/C dơng (-): Đ/C (-) 2-4: mẫu ADN tách chiết từ CGgH182- CGgH184 5-11: mẫu ADN t¸ch chiÕt tõ (CGgBL5- CGgBL11) M: Marker (1 Kb) Hình 3.1: Kết kiểm tra có mặt gen hpt cà chua kỹ thuật PCR 3.3 Kết chuyển gen defensin vào cà chua Mục đích thí nghiệm tạo cà chua mang gen Defensin nhằm kháng đợc số bệnh nấm hại cà chua Chúng nghiên cứu chuyển gen vào giống cà chua H18 dòng hoang dại L.pennelli dòng khả tạo chồi hoàn chỉnh đợc chuyển gen Glucanase Những mẫu đợc sử dụng thí nghiệm mầm trụ mầm 3.3.1 Quá trình bin np gen Defensin (Dùa theo quy tr×nh cđa cđa Sung Park cs, 2003 N Gorinova (2005) xx Quá tr×nh chuyển nạp gen Defensin vào tế bào cà chua thực trªn sở vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens c nhim vo t bo b thng ang phân chia mnh, cần thiết phải qua giai đoạn tiền nuôi cấy, sau tiền nuôi cấy mẫu mầm trụ mầm lại đợc tạo thêm vết thơng làm tăng khả tiếp xúc vi khuẩn 3.3.2 Các kết nghiên cu kh nng tái sinh ca mẫu cấy môi trờng có chứa kháng sinh a Tạo mô sẹo tái sinh chồi Đợc thực nh chuyển gen với Glucanase khác điều chuyển gen Defensin, kháng sinh chọn lọc đợc sử dụng Kanamicin b ảnh hởng kháng sinh lên khả tái sinh Các thí nghiệm biến n¹p víi gen Defensin sư dơng chđng vi khn Agrobacterium tumefaciens LBA4404, cã chøa vector pBI121 mang gen kh¸ng nÊm: Defensin gen kháng Kanamycin (nptII) Gen nptII có promoter Nos, cßn gen Defensin cã promoter 35S Trong thÝ nghiƯm này, sau 3-4 tuần nuôi cấy môi trờng tái sinh chồi tính kháng với kháng sinh Kanamycin đợc bắt đầu biểu Giống nh trờng hợp chuyển GlucanaseOsmotin, mô phát triển không đồng tuỳ thuộc vào giống cà chua mẫu cấy: - Đối với dòng L pennelli, phần lớn mô bị bạch tạng có khả phát triển nhng trông chúng nh bị trơ hoá Một phần nhỏ có khả tái sinh chồi không hoàn chỉnh - Đối với giống H18, quan sát thấy loại mô: loại có số lợng hơn, có cấu trúc sinh phôi đa chồi, số chúng xuất chồi xanh phát triển bình thờng, loại bị hoá nâu không phát triển chết Ngoài ảnh hởng kháng sinh chọn lọc kháng sinh diệt vi khuẩn Agrobacterium d thừa tồn đọng môi trờng nuôi cấy có chứa gen gây độc vir ức chế sinh trởng phát triển tế bào, chí làm chết tế bào c ảnh hởng nồng độ vi khuẩn thời gian đồng nuôi cấy lên khả tái sinh chồi Quan sát thí nghiệm nồng độ vi khuẩn 1:15 cho thấy nồng độ vi khuẩn thích hợp tơng đơng nồng độ vi khuẩn đo ë b−íc sãng 600 nm víi OD = 0,3 xxi ®· cho tû lƯ t¸i sinh cao nhÊt Quan s¸t chồi tái sinh môi trờng có chứa kháng sinh Kanamycin thu đợc sau chuyển gen, cho thấy: đồng nuôi cấy 48 tiếng cho tỷ lệ tái sinh cao Dòng L pennelli đạt tỷ lệ tái sinh thấp (bảng 3.4) - Giống H18 Giống cho tỷ lệ tái sinh sau chuyển gen tơng đối cao 3.3.3 Đánh giá hiệu biến nạp Bảng 3.4 Hiệu biến nạp gen với nồng độ vi khuẩn thời gian xử lý khác c chua H18 dòng L pennelli Dòng/ CT Giống (Nồng (Mẫu độ chuyển) VK) Giống H18 Trụ 1: 10 mầm 1: 15 1: 20 Lá mầm 1: 10 1: 15 1: 20 Tỉng Dßng L pennelli Trơ mầm Lá mầm Tổng 1: 10 1: 15 1: 20 1: 10 1: 15 1: 20 Sè mÉu thÝ Số mẫu tái sinh sau Tổng đồng nuôi cấy (chồi) Tû lƯ t¸i 36 48 60 t¸i tiếng tiếng tiếng sinh 269 271 277 280 272 275 2 2 3 24 2 13 0,74 2,95 18,0 2,14 4,78 2,54 275 281 280 279 280 283 2 1 15 1 28 0,73 2,49 0,71 1,07 3,21 1,41 nghiÖm sinh Tỉng HiƯu chåi st t¸i sinh chun sèng sãt (%) 4 12 0,37 2.21 1,44 1,43 4,41 1,82 C¸c callus sau cÊy chun nhiỊu lần bị nhạt dần chồi khả phát triển thành hoàn chỉnh Qua số liệu cho thấy kết chuyển gen vào giống cà chua H18 dòng dại L pennelli có khác rõ rệt Hiệu suất chuyển ca giống H18 đạt cao Còn dòng L.pennelli hiệu biến nạp không 10 cà chua chuyển gen đợc nuôi cấy môi trờng chọn lọc phân lập sau chuyển môi trờng tạo hoàn chỉnh đợc đánh số thứ tự từ (CGdH181- CđH1810), sau CGdH181- CGdH183 bị nhiễm lại CGdH184- CđH1810 3.3.4 Kiểm tra có mặt tạm thời gen chuyển Trong thí nghiệm sử dơng kü tht PCR (Polymerase Chain xxii Reaction) víi c¸c cặp mồi đặc hiệu Kiểm tra gen s có mặt t¹m thêi gen nptII Sư dơng chn Kb để so sánh Cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn gen nptII đợc sử dụng là: NPT5 CCGCCGATGACGCGGGACAAGCC NPT3’ –GGTCCGCCACACCCAGCCGGCCA 10 1 §èi chøng (+) Marker (1Kb) Đối chứng (-) 4-10 Cây CGdH184CGdH1810 0,9bp Hình 3.2 Các kết kiểm tra có mặt gen nptII cà chua (H18) đợc chuyển gen Kết điện di (hình III.4) cho thấy cà chua đợc chuyển gen, có biểu có mặt gen mong đợi nptII đợc khuyếch đại tơng ứng 0,9 kb Không có bng ny trường hợp mÉu đối chứng (-) Kiểm tra có mặt tạm thời gen Defensin Sử dụng chuẩn Kb để so sánh, vi cp mi c trưng gen Defensin lµ: Def F: 5’-AGTCGAGTGAGATGAATAAA-3’ Def R1: 5′-CTCTTTATTCATCTCACTCGACT-3′; Kết điện di cho thấy c©y c chua thu c môi trng tạo hoàn chỉnh có chứa kháng sinh Kanamycin có biểu cã mặt gen Defensin gen chuyển khuyếch đại tương ứng 480 bp (h×nh 3.2) 10 1 Marker (1Kb) Đối chứng (-) Đối chứng (+) 4-10 Cây CGdH184CđH1810 480 bp xxiii Hình 3.3 Các kết kiểm tra b»ng kü tht PCR sù cã mỈt cđa gen Defensin cà chua đợc chuyển gen Điều cho thấy trờng hợp này, gen hpt đợc chuyển vào chủ, đồng nghĩa với việc gen kháng Defensin đợc chuyển Trờng hợp việc chuyển gen xẩy hoàn toàn, cố trình chuyển Chúng thu đợc cà chua có mặt gen chuyển Defensin bị chết 3.4 Kết chuyển gen Chitinase vào cà chua P375 pháp lùn Quá trình biến nạp gen Chitinase (Dùa theo quy tr×nh cđa Swapan K Datta vµ cs 1997, cđa Sung Park vµ cs, 2003 N Gorinova (2005) 3.4.1 Các kết nghiên cứu khả t¸i sinh c¸c gièng sau biến nạp gen Chitinase a ảnh hởng kháng sinh lên khả tái sinh P375 Pháp lùn Sau biến nạp, mẫu chuyển sang m«i trường chọn lọc (môi trờng tạo MS1 có b sung ng thời loại kh¸ng sinh 250 mg/l Cefotaxime 50 mg/l Hygromycin) Sau mẫu đợc chọn lọc đợc chuyển sang nuôi cấy môi trờng tái sinh chåi cã bổ sung đồng thời loại kh¸ng sinh Cefotaxime v Hygromycin Kết cho thấy giống nh trình chuyển gen trớc, có loại mô phát triển: (1) có nhng mô sẹo có cấu trúc chắc, mầu trắng xanh hay trắng vàng, mô mịn, sau nhiều lần cấy chuyển phát sinh chồi, (2) loại mô thứ quan sát thấy chúng kh nng phát trin, hu nh b đình tr giống nh c¸c mÉu ë gièng Balan hay H18 chun gen Glucanase Defensin, T kt qu thí nghim thu đợc hai giống cà chua P375 Pháp lùn lại lần khẳng định loại kháng sinh (kháng sinh diệt vi khuẩn kháng sinh chọn läc) cã ảnh hưởng ức chế sù sinh tr−ëng ph¸t triển làm giảm khả ph¸t sinh c quan ca t bo v mô, dẫn đến làm giảm khả tái sinh sau biến nạp giống (bảng 3.5) b Nghiên cu nh hng ca nồng độ vi khuÈn thời gian đồng nu«i cấy lên khả tái sinh Các kết tỷ lệ tái sinh giống P375 Pháp lùn đợc trình bầy bảng 3.5 Sự ảnh hởng nồng độ vi khuẩn lên khả tái sinh chåi rÊt râ rƯt: víi c«ng thøc cã nồng độ 1:15 (tương đương nồng độ vi khuẩn đo bước sóng 600 xxiv nm, OD=0,3) vi thi gian đồng nuôi cÊy 48 cho tû lƯ t¸i sinh cao nhất: giống P375 đạt 4,32% (lá mầm) 2,63% (trụ mầm), Quan sát mô môi truờng tái sinh có chứa kháng sinh nồng độ vi khuẩn 1:15, đồng nuôi cấy 48 tiếng cho thấy: Đối với giống P375: Sau đợc cấy chuyển nhiều lần callus sống sót phát triển khoẻ, đẹp, sinh đa phôi phát sinh chồi Tuy nhiên có nhiều callus khả tái sinh, mô không phát triển teo lại thâm đen chết Đối với giống Pháp lùn: Giống cho tỷ lệ tái sinh chồi sau biến nạp thấp so với giống P375 chúng nhậy cảm với yếu tố môi trờng trải qua (chủng vi khuẩn AHE 105 kháng sinh Hygromycin Cefotaxime) 3.4.2 Hiệu biến nạp Chitinase vào c chua P375 Pháp lùn Các kết hiệu biến nạp giống P375 Pháp lùn đợc trình bầy bảng 3.5 Bảng 3.5 Hiệu biến nạp gen với nồng độ vi khuẩn thời gian đồng nuôi cấy khác c chua P375 Pháp lùn Giống (Mẫu chuyển) CT (Nồng độ VK) Giống P375 Trụ 1: 10 mầm 1: 15 1: 20 Lá mầm 1: 10 1: 15 1: 20 Tỉng Gièng Ph¸p lïn Trơ l¸ 1: 10 mầm 1: 15 1: 20 Lá mầm 1: 10 1: 15 1: 20 Tỉng Sè mÉu thÝ nghiƯm Sè chồi tái sinh sau sau đồng nuôi cấy 36 48 60 tiếng tiếng tiếng Tỉng (chåi) mÉu t¸i sinh Tû lƯ t¸i sinh Tỉng chåi t¸i sinh sèng sãt HiƯu suÊt chuyÓn (%) 13 2,63 1,20 1,00 4,32 2,24 300 266 333 300 301 265 1 2 22 1 13 0,67 2,63 1,20 1,00 4,32 2,24 279 276 282 279 285 288 1 3 20 1 5 10 0,36 2,17 1,77 1,79 3,51 1,74 4 0,36 2,17 1,42 1,43 2,81 1,74 Tõ kÕt hiệu biến nạp gen cho thấy, Giống P375 (2,63 (TLM) 4,32 (LM) cho hiệu biến nạp cao giống Pháp lùn 2,17 (TLM) 3,51 (LM) Mẫu cấy mầm cho tỷ lệ biến nạp cao mẫu cấy trụ mầm Nng xxv vi khuẩn độ hoà loãng 1:15 (tng đương nồng độ vi khuẩn đo bước sãng 600 nm, OD=0,3) với thi gian đồng nuôi cấy 48 cho hiệu biến nạp cao nhÊt ThÝ nghiệm thu 21 hồn chỉnh, ®ã cã 16 thuộc giống P375 thuộc giống Pháp lùn, Nhng trỡnh cy chuyn bị chết (toàn giống Pháp lùn c©y cđa gièng P375) lại 12 hồn chỉnh, khoẻ mạnh kiểm tra có mặt ca gen chuyn Chitinase Các đợc đánh số thứ tù CGcP375 1- CGcP375 12 3.4.3 Kiểm tra cã mt tạm thời ca gen chuyn Trong thí nghiệm chóng t«i sư dơng kü tht PCR Sư dơng chuÈn Kb với cặp mồi đặc trưng gen Chitinase lµ: CHI.F 5’ATGGGGAAGAATAGGATGATG-3’ CHIR.5’GCCGACAGTGGTCCCAAAGAT-3’ Kết điện di cho thy 12 c chua thu c môi trường chọn lọc cã c©y biểu cã mặt gen Chitinase, gen chuyển khuyếch đại tương ứng 788 bp (h×nh 3.4) M 10 11 12 (-) 788 bp H×nh 3.4 Kết kiểm tra cã mặt gen chitinase c biến nạp gen Kết luận v đề nghị xxvi Kết luận Khả tạo callus tái sinh phụ thuộc vào môi trờng nuôi cấy, mô nuôi kiểu gen cà chua Dòng dại L pennelli có khả tạo callus tái sinh cao Giống H18 có tỷ lệ tạo chồi thấp Mô nuôi sử dụng trụ mầm cho hiệu cao Sử dụng môi trờng MS để nuôi cấy in vitro với cà chua, thí nghiệm rút môi trờng hợp lý cho tạo callus, tạo chồi, nhân chồi tạo hoàn chỉnh cụ thể nh sau: - Môi trờng tạo Callus: MS (1962) + mg/l BA + 0.1 mg/l NAA) + 25g/l Sucrose + 7g/l agar; pH 5,7 - Môi trờng tạo chồi: MS (1962) + mg/l Zeatin + 0,1 mg/l IAA + 25g/l Sucrose + 7g/l agar; pH 5,8 - Môi trờng nhân chåi: MS (1962) + mg/l Zeatin + 0,1 mg/l IAA + 25g/l Sucrose + 7g/l agar; pH 5,8 - Môi trờng tạo hoàn chỉnh: MS (1962) + mg/l Kinetin + mg/l IAA + 25 g/l Sucrose + g/l agar Sư dơng hai chđng vi khn Agrobacterium tumefaciens EHA105 vµ Chđng vi khn Agrobacterium tumefaciens LBA4404 làm vật trung gian để chuyển gen cà chua bớc đầu thể hiệu chuyển nạp tơng đối tốt, sử dụng chúng nghiên cứu chuyển gen cho cà chua sau Các giống cà chua khác cho hiệu chuyển nạp không giống nhau: hai giống P375 H18 có hiệu chuyển nạp cao, sau giống Balan Hai giống lại hiệu chuyển nạp không tốt: giống pháp lùn phản ứng với chủng vi khuẩn EHA105 dòng cà chua dại L pennelli có phản ứng mạnh với hai chủng vi khuẩn EHA105 LBA4404 Với hai giống thí nghiệm cha thu đợc hiệu biến nạp Hiệu biến nạp phụ thuộc vào nồng độ vi khuẩn thời gian đồng nuôi cấy Thí nghiệm rút với giống (dòng) đồng nuôi cấy víi dÞch hun phï vi khn thêi gian 48 tiÕng vµ chØ sè quang häc OD600 nm = 0,3 cho hiệu biến nạp cao Bên cạnh hai kháng sinh chọn lọc Hygromicin Kanamicine có ảnh hởng làm giảm khả tái sinh giống cà chua xxvii Kết thu đợc cà chua tái sinh mang gen chuyển cụ thĨ: c©y cà chua thc gièng Balan cã mang gen chuyển Glucanase; cà chua thuộc giống H18 mang gen chuyển Defensin cà chua thuộc gièng P375 mang gen chun Chitinase Sù cã mỈt cđa gen chuyển đợc kiểm tra PCR Đề nghị Các qui trình chuyển gen kết bớc đầu, đề nghị có nghiên cứu để khẳng định đa vào ứng dụng công nghệ chuyển gen trình tạo giống cà chua Tiếp tục đánh giá khả ứng dụng cà chua mang gen chuyển mà đề tài thu đợc xxviii TRƯờNG ĐạI HọC NÔNG NGHIệP H NộI Bùi Thị Lan Hơng Nghiên cứu chuyển gen kh¸ng bƯnh nÊm vμo mét sè gièng cμ chua thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens Chuyên ngành: Mã số : Di truyền chọn giống trồng 62 62 05 01 tóm tắt LUậN áN TIếN Sĩ NÔNG NGHIệP Ng-ời h-ớng dẫn : PGS TS Lê Thị ánh Hồng PGS.TS Ngun Hång Minh Hμ NéI - 2010 C«ng trình hoàn thành tại: TRƯờNG ĐạI HọC NÔNG NGHIệP H NộI Ng-ời h-ớng dẫn khoa học: PGS.TS Lê Thị ¸nh Hång PGS.TS Ngun Hång Minh Ph¶n biƯn 1: PGS.TS Nguyễn Thị Ngọc Huệ Trung tâm Tài nguyên thực vật Phản biện 2: TS Đặng Trọng L-ơng Viện Di truyền nông nghiệp Phản biện 3: PGS.TS Ngô Bích Hảo Tr-ờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội Luận án đ-ợc bảo vệ hội đồng chấm luận án cấp Tr-ờng họp tại: Tr-ờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội Vào hồi 8h30', ngày 23 tháng 11 năm 2010 Có thể tìm hiểu luận án th- viện: - Th- viện Quốc gia Việt Nam - Th- viện Tr-ờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội CC CễNG TRèNH CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Bïi Thị Lan Hơng, Nguyễn Thị Trờng, Lê Thu Hằng,Nguyễn Đức Doanh,Phan Tố Phợng, Nguyễn Hồng Minh, Lê Thị ánh Hồng (2008), Một số kết nghiên cứu quy trình tái sinh cà chua phục vụ cho công tác chuyển gen, Tạp chí Bảo vệ Thực vật, số 6(222)/2008, trang 3-9 Bùi Thị Lan Hơng, Nguyễn Thị Trờng, Vũ Duy Thanh, Nguyễn Thị Kim Lý, Nguyễn Đức Doanh,Phan Tố Phợng, Nguyễn Hồng Minh, Lê Thị ánh Hồng (2009), Nghiên cứu chuyển gen chitinase-Glucanase kháng nấm vào cà chua thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens, Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt nam, số 1(10)/2009, trang 2-7 Bùi Thị Lan Hơng, Nguyễn Thị Kim Lý, Lê Thị ánh Hồng (2009), ứng dụng kỹ thuật DAS-ELISA để kiểm tra tình hình sức khoẻ hạt cà chua trớc đa vào nuôi cấy In vitro Tạp chÝ B¶o vƯ Thùc vËt, sè 3(225)/2009, trang 33-40 ... sung cho phơng pháp chuyển gen qua Agrobacterium Frary Earle (1996) Chính thực đề tài: Nghiên cứu chuyển gen kháng bệnh nấm vào số giống cà chua thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Mục tiêu... biến nạp gen Nội dung 2: Nghiên cứu chuyển gen kháng nấm Glucanase- Osmotin vào giống cà chua Balan, H18 dòng dại L.pennelli Nội dung 3: Nghiên cứu chuyển gen Defencin kháng nấm vào cà chua H18... đầu chuyển gen kháng nấm Glucanase vào giống (dòng) cà chua Mục đích nghiên cứu thu đợc dòng cà chua mang gen kháng nấm Glucanase-Osmotin cần thiết cho công tác chọn tạo giống cà chua kháng bệnh

Ngày đăng: 08/01/2020, 14:26

Từ khóa liên quan

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan