Đang tải... (xem toàn văn)
Mục tiêu của luận án nhằm sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để định danh các loài từ chi nấm Beauveria và Metarhizium. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, khả năng gây bệnh, các yếu tố ảnh hưởng đến độc tính của các mẫu nấm Beauveria và Metarhizium đã định danh được loài nhằm thiết lập cơ sở dữ liệu sinh học cho các mẫu nấm bản địa, cung cấp thông tin cơ bản cho việc chọn mẫu nấm có độc tính cao đối với sâu hại trong nghiên cứu ứng dụng.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM ****** VÕ THỊ THU OANH NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CỦA CÁC MẪU PHÂN LẬP NẤM Beauveria VÀ Metarhizium KÝ SINH TRÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI Chuyên ngành: Bảo vệ Thực vật Mã số : 62 62 10 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NƠNG NGHIỆP Tp Hồ Chí Minh, năm 2010 Cơng trình đƣợc hồn thành tại: TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS TS Bùi Cách Tuyến TS Lê Đình Đơn Phản biện 1: GS.TS Nguyễn Văn Đĩnh Phản biện 2: GS.TS Phạm Văn Biên Phản biện 3: PGS.TS Phạm Văn Dƣ Luận án đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng chấm luận án cấp nhà nƣớc họp Trƣờng Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Vào hồi giờ, ngày 25 tháng 12 năm 2010 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thƣ viện Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP.HCM Thƣ viện Quốc gia Hà Nội DANH SÁCH CÁC BÀI BÁO CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ĐÃ CƠNG BỐ Võ Thị Thu Oanh, Lê Đình Đơn, Bùi Cách Tuyến (2005) Xác định trình tự vùng ITS-rDNA nấm Beauveria bassiana Vuille ký sinh côn trùng gây hại Tạp chí KHKT Nơng Lâm Nghiệp số 3/2005, Đại Học Nông Lâm TP.HCM, trang 159-165 Vo Thi Thu Oanh, Le Dinh Don, Bui Cach Tuyen (2005) Efficacy of Beauveria bassiana strains plus insecticide for controlling of brown planthoppers (Nilaparvata lugens) attacking on rice plant Journal of Agriculture Science and Technology Special Issue, pp 16 -18 Võ Thị Thu Oanh, Lê Đình Đơn, Bùi Cách Tuyến (2007) Đặc điểm sinh học khả gây bệnh nấm Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin sâu khoang (Spodoptera litura F.) hại rau cải xanh (Brassica juncea L.) Tạp chí KHKT Nơng Lâm Nghiệp số 1&2/2007, Đại Học Nông Lâm TP.HCM, trang 5863 Võ Thị Thu Oanh, Lê Đình Đơn, Bùi Cách Tuyến (2008) Tuyển chọn dòng nấm Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin để phòng trừ sâu keo da láng (Spodoptera exigua H.) hành (Allium fistulosum L.) Hội nghị trùng học tồn Quốc lần 6/2008, Hà Nội, trang 994-999 Võ Thị Thu Oanh, Lê Đình Đơn, Bùi Cách Tuyến (2008) Khả gây bệnh nấm Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin rệp sáp giả (Dysmicoccus spp.) na (Annona squamosa L.) Tạp chí BVTV số 3/2008, trang 24-28 Võ Thị Thu Oanh, Lê Đình Đơn, Bùi Cách Tuyến (2009) So sánh trình tự vùng ITSrDNA nấm Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin gây bệnh côn trùng phân lập số tỉnh thành phía Nam Việt Nam Tạp chí NN&PTNT số 4/2009, trang 21-25 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Nấm B bassiana M anisopliae hai loại nấm ký sinh gây chết cho nhiều loại sâu hại trồng nông lâm nghiệp, nghiên cứu ứng dụng rộng rãi giới Nấm B bassiana gây bệnh 700 lồi trùng, M anisopliae gây bệnh cho 200 lồi trùng khác Hai loại nấm sử dụng phòng trừ nhiều loại sâu hại nhiều quốc gia giới Nhật Bản, Đài Loan, Hàn Quốc, Úc, New Zealand, Braxin, Trung Quốc Ấn Độ (Phạm Thị Thùy, 2004; Nguyễn Thị Lộc cs, 2009) Ở nước ta, Viện Bảo Vệ Thực Vật nghiên cứu sử nấm B bassiana M anisopliae để phòng trừ sâu hại trồng nơng, lâm nghiệp với chế phẩm Boverit, Muskardin Mat (Phạm Thị Thùy, 2004) Chế phẩm Metavina sản xuất từ nấm M anisoplaie trừ loại mối hại công nghiệp, ăn trái cảnh (Tạ Kim Chỉnh, 1995; Trịnh Văn Hạnh cs, 2005) Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long sử dụng chế phẩm Biovip, Ometar trừ sâu hại lúa, rau, màu, ăn trái ứng dụng rộng rãi tỉnh Vĩnh Long, Cần Thơ, Sóc Trăng, Trà Vinh (Nguyễn Thị Lộc cs, 2009) Vì vậy, B bassiana M anisopliae khơng tác nhân kiểm sốt sinh học, mà giải pháp an tồn cho mơi trường thay thuốc trừ sâu hóa học Phân loại định danh nấm ký sinh trùng dựa vào đặc điểm hình thái xem tảng, yếu tố ban đầu để nhận biết loài nấm Beauveria Metarhizium Gần đây, với phát triển kỹ thuật sinh học phân tử, trình tự vùng ITS-rDNA sử dụng để định danh nấm B bassiana M anisopliae, hỗ trợ cho việc định danh loài, sở để hiểu biết mối quan hệ gen gây bệnh q trình hình thành bệnh trùng Ở nước ta, việc sử dụng liệu di truyền để định danh lồi, phân tích khác biệt di truyền mức độ phân tử cá thể quần thể tự nhiên, nghiên cứu đặc điểm sinh học, khả gây bệnh mẫu nấm phát liệu sở không nhiều thông tin di truyền phân tử Từ sở trên, đề tài “Nghiên cứu đặc tính sinh học đánh giá độc tính mẫu phân lập nấm Beauveria Metarhizium ký sinh côn trùng gây hại” thực Mục tiêu nghiên cứu Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để định danh loài từ chi nấm Beauveria Metarhizium Nghiên cứu số đặc điểm sinh học, khả gây bệnh, yếu tố ảnh hưởng đến độc tính mẫu nấm Beauveria Metarhizium định danh loài nhằm thiết lập sở liệu sinh học cho mẫu nấm địa, cung cấp thông tin cho việc chọn mẫu nấm có độc tính cao sâu hại nghiên cứu ứng dụng Ý nghĩa khoa học thực tiễn - Bên cạnh phương pháp phân loại truyền thống, sử dụng trình tự vùng ITS - rDNA để định danh cấp độ loài chi nấm Beauveria Metarhizium hướng tiếp cận mới, góp thêm sở khoa học để phát triển phương pháp định danh nấm ký sinh trùng Việt Nam - Trình tự DNA vùng ITS-rDNA 13 MPL B bassiana 16 MPL M anisopliae đăng ký ngân hàng liệu Genbank cung cấp liệu sở cho nhà khoa học khai thác sử dụng để nghiên cứu cấu trúc quần thể, nguồn gốc phân bố địa lý loài B bassiana M anisopliae - Cung cấp thông tin cần thiết đặc điểm sinh học loài nấm B bassiana M anisopliae nhằm thiết lập liệu sinh học cho mẫu nấm địa, góp thêm sở khoa học để bổ sung thêm vào danh sách mẫu nấm gây bệnh trùng có độc tính cao có nước ta Những đóng góp luận án - Sử dụng trình tự DNA vùng ITS - rDNA để định danh lồi loài nấm Beauveria Metarhizium hướng tiếp cận mới, góp thêm sở khoa học để phát triển phương pháp định danh nấm ký sinh côn trùng mức độ phân tử - Xác định quần thể B bassiana có nhóm di truyền M anisopliae với nhóm khác dựa trình tự DNA vùng ITS-rDNA Xác định quần thể nấm B bassiana, biến động trình tự xảy vùng ITS2-rDNA, vùng ITS1-rDNA nấm M anisopliae - Xác định 10 số 16 MPL M anisopliae có diện gen Pr1, gen liên quan đến tính gây bệnh nấm sâu hại Về phương pháp luận: phương pháp nested-PCR với qui trình thực phù hợp sử dụng để sàng lọc, phát nhanh mẫu nấm M anisopliae có độc tính gây bệnh cao nghiên cứu ứng dụng - Xác định mơi trường SDAY+K thích hợp cho hình thành bào tử B bassiana M anisopliae, có mẫu B bassiana mẫu M anisopliae phát triển tốt nhiệt độ cao 350C, mẫu Bb(RN-LA), Bb(RSM-Q2), Bb(RSM-BC) mẫu Ma(RN-LA), Ma(RS-Q9) có độc tính khơng chọn lọc ký chủ, gây bệnh cho rầy nâu sâu xanh da láng Các MPL B bassiana M anisopliae bị bất hoạt thuốc trừ nấm mancozeb, zineb, carbendazim, benomyl không tác động bất lợi đến thiên địch ruộng lúa Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu * Đối tượng nghiên cứu: MPL Beauveria Metarhizium phân lập từ nhiều ký chủ sâu hại vùng địa lý khác * Phạm vi nghiên cứu: Định danh mẫu nấm dựa vào đặc điểm hình thái, trình tự DNA vùng ITS-rDNA Phân tích trình tự DNA vùng ITS-rDNA nấm B bassiana M anisopliae Khảo sát số đặc điểm sinh học, khả gây bệnh số sâu hại điều kiện in vitro, nhà lưới đồng ruộng Long An Tân Hạnh, Đồng Nai Bố cục luận án Luận án gồm 166 trang gồm chương với 37 bảng số liệu, 47 hình Có 223 tài liệu, có 38 tài liệu tiếng Việt, 182 tài liệu tiếng Anh website sử dụng Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lịch sử nghiên cứu nấm gây bệnh côn trùng: Năm 1709, Balisneri mô tả nấm gây bệnh côn trùng, mở hướng nghiên cứu bệnh lý côn trùng Năm 1815, Agrostino Bassi mô tả bệnh nấm trắng muscardin tằm Năm 1944, Steinhaus thành lập phòng thí nghiệm nghiên cứu bệnh lý, khả ứng dụng phòng trừ sâu hại đồng ruộng (Nguyễn Thị Lộc, 2009; Phạm Thị Thùy, 2004) Metschnikoff (1845-1916) phát phân lập nấm Entomophthora anisopliae sâu non cánh cứng hại lúa mì (Anisopliae austrinia), năm 1883, Sorokin N đặt tên Metarhizium anisopliae Năm 1976, Tulloch đề nghị tên gọi nấm M anisopliae với hai dạng loài M anisopliae var anisopliae Sorokin M anisopliae var major (Johstom) 1.2 Triệu chứng côn trùng bị bệnh vi nấm - Hiện tượng chấn thương: mô bị tổn thương nấm gây ra, lympho máu đọng lại mô tái sinh tạo thành bên bề mặt phần thân côn trùng bị tổn thương - Hiện tượng nhiễm trùng máu: lympho chứa đầy sợi nấm, xảy tượng thực bào tế bào bao vây nuốt phần tiểu thể tạo thành hợp bào tế bào khổng lồ làm cho côn trùng chết (Phạm Thị Thùy, 2004) 1.3 Đặc điểm nhận biết nấm Beauveria Metarhizium Chi Beauveria, tế bào sinh bào tử phát sinh từ sợi dinh dưỡng mọc thành đám, cuống phồng lên phần dưới, kéo dài cong gập cong ziczắc cưa Bào tử đính đơn bào, khơng màu suốt, hình cầu, kích thước 2,6 -2,8 x 2,2-2,4m mọc cuống sinh bào tử hướng gốc (Phạm Thị Thùy, 2004; Luangsa-Ard, 2006) Chi Metarhizium: có lồi gây bệnh phổ biến cho trùng M anisopliae (Sorok) Metch 1883 M flavoviride Gams, 1973 Nấm M anisopliae phát triển bề mặt trùng có màu trắng đến hồng, có vách ngăn, cuống sinh bào tử ngắn mọc đám sợi nấm dày đặc, hình trụ 6-13 x 2-4m Bào tử đính đơn bào, hình trụ, kích thước 6,5-8,9 x 2,2-3,2m, xếp thành chuỗi dài chặt chẽ (Phạm Thị Thùy, 2004, Nguyễn Thị Lộc, 2009) 1.4 Độc tố chế tác động B bassiana M anisopliae: Nấm B bassiana tạo hỗn hợp độc tố gồm beauvericin, bassianolide cosporein Trong đó, độc tố gây hại cho côn trùng beauvericin Beauvericin tạo phức hợp với ion Na+ K+ dẫn đến làm tăng tính thấm màng tế bào tự nhiên nhân tạo Độc tố diệt côn trùng nấm M anisopliae gồm ngoại độc tố destruxin A destruxin B Destruxin gây chán ăn, ngộ độc cho côn trùng sau hấp thụ vào da, làm tê liệt côn trùng số destruxin gây ức chế miễn dịch (Amiri cs, 1999) 1.5 Sự phát triển nấm thể côn trùng: Khi xâm nhiễm vào thể côn trùng, nấm tạo độc tố làm suy yếu phản ứng tự vệ côn trùng Côn trùng chết độc tố nấm tiết Khi côn trùng chết, nấm phát triển ký chủ, gặp điều kiện thích hợp tạo thành lớp bào tử bề mặt thể vật chủ phóng thích 1.6 Đặc điểm di truyền nấm B bassiana M anisopliae Phương pháp PCR, trình tự DNA sử dụng để định danh Beauveria Metarhizium cho kết nhanh xác Trình tự rDNA sử dụng để định danh lồi Beauveria Metarhizium từ trùng nhờ primer chuyên biệt (Leger,1992b; Ricardo cs, 2004) Các vùng ITS1 ITS2 sử dụng để phân biệt loài Nested-PCR khuếch đại phần gen Pr1 M anisopliae xác định mẫu nấm có độc tính cao, số lượng mẫu lớn, rút ngắn thời gian độ xác cao (Lead cs, 1997; Wang cs, 2002) Ở nước ta, sử dụng kỹ thuật phân tử để định danh loài nấm Beauveria Metarhizium dựa trình tự DNA vùng ITS-rDNA 1.7 Đặc điểm sinh học nấm Beauveria Metarhizium *Ảnh hƣởng mơi trƣờng dinh dƣỡng: Sự hình thành bào tử M anisopliae B bassiana tốt môi trường PDA (Kamp Bidochka, 2002) Nhân nấm mơi trường có cho thêm urea, acid-aminoacetic, asparagine, NaNO3 NH4Cl cho độc tính cao Mơi trường lỏng giàu dinh dưỡng (PDB) tạo nhiều bào tử blastospores (Ibrahim cs, 2002) Gia tăng lượng sucrose từ 2%-8% làm giảm sức chống chịu bào tử (Li cs, 1995) Môi trường dùng để nhân sinh khối M anisopliae BH (chứa 3% biomalt, 1% chất chiết thô men) Adámek (3% bột bắp, 4% chất chiết thô men, 4% glucose 0,4% Tween 80 (Rombach cs, 1987) *Ảnh hƣởng nhiệt độ ẩm độ: nhiệt độ thích hợp cho nấm B bassiana M anisopliae phát triển khoảng từ 250-300C, phát triểm 100-150C, ẩm độ thích hợp 80 - 90%, ngưỡng nhiệt độ, ẩm độ bào tử phát triển yếu chết khơng hình thành bào tử (Phạm Thị Thùy, 2004) * Ánh sáng: Trong điều kiện ánh sáng yếu, lượng ánh sáng nhỏ ngày – đủ cho nấm phát triển tốt (Phạm Thị Thùy, 2004) * Độ pH môi trƣờng nuôi cấy: Trong giới hạn pH 6,0 - 7,0 thích hợp cho phát triển tạo bào tử M anisopliae, pH 4,0 -10,0 không ảnh hưởng nhiều tới phát triển tạo bào tử B bassiana (Nguyễn Ngọc Tú, 1997) Bổ sung thêm lượng khoáng chất cần thiết KH2PO4 MgSO4.7 H2O để trì pH mơi trường (Phạm Thị Thùy, 1996) * Ảnh hƣởng truốc hóa học: Các loại thuốc trừ nấm ảnh hưởng đến phát triển hình thành bào tử B bassiana M anisopliae kể nồng độ thấp nhất, fipronil nồng độ 50ppm 100ppm ảnh hưởng bất lợi đến khả sống bào tử, fenitrothion ức chế hoàn toàn nảy mầm bào tử nấm (Moorehouse cs, 1992) 1.8 Một số kết nghiên cứu khả gây bệnh B bassiana M anisopliae sâu hại trồng Nấm B bassiana sử dụng trừ sâu róm thơng Trung Quốc hiệu lực đạt 4393%, trừ rầy nâu Ấn Độ 88,35-91,25%, rầy lưng trắng 86,59-92,44% Hiệu lực trừ dịch sâu róm ăn thơng Thanh Hóa, Sơn La đạt hiệu 70 - 90% dập tắt dịch sau -3 tháng phun Sử dụng nấm B bassiana nồng độ 9x108bt/ml để trừ sâu tơ đạt hiệu cao 81,25% ngày sau phun (Phạm Thị Thùy, 1999; Nguyễn Thị Lộc, 2004) Nấm M anisopliae: trừ bọ cánh cứng hại dừa Ơ Mơn đạt từ 71,6-79,1% 14 ngày sau phun nấm Ở nồng độ 1,5x107bt/ml, hiệu lực rầy mềm hại cam quýt 83,2%, rầy bơng hại xồi 74,3%, rệp sáp hại dứa 71,6-73,7% (Nguyễn Thị Lộc, 2009) Chế phẩm Mat, M anisopliae có hiệu lực trừ bọ dừa đạt 71,03% 10 ngày sau xử lý, 73,34% 14 ngày trì hiệu lực đến 21 ngày sau phun 69,19% (Phạm Thị Thùy, 2000; 2002, 2004; Nguyễn Xuân Niệm, 2009) Chƣơng NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu Các thí nghiệm in vitro, nhà lưới: thực Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM Các thí nghiệm ngồi đồng thực Đức Hòa, Long An Tân Hạnh, Biên Hòa Đồng Nai 2.2 Nội dung nghiên cứu Phân lập xác định loài từ chi nấm Beauveria Metarhizium ký sinh số sâu hại trồng theo phương pháp truyền thống Phân loại phân tích khác biệt di truyền nấm Beauveria Metarhizium dựa vào trình tự vùng ITS-rDNA Nghiên cứu số đặc điểm sinh học nấm B bassiana M anisopliae ký sinh số sâu hại trồng Đánh giá độc tính nấm B bassiana M anisopliae số sâu hại trồng 2.3 Vật liệu nghiên cứu: Các mẫu nấm Beauveria Metarhizium ký sinh sâu hại Môi trường phân lập PDA, môi trường nghiên cứu sinh học SDAY+K, SB+KC, Dulmage Rhodes, Mơi trường L-broth, mơi trường dịch, hóa chất chiết xuất DNA, hóa chất chạy PCR, primer giải trình tự, thuốc trừ sâu, trừ nấm 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1 Phân lập xác định loài từ chi nấm Beauveria Metarhizium theo phƣơng pháp truyền thống - Các mẫu nấm nuôi cấy PDA, tạo phương pháp nuôi cấy đơn bào tử môi trường chọn lọc (Chase cs, 1986) Định danh theo Barnett Barry, 1972; Lawrence, 1994) Ký hiệu mẫu: tên nấm + tên ký chủ + địa điểm thu mẫu (viết tắt chữ đầu) * Đặc điểm khuẩn lạc nấm Beauveria Metarhizium: Nấm nuôi cấy đĩa petri (đường kính 9cm) chứa mơi trường PDA, nhiệt độ 2720C,12 sáng/12 tối Cách mọc sợi nấm, màu sắc khuẩn lạc, phân bố hình thành vòng bào tử quan sát vào lúc 10 ngày sau cấy * Đặc điểm quan sinh bào tử hình dạng bào tử: tách đoạn sợi nấm chuyển lên phiến kính giọt dung dịch lactophenol, quan sát kính hiển vi quang học độ phóng đại 400 lần, mơ tả ghi nhận đặc điểm cấu trúc cành hình dạng bào tử * Kích thƣớc bào tử Beauveria Metarhizium: Thực theo phương pháp Reza cs (2006) Các MPL ni cấy phiến kính phủ lớp môi trường PDA, nhiệt độ 27 20C 10 ngày Số bào tử đo 400 Đường kính trung bình bào tử tính dựa số đo đường chéo vng góc bào tử 2.4.2 Phân loại phân tích khác biệt di truyền nấm Beauveria Metarhizium dựa vào trình tự vùng ITS-rDNA Phƣơng pháp chiết xuất DNA tổng số: theo qui trình Moller cs (1992) có sửa đổi, nấm nuôi cấy môi trường L-broth 27 20C, lắc 120-150 vòng/phút Thu khối sợi nấm sau ngày Kiểm tra có mặt định lượng DNA cách điện di gel agarose 1,5% với DNA chuẩn 100ng Phƣơng pháp khuếch đại vùng ITS-rDNA: Hai primer ITS5 ITS4 sử dụng để khuếch đại vùng ITS-rDNA bao gồm vùng 5.8S Thể tích phản ứng 25l, chu kỳ nhiệt: 940C phút, 35 chu kỳ với 94 0C phút, 550C 1,5 phút, 720C phút 720C phút Phƣơng pháp tinh sản phẩm PCR cho giải trình tự DNA: Sản phẩm PCR tinh với GFX PCR DNA Gel Band Purification Kit Amersham Vùng ITSrDNA giải trình tự sử dụng primer ITS1 ITS4 Phƣơng pháp khuếch đại gen Pr1 nấm Metarhizium: theo phương pháp Lead cs (1997) Sử dụng primer METPR1, METPR4, METPR2 METPR5 để khuếch đại gen Pr1, phương pháp nested-PCR với chu kỳ nhiệt, PCR lần 1: 94oC phút, 37 chu kỳ, 530C phút, 720C phút 720C phút PCR lần 2: 940C phút, 35 chu kỳ 580C phút, 720C phút 720C phút Thể tích phản ứng 25l, sản phẩm PCR kiểm tra điện di gel agarose 1,5% với DNA ladder 100bp Giải trình tự vùng ITS-rDNA: vùng ITS - rDNA giải trình tự hai primer ITS1 ITS4 so sánh với trình tự mẫu B bassiana M anisopliae giới từ sở liệu Genbank Giải trình tự gen Pr1 nấm M anisopliae: gen Pr1 giải trình tự primer MTEPr1, METPr4, METPr4 METPr5 theo qui trình cơng ty Macrogen (Seoul, Hàn Quốc) Phân nhóm xác định loài khác biệt di truyền nấm B bassiana M anisopliae dựa vào trình tự vùng ITS-rDNA: Sơ đồ phân nhóm lồi nấm thuật tốn parsimony, phân tích bootstrap với 1000 lần lặp lại chương trình DNADIST, SEQBOOT CONSENSE phần mềm PHYLIP version 3.66 TREEVIEW 2.4.3 Nghiên cứu số đặc điểm sinh học nấm B bassiana M anisopliae 2.4.3.1 Xác định thời gian bào tử nảy mầm: theo phương pháp Milner cs (1991) Trãi 0,1ml dịch bào tử (106 bào tử/ml Tween 80 0,05%) phiến kính có phủ lớp mơi trường PDA, nhiệt độ 2720C tối Tỷ lệ bào tử nảy mầm (%) đánh giá 24 sau nuôi cấy Quan sát điểm/phiến kính, 25 bào tử/điểm, tổng số bào tử quan sát 400 cho MPL 2.4.3.2 Khả hình thành bào tử nấm B bassiana M anisopliae: thực theo phương pháp Houping cs (2003) Dùng 0,1ml dịch bào tử (106bt/ml) cấy lên môi trường SDAY+K đĩa petri (đường kính 9cm), nhiệt độ 27±20C 10 ngày Số lượng bào tử /ml cm2 thảm nấm đếm buồng đến hồng cầu THOMAS, qui đổi theo hệ số pha lỗng 2.4.3.3 Ảnh hƣởng thời gian ni cấy đến hình thành bào tử B bassiana M anisopliae: Thực phòng thí nghiệm Bệnh cây, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM, theo phương pháp Phạm Thị Thùy cs (1995) Nấm B bassiana M anisopliae nuôi cấy môi trường SB+KC đĩa petri (đường kính cm), nhiệt độ 27±20C Phương pháp tiêu theo dõi (mục 2.4.3.2) Thời gian theo dõi: 5, 7, 14, 21, 28 35 ngày sau nuôi cấy 2.4.3.4 Ảnh hƣởng nguồn dinh dƣỡng đến phát triển nấm B bassiana M anisopliae: theo phương pháp Kamp cs (2002) loại môi trường: SDAY+K, SB+KC Dulmage H.T Rhodes Đặt khoanh nấm đường kính 4mm vào đĩa môi trường, nhiệt độ 2720C, 12 sáng/12 tối ngày sau ni cấy, đo đường kính khuẩn lạc (cm) cách lấy trung bình đường kính trục khuẩn lạc.Tốc độ phát triển trung bình (mm/ngày) lần đo 6-8; 8-10 10-12 ngày sau ni cấy Số lượng bào tử/cm2: tính lần 14 ngày sau nuôi cấy (mục 2.4.3.2) 2.4.3.5 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến phát triển hình thành bào tử nấm B bassiana M anisopliae: Thực theo phương pháp Uma cs (2005) phòng thí nghiệm Bệnh cây, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM Cấy khoanh nấm (4mm) lên bề mặt đĩa petri chứa 20ml môi trường SDAY+K, đặt mức nhiệt độ 20, 25, 28, 30, 350C (đối với B bassiana) 20, 25, 28, 30, 350C, 370C (M anisopliae) tủ định ơn Memmert Đường kính khuẩn lạc (cm), tốc độ phát triển trung bình (mm/ngày), số lượng bào tử /ml (trình bày mục 2.4.3.2); tỷ lệ bào tử nảy mầm (%) (mục 2.4.3.1) * Khả nảy mầm nấm B bassiana M anisopliae mức nhiệt độ cao: Theo phương pháp Uma cs (2005) Các nghiệm gồm: nhiệt độ 250C (đối chứng), nhiệt độ thí nghiệm 300C, 350C 380C Dịch bào tử nấm (106 bt/ml) trải phiến kính khử trùng có phủ lớp mỏng mơi trường SDAY+K Đặt đĩa petri bên có lót giấy thấm làm ẩm, cài đặt mức nhiệt độ thí nghiệm (8 giờ), sau chuyển qua nhiệt độ đối chứng 250C (16 giờ) Tỷ lệ bào tử nảy mầm (%) quan sát thứ 24 (mục 2.3.4.1) 10 liệu tính tốn qui mật số con/m2 Tỷ lệ rầy nâu chết (%) bị nấm ký sinh tính 300 xác rầy chết thu ngẫu nhiên 10 điểm điều tra * Hiệu lực nấm M anisopliae sâu xanh da láng hành lá: Thí nghiệm thực Tân Hạnh, Biên Hòa, Đồng Nai vụ hành từ tháng đến tháng 12 năm 2006 Diện tích ruộng thí nghiệm 0,12 ha, ruộng nơng dân 0,11 Ruộng phun nấm M anisopliae phun lần 15, 33 45 ngày sau trồng, lần thuốc vi sinh success 25EC (spinosad) 25 ngày sau trồng lần thuốc Nimbecidine 0,03EC (azadirachtins) 15ml/8lít nước Ruộng theo tập quán nông dân: Phun 13 lần thuốc trừ sâu Endosol 35EC, Lannat 40SP Padan 95SP, từ ngày sau trồng đến 70 ngày sau trồng, lần cách đến ngày Điều tra 20 điểm cố định (55 bụi hành), theo dõi mật độ sâu hại định kỳ ngày/lần 14 ngày sau trồng đến thu hoạch Tính trung bình mật số sâu /m2, tỷ lệ (%) bụi hành bị hại suất thương phẩm t/ha Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Những kết nghiên cứu nấm Beauveria 3.1.1 Phân lập, định danh nấm B bassiana theo phƣơng pháp phân loại truyền thống Dựa đặc điểm hình thái, phân lập 13 mẫu có đặc điểm lồi B bassiana * Đặc điểm hình thái: sợi nấm mọc nhanh, có màu trắng đến vàng ngà, xốp mịn kết chặt phát triển theo vòng đồng tâm, có dịch tiết bề mặt tản nấm * Đặc điểm hình thái quan sinh bào tử: tế bào sinh bào tử phát sinh từ sợi dinh dưỡng mọc thành đám, cuống phồng lên phần dưới, kéo dài cuống mảnh, cong gập ziczắc cưa Bào tử đính đơn bào, khơng màu suốt, hình cầu, kích thước 2,6 -2,8 x 2,2-2,4m mọc cuống sinh bào tử hướng gốc * Kích thƣớc bào: Tám MPL có kích thước bào tử từ 2,61-2,65 x 2,26-2,31m Hai MPL Bb(RSM-Q2) Bb(RSM-BC) có kích thước lớn 2,81-2,83 x 2,37-2,46m, MPL Bb(RN-BTh), Bb(Cca-BRVT) Bb(SXĐP-TN) có kích thước biến động từ 2,72-2,75 x 2,36-2,41m Như vậy, 13 MPL nghiên cứu thuộc loài B bassiana 3.1.2 Phân loại phân tích khác biệt di truyền nấm B bassiana dựa vào trình tự vùng ITS-rDNA * Phân loại nấm B bassiana dựa vào trình tự vùng ITS-rDNA: Phản ứng PCR thực với hai primer ITS4 ITS5 khuếch đại vùng ITS-rDNA 13 MPL có chiều dài khoảng 580bp Kết giải trình tự vùng ITS1-5.8S-ITS2 MPL xác định có chiều dài từ 480 đến 484bp Trình tự vùng ITS1-5.8S-ITS2 13 MPL nghiên cứu đăng ký trực tiếp GenBank với mã số đăng ký từ EU530653 đến EU530665 * So sánh trình tự vùng ITS-rDNA 13 MPL B bassiana nghiên cứu với mẫu B bassiana giới: Sự tương đồng trình tự 13 MPL nghiên cứu với mẫu 11 Úc, Hàn Quốc, New Zealand Trung Quốc từ 99-100%, tương đồng cao với mẫu Đài Loan, Ấn Độ 97-98% thấp với MPL Đài Loan 83 – 88% Đây mẫu loài B brongniartii Sơ đồ phân nhóm lồi dựa trình tự vùng ITS - rDNA hình 3.6 cho thấy, 13 MPL B bassiana xếp nhóm lồi với mẫu B bassiana giới mẫu Hàn Quốc, Trung Quốc, Ấn Độ, Úc, Đài Loan New Zealand cho thấy 13 MPL nghiên cứu thuộc loài B.bassiana 53 98 88 98 92 94 93 96 94 92 U19042-B.c BCU19042 U35285-B.c BCU35285 U35290-B.a BAU35290 EU530665-B B.b(BH-BVTV)* EU530662.1 B.b(ST-CC)* EU530659.1 B.b(RSM-Q2)* EU530660.1 B.b(SCG-KG)* AY993986-B AY993986 EU530658.1 B.b(RSM-BC)* DQ385614-B DQ385614 AF347611-B AF347611 AF139856-B AF139856 U18950-B.b BBU18590 AF291871-B AF291871 AF291872-B AF291872 AJ309349-B AJ309349 EU530653.1 B.b(BXĐ-BC* EU530656.1 B.b(RN-BTh)* EU530663.1 B.b(SXĐP-TN* EU530657.1 B.b(RN-LA* EU530661.1 B.b(SK-CC)* EU530654.1 B.b(BXĐ-Q9)* EU530664.1 B.b(SXN-PT* EU530655.1 B.b(CCa-BRVT)* U18955-B.b BBU18955 U35283-B.b BBU35283 B cylindrospora B album B bassiana B brongniartii Hình 3.6 Sơ đồ phân nhóm lồi 13 MPL B.bassiana nghiên cứu (có dấu sao) với 13 mẫu B.bassiana giới dựa trình tự vùng ITS - rDNA Phần trăm giá trị bootstrap từ 1000 lần lặp lại nhánh Mẫu BCU19042 (B cylindrospora) sử dụng lồi xa * Phân tích khác biệt di truyền MPL Beauveria bassiana nghiên cứu dựa trình tự vùng ITS – rDNA: trình tự vùng ITS- rDNA 13 MPL B bassiana nghiên cứu có khác biệt khơng đáng kể, biến động xảy hai vùng ITS1 ITS2 phân 13 MPL B bassiana nghiên cứu thành nhóm nhỏ sơ đồ phân nhóm (hình 3.7) 3.1.3 Nghiên cứu số đặc điểm sinh học nấm B bassiana ký sinh sâu hại trồng 3.1.3.1 Xác định thời gian bào tử nảy mầm: Thời gian bào tử B bassiana nảy mầm 90% từ 20-24 sau cấy có khác biệt thời gian nảy mầm theo ký chủ nguồn gốc địa lý vào thời điểm 20 sau cấy MPL B.b(RSM-BC) B.b(RSM-Q2) có tỷ lệ bào tử nảy mầm nhanh sớm 3.1.3.2 Khả hình thành bào tử nấm B bassiana: số lượng bào tử MPL Bb(RN-LA), Bb(SXĐP-TN), Bb(RSM-Q2), Bb(RSM-BC) Bb(SXN-PT) cao từ 10,1x106-14,5x106bt/cm2, MPL Bb(RSM-Q2) Bb(RN-LA) hình thành nhiều bào tử MPL khác nhóm 12 BAU35290 - B album EU530662.1 B.b(BXĐ-BC) EU530653.1 100 B.b(RN-BTh) EU530656.1 I B.b(SXĐP-TN) EU530663.1 100 B.b(SXN-PT) EU530664.1 B.b(BXĐ-Q9) EU530654.1 77 B.b(RN-LA) EU530657.1 II B.b(CCa-BRVT) EU530655.1 B.b(SK-CC) EU530661.1 B.b(BH-BVTV) EU530665-B 67 79 B.b(ST-CC) U35290-B.a 99 100 B.b(RSM-Q2) EU530659.1 III B.b(SCG-KG) EU530660.1 B.b(RSM-BC) EU530658.1 Hình 3.7 Sơ đồ phân nhóm quan hệ di truyền 13 MPL B bassiana nghiên cứu, xây dựng theo phương pháp parsimony dựa trình tự vùng ITS - rDNA Phần trăm giá trị bootstrap từ 1000 lần lặp lại nhánh Mẫu BAU35290 (B album) sử dụng loài xa 3.1.3.3 Ảnh hƣởng thời gian ni cấy đến hình thành bào tử nấm B.bassiana: Số lượng bào tử hình thành cao vào 14 ngày sau nuôi cấy Đây sở quan trọng để chọn thời gian nhân nấm thích hợp đạt hiệu suất cao Số liệu phù hợp với kết nghiên cứu Phạm Thị Thùy (1995), (2004.) 3.1.3.4 Ảnh hƣởng nguồn dinh dƣỡng đến phát triển nấm B bassiana Môi trường SB+KC Tốc độ phát triển (mm/ngày) Môi trường SDAY+K Môi trường DUL B.b(BXĐ- B.b(RN- B.b(BXĐ- B.b(ST- B.b(BH- B.b(RN- B.b(SCG- B.b(SK- B.b(SXĐ B.b(Cca- B.b(SXN- B.b(RSM -B.b(RSM Q9) LA) BC) CCh) BVTV) BTh) KG) CCh) P-TN) BRVT) PT) Q2) BC) Mẫu phân lập Hình 3.11 Tốc độ phát triển trung bình MPL B bassiana mơi trường dinh dưỡng khác (giá trị trung bình ± SD, nhiệt độ 27±20C 12 sáng/12 tối Môi trường SB+KC Môi trường SDAY+K Môi trường DUL Mật số bt (x107/cm2) 3.5 2.5 1.5 0.5 B.b(BXĐQ9) B.b(RNLA) B.b(BXĐBC) B.b(ST CCh) B.b(BHBVT V) B.b(RNBT h) B.b(SCGKG) B.b(SXNPT ) B.b(SKCCh) B.b(SXĐPT N) B.b(CcaBRVT ) B.b(RSMQ2) B.b(RSMBC) Mẫu phân lập Hình 3.12 Khả hình thành bào tử MPL B bassiana môi trường dinh dưỡng khác 14 ngày sau nuôi cấy (Giá trị TB ± SD, nhiệt độ 27±20C 12 sáng/12 tối) 13 Các MPL phát triển tốt mơi trường SB+KC SDAY+K (hình 3.11), nhiên số lượng bào tử SDAY+K nhiều so với SB+KC Dulmage Rhodes (hình 3.12) Như vậy, mơi trường SDAY+K có bổ sung thêm kitin thích hợp cho nấm B bassiana tạo bào tử phát triển sợi nấm tốt môi trường SB+KC 3.1.3.5 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến phát triển hình thành bào tử nấm Beauveria bassiana: Các MPL từ sâu hại lúa phát triển khoảng 20 0C- 280C, khơng hình thành bào tử 300C, ngoại trừ MPL B.b(RN-LA) B.b(BXĐ-Q9) Các MPL từ sâu hại trồng cạn phát triển 300C, tạo nhiều bào tử 25-280C Nhìn chung, nhiệt độ tối ưu MPL nằm khoảng 25 -280C * Khả nảy mầm nấm B bassiana nhiệt độ cao: Có 8/13 MPL B bassiana nảy mầm nhiệt độ 350C/250C 24 Trong số MPL chịu nhiệt độ cao 350C/250C có MPL từ sâu hại lúa MPL từ sâu hại trồng cạn Điều đặc tính chịu nhiệt cá thể 3.1.3.6 Ảnh hƣởng ẩm độ lên hình thành nảy mầm nấm B bassiana: nấm B bassiana khơng hình thành bào tử mức ẩm độ từ 75,5%, 85% 89% Sự hình thành nảy mầm bào tử bắt đầu mức ẩm độ 92% tăng dần đến 100% Ẩm độ thích hợp cho nảy mầm nấm B bassiana khoảng 98% 3.1.3.7 Ảnh hƣởng số thuốc trừ sâu, trừ nấm đến phát triển nảy mầm bào tử nấm B bassiana Thiamethoxam, triazophos, deltamethrin fipronil độc với nấm nồng độ 125ppm Fenitrothion chlorpyrifos ức chế phát triển sợi nấm từ 22-26%, carbaryl ức chế mạnh từ nồng độ thấp 125ppm (66%) Azadirachtins không ảnh hưởng đến phát triển sợi nấm nồng độ thí nghiệm (hình 3.13) 120 120 250ppm 100 100 500ppm % ức chế so với ĐC % ức chế so với ĐC 125ppm 80 60 40 20 50ppm 125ppm 250ppm 80 60 40 20 0 Hình 3.13 Ảnh hưởng thuốc trừ sâu lên phát triển B bassiana thí nghiệm in vitro.1-Thiamethoxam;2-Triazophos;3-Deltamethrin; Hình 3.14 Ảnh hưởng thuốc trừ nấm lên phát triển B bassiana thí nghiệm in vitro.1-Chlorothalonil;2-Validamycin;3-Mancozeb; 4- 4-Fipronil;5-Fenitrothion;6-Chlorpyrifos; 7-Carbaryl; 8-Azadirachtins Zineb; 5-Carbendazim; 6- Benomyl Hình 3.14 cho thấy, chlorothalonil ảnh hưởng đến phát triển nấm nồng độ thử nghiệm, validamycin độc nồng độ 50ppm Mancozeb, zineb ức chế phát triển nấm 100% nồng độ 125 250ppm, carbendazim benomyl ức chế phát triển sợi nấm nồng độ thử nghiệm 14 3.1.4 Đánh giá độc tính nấm Beauveria bassiana số sâu hại trồng 3.1.4.1 Xác định nồng độ trừ sâu xanh da láng (S exigua) nấm B bassiana điều kiện in vitro Tỷ lệ sâu chết thấp nồng độ 104 -105 bt/ml Ở nồng độ 106-107 bt/ml, MPL Bb(SXĐP-TN) Bb(SXN-PT) gây chết cho sâu từ 56,6% - 60,7% 81,7% - 84,2% Ở nồng độ 108 bt/ml, MPL gây chết cho sâu từ 52,2 – 88,6% 10 ngày sau phun nấm Tỷ lệ sâu chết cao sử dụng nồng độ 108bt/ml 3.1.4.2 Xác định nồng độ trừ rầy nâu (N lugens) nấm B bassiana điều kiện nhà lƣới Ở nồng độ bào tử 50 -150 triệu bào tử trở xuống hiệu lực rầy nâu thấp Ở nồng độ 250 triệu bào tử, hiệu lực MPL Bb(BXĐ-Q9), Bb(RN-LA), Bb(BXĐ-BC) Bb(RN-BTh) cao 65,5 – 69,6% tăng cao nồng độ 500 triệu bào tử với hiệu lực 70% Ở nồng độ 700 triệu bào tử, hiệu lực đạt 80%, MPL Bb(RN-LA) thể khả gây bệnh cao 87,8% Kết ghi nhận, MPL từ sâu hại trồng cạn Bb(RSM-Q2) Bb(RSM-BC) có hiệu lực 75,5 – 76,5% 3.1.4.3 Xác định nồng độ trừ sâu xanh da láng (S exigua) nấm B.bassiana điều kiện nhà lƣới Hiệu lực MPL B bassiana sâu xanh da láng hại hành thấp Ở nồng độ 250 triệu bào tử có MPL Bb(SXĐP-TN) có hiệu lực 50% Ở nồng độ 500 triệu bào tử, hiệu lực MPL Bb(RN-LA), Bb(RSM-Q2), Bb(SXĐP-TN) Bb(SXNPT) biến động từ 50,2 - 55,7% tăng nồng độ 700 triệu bào tử từ 53,6 - 78,0% 3.1.4.4 Khả gây bệnh nấm B bassiana số sâu hại trồng điều kiện nhà lƣới ngồi đồng a) Kết thí nghiệm nhà lƣới * Đối với rầy nâu hại lúa 100 Hiệu lực (%) 90 80 Ấu trùng 70 Thành trùng 60 50 40 30 20 10 Bb(BXĐ- Bb(BXĐ- Bb(RNQ9) BC) LA) Bb(SCG- Bb(RN- Bb(RSM- Bb(RSM- Bb(SKKG) BT) Q2) BC) CC) MPL từ sâu rầy hại lúa Bb(STCC) Bb(SXĐ Bb(CCa- Bb(SXN- Bb(BHP-TN) BRVT) PT) BVTV) Biovip MPL từ sâu hại trồng cạn Hình 3.15 Hiệu lực trừ rầy nâu (%) nấm B bassiana (2,5x107bt/ml) thí nghiệm nhà lưới (Đại Học Nông Lâm TP.HCM, năm 2005) Nhiệt độ TB 27,30C, ẩm độ TB 80,5% 15 Hình 3.15 cho thấy, hiệu lực MPL từ sâu, rầy hại lúa cao tỷ lệ ấu trùng rầy nâu chết biến động từ 77,7% đến 88,3%, thành trùng từ 74,2% đến 85,5% Hiệu lực MPL từ sâu hại trồng cạn thấp rầy tỷ lệ rầy chết 50% * Đối với sâu xanh da láng hại hành : Kết hình 3.16 cho thấy, 8/13 MPL B bassiana có hiệu lực thấp với sâu xanh da láng 21,1- 44,8%, MPL Bb(SXĐP-TN) từ sâu xanh da láng hại đậu phọng thể khả gây bệnh cao nhất, tỷ lệ sâu chết 81,2%, MPL Bb(SXN-PT) 78,2% 90 80 Hiệu lực (%) 70 60 50 40 30 20 10 Bb(BXĐ- Bb(BXĐ- Bb(RN- Bb(SCG- Bb(RN- Bb(RSM- Bb(RSM- Bb(SKQ9) BC) LA) KG) BT) Q2) BC) CC) MPL từ sâu, rầy hại lúa Bb(ST- Bb(SXĐP- Bb(Cca- Bb(SXN- Bb(BHCC) TN) BRVT) PT) BVTV) Biovip MPL từ sâu hại trồng cạn Hình 3.16 Hiệu lực trừ sâu xanh da láng (%) nấm B bassiana (2,5x107bt/ml) thí nghiệm nhà lưới (Đại Học Nơng Lâm TP.HCM, năm 2005) Nhiệt độ TB 27,30C, ẩm độ TB 80,5% b) Khả gây bệnh nấm B bassiana kết hợp với thuốc trừ sâu Actara 25WG rầy nâu ngồi đồng ruộng diện tích nhỏ Ở ngày sau phun, nghiệm thức xử lý thuốc hóa học Actara 25WG Actara 25WG kết hợp với nấm có hiệu lực rầy nâu cao cách có ý nghĩa so với nghiệm thức xử lý nấm đơn Ở 17 ngày sau phun, hiệu lực xử lý nấm đơn khơng có khác biệt so với hỗn hợp thuốc hóa học nấm, hiệu lực 70% Năng suất thực thu nghiệm thức khơng có khác biệt mặt thống kê * Ảnh hƣởng nấm B bassiana đến mật số bọ xít mù xanhvà nhện bắt mồi ăn thịt ruộng thí nghiệm: Quan sát ảnh hưởng nấm B bassiana thiên địch rầy nâu bọ xít mù xanh nhện bắt mồi ăn thịt cho thấy mật số không thay đổi nhiều kể từ NSP đến 21 NSP Ngược lại, nghiệm thức phun thuốc Actara 25WG, mật số bọ xít mù xanh nhện giảm từ ngày sau phun đến 21 ngày sau phun, mật số trung bình từ 19,8 giảm uống 11,3con/m2 21 ngày sau phun c) Khả gây bệnh nấm B bassiana rầy nâu đồng ruộng diện tích rộng Hình 3.18 cho thấy khống chế mật số rầy nâu ruộng đến cuối vụ (75 NSS) Tỷ lệ rầy nâu bị nấm ký sinh cao so với ruộng nông dân phun lần thuốc hóa học Actara 25WG + Trebon 10EC (hình 3.19) Nhện bắt mồi bọ xít mù xanh, diện với mật cao ruộng thí nghiệm vụ (hình 3.20A-B) Trong thời gian thí nghiệm, mật số rầy nâu cao khoảng 16 1200con/m2 vào 40 65 NSS, sở để xác định thời điểm số lần phun nấm khơng cần thiết phải kết hợp với thuốc hóa học để bảo vệ thiên địch ruộng lúa môi trường, suất ruộng phun nấm cao suất ruộng nông dân phun lần hỗn hợp thuốc hóa học Actara 25WG Trebon 10EC (hình 3.21) 1200 RTN 1000 RND Tỷ lệ RN bị nấm ký sinh (%) Mật số rầy (con/m2) 1400 800 600 400 200 60 14 21 27 35 42 49 56 63 81 43 20 Hình 3.19 Tỷ lệ rầy nâu (Nilaparvata lugens) (%) bị nhiễm nấm B bassiana sau thí nghiệm Đức Hòa, Long An vụ hè thu 2006 đông xuân 2006-2007 B) 36 35 29 22 18 55 47 50 75 60 36 ĐX 2006-2007 HT 2006 Mật số (con/m2) Mật số (con/m2) 83 40 14.7 10 75 86 75 80 19.3 20 60 A) RND 30 Hình 3.18 Mật số rầy nâu ruộng thí nghiệm ruộng nơng dân sau phun nấm Ruộng thí nghiệm phun lần nấm B.bassiana (40 60 ngày sau sạ);:Ruộng nơng dân phun lần thuốc hóa học Actara 25WG + Trebon (20, 40 60 ngày sau sạ) NSS :ngày sau sạ 100 RTN 38.3 40 NSS 52.7 50 41 40 30 35 25 24 19 20 10 29 28 23 15 0 25NSS 35NSS 45NSS RTN 55NSS 65NSS 25NSS 75NSS 35NSS 45NSS 55NSS RTN RND 65NSS 75NSS RND Hình 3.20 Mật số bọ xít mù xanh (Cyrtorhinus lividipennis) nhện bắt mồi ăn thịt (Lycosa sp.) ruộng thí nghiệm Đức Hòa Long An, A) vụ hè thu 2006; B) vụ đông xn 2006-2007; RTN: ruộng thí nghiệm ;RND:ruộng nơng dân ; NSS:ngày sau sạ NSTT (T/ha) RTN Hình 3.21 Ảnh hưởng việc phun nấm B bassiana để trừ rầy nâu đến suất lúa (T/ha) vụ hè thu năm 2006 đơng xn 20062007, Đức Hòa, Long An; RTN: ruộng thí nghiệm; RND: ruộng nơng dân; HT: hè thu; ĐX: đông xuân RND HT 2006 ĐX 2006-2007 3.2 Những kết nghiên cứu nấm Metarhizium 3.2.1 Phân lập, định danh loài từ chi nấm Metarhizium theo phƣơng pháp truyền thống Từ mẫu trùng bị nấm ký sinh có đặc điểm chi Metarhizium, phân lập, xác định 16 MPL có đặc điểm lồi M anisopliae 17 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc nấm M anisopliae: Trên môi trường nuôi cấy PDA, khuẩn lạc ban đầu có màu trắng hình thành bào tử chuyển qua xanh lục tối, màu xanh vàng Khuẩn lạc nấm xốp, mịn phân bố tỏa tròn theo vòng đồng tâm hình tia bề mặt mơi trường Đặc điểm quan sinh bào tử hình dạng bào tử: Sợi nấm có vách ngăn, cuống sinh bào tử ngắn, hình trụ 6-13 x 2-4m tỏa tròn cành bào tử Bào tử đính đơn bào, hình trụ, hình hạt đậu có kích thước 6,5 - 8,9 x 2,2 - 3,2m Kích thƣớc bào tử nấm M anisopliae : MPL Ma (SXĐP-TN), Ma (BXĐ-TG), Ma (BXĐ-TV) Ma (RS-Q9) có kích thước bào tử lớn từ 8,1 - 8,9m chiều dài 2,7 3,2m chiều rộng Ba MPL Ma (RN-BC), Ma (BXĐ-Q9) Ma (SK-BTh) có kích thước nhỏ Các đặc điểm màu sắc khuẩn lạc, cách phân bố hình dạng bào tử tương tự với kết công bố tác giả ngồi nước đặc điểm hình thái lồi M anisopliae 3.2.2 Phân loại phân tích khác biệt di truyền nấm M anisopliae dựa vào trình tự vùng ITS-rDNA * Phân loại nấm M anisopliae dựa vào trình tự vùng ITS-rDNA : Kết PCR cho thấy, vùng ITS-rDNA có chiều dài khoảng 580bp Sản phẩm PCR giải trình tự trực tiếp với primer ITS1 ITS4 xác định có chiều dài từ 469 đến 472bp Trình tự vùng ITS - rDNA 16 MPL đăng ký trực tiếp Genbank với mã số đăng ký từ EU530666 đến EU530680 Vùng ITS1-5.8S-ITS2 16 MPL Metarhizium có chiều dài từ 469 - 472 bp, 11 MPL có chiều dài tồn vùng ITS1-5.8S-ITS2 469 bp, MPL dài 470bp MPL có chiều dài tồn vùng 472bp Có khác biệt vùng ITS mẫu phân lập tượng nucleotide thêm nucleotide thường xảy vùng ITS1, vùng ITS2 xảy Như vậy, vùng ITS2 có tính bảo tồn cao vùng ITS1 * So sánh trình tự vùng ITS-rDNA 16 MPL M anisopliae nghiên cứu với mẫu M anisopliae giới : 16 MPL M anisopliae với mẫu Trung Quốc, Úc Nhật Bản gần giống hoàn toàn 99-100%, tương đồng với mẫu Trung Quốc, mẫu Úc 92 – 93% Tương đồng với mẫu Thái Land, Úc Braxin thấp 74 – 80%, mẫu xác định khơng phải lồi M anisopliae Kết cố cho kết luận 16 MPL nghiên cứu thuộc lồi M anisopliae Kết phân nhóm lồi dựa trình tự vùng ITS - rDNA hình 3.27 cho thấy 16 MPL M anisopliae xếp nhóm với loài M anisopliae var anisopliae mẫu so sánh * Phân tích khác biệt di truyền MPL M anisopliae nghiên cứu dựa trình tự vùng ITS-rDNA : Kết phân nhóm vùng ITS-rDNA hình 3.28 cho thấy có nhóm di truyền khác biệt Trong đó, MPL Ma(BXĐ-Q9), Ma(GNN-CT) Ma(SCL-LA) phân nhóm độc lập, MPL Ma(CC-BTh) Ma(SK-BTh) phân thành nhóm, MPL Ma(RS-Q9), Ma(BXĐ-TG) Ma(BXĐ-TV) nhóm MPL lại phân thành nhóm Kết ghi nhận chưa thấy có mối liên hệ vùng địa lý thu mẫu, nguồn gốc ký chủ với nhóm di truyền sơ đồ phân nhóm Có biến đổi trình tự vùng ITS-rDNA, vùng ITS1 vùng biến đổi nhanh có 18 thể sử dụng độc lập cho phân tích khác biệt di truyền loài nấm M anisopliae AY624204 AY624204-M M cylindrosporae AF137059 AB071712-M AB071712 AF137059-M 99 DQ177434 M.a(SK-BTh)* DQ177434-M EU530679-M M.a(BXĐ-Q9)* M.a(SCL-LA)* M.a(GNN-CT)* EU530681-M 100 EU530666-M EU530667-M 93 M.a(CC-BTh)* EU530680-M M anisopliae var.anisopliae M.a(BD-TN)* EU530669-M M.a(RN-BC)* EU530673-M M.a(ST-ĐL)* EU530668-M 70 100 M.a(SXH-BD)* EU530676-M 95 EU530671-M M.a(RN-LA)* 73 EU530675-M M.a(SXĐP-TN)* EU530674-M M.a(SXC-CC* EU530670-M M.a(RN-BT)* 75 EU530672-M M.a(BXĐ-TG)* EU530678-M M.a(BXĐTV)* EU530677-M M.a(RS-Q9)* EF113338-M EF113338 99 AF137063-M AF137063 DQ177433-M DQ177433 AF138267-M AF138267 99 M acridum AY375449-M AY377433 M flavoviridae Hình 3.27 Sơ đồ phân nhóm lồi 16 MPL Metarhizium nghiên cứu (có dấu sao) với mẫu Metarhizium giới dựa trình tự vùng ITS - rDNA Phần trăm giá trị bootstrap từ 1000 lần lặp lại nhánh Mẫu AY624204 (M cylindrosporae) sử dụng loài xa M.cylindro AY624204 – M cylindrosporae EU530679-M M.a(BXĐ-Q9) EU530666-M M.a(GNN-CT) M.a(CC-BTh) EU530680-M 84 100 M.a(SK-BTh) EU530681-M M.a(SCL-LA) EU530667-M I II III IV M.a(BD-TN) EU530668-M 92 M.a(RN-BC) EU530669-M 95 M.a(ST-ĐL) EU530673-M 75 M.a(SXH-BD) EU530676-M M.a(RN-BT) 78 EU530670-M V M.a(SXC-CCh) EU530674-M 58 M.a(RN-LA) EU530671-M EU530675-M M.a(SXĐP-TN) EU530672-M M.a(RS-Q9) 67 76 EU530677-M M.a(BXĐ-TG) VI EU530678-M M.a(BXĐ-TV) Hình 3.28 Sơ đồ phân nhóm quan hệ di truyền 16 MPL M anisopliae nghiên cứu, xây dựng theo phương pháp parsimony dựa trình tự vùng ITS-rDNA Phần trăm giá trị bootstrap từ 1000 lần lặp lại nhánh Mẫu AY624204 (M cylindrosporae) sử dụng loài xa Xác định gen Pr1 nấm M anisopliae phƣơng pháp nested-PCR: Đã xác định 10/16 MPL cho đoạn DNA dài khoảng 1,2 kb sau lần PCR Kết giải trình tự gen Pr1 có chiều dài từ 798 đến 799 bp Kết tương tự kết nghiên cứu Wang cs (2002) [185], Lead cs (1997) Như vậy, nested-PCR gen Pr1có thể sử dụng chọn lọc mẫu nấm nghiên cứu ứng dụng 19 Phân tích khác biệt di truyền MPL M anisopliae dựa vào trình tự gen Pr1: Có biến đổi nucleotide đoạn gen Pr1, với mẫu M.a(BXĐ-TG) M.a(RS-Q9) Hình 3.32 cho thấy, 10 MPL có gen Pr1 phân hóa thành nhóm khác biệt Ba MPL Ma(BXĐ-TV), Ma(BXĐ-TG), Ma(RS-Q9) tách thành nhóm riêng biệt cho thấy thay đổi cấu trúc Pr1 xảy nhanh vùng ITS – rDNA M.a(BXĐ-TV) Ma BXD-TV I M.a(BXĐ-TG) C9-MetPr5 100 II M.a(SXĐP-TN) C8-MetPr5 100 M.a(RS-Q9) RBC-Ma RS- 100 M.a(CC-BTh) C4-Ma CC-B 50 M.a(RN-BC) C1-Ma BXD- 62 M.a(RN-LA) C5-Ma RN-L 100 III M.a(RN-BT) C3-Ma RN-B 80 M.a(BXĐ-Q9) C2-Ma BXD- 65 M.a(SXH-BD) C6-Ma SXH- Hình 3.32 Sơ đồ phân nhóm di truyền 10 MPL M anisopliae nghiên cứu, xây dựng theo phương pháp parsimony dựa trình tự gen Pr1 Phần trăm giá trị bootstrap từ 1000 lần lặp lại nhánh 3.2.3 Nghiên cứu đặc điểm sinh học nấm M anisopliae ký sinh sâu hại trồng 3.2.3.1 Xác định thời gian bào tử nảy mầm: thời gian bào tử nảy mầm đạt 90% nấm M anisopliae từ 16 đến 20 sớm so với thời gian nảy mầm nấm B bassiana 3.2.3.2 Khả hình thành bào tử MPL M anisopliae: Trên môi trường nuôi cấy SDAY+K, nhiệt độ 27±20C, ẩm độ 80,5%, MPL Ma(RN-LA), Ma(SXĐP-TN), Ma(RS-Q9),Ma(SXH-BD) Ma(CC-BTh) hình thành bào tử nhiều từ 10,618,6x106bt/cm2, MPL Ma(RS-Q9) MPL Ma(SXH-BD) 3.2.3.3 Ảnh hƣởng thời gian ni cấy đến hình thành bào tử nấm M anisopliae Sau nuôi cấy 14 ngày điều kiện nhiệt độ 27±20C ẩm độ trung bình 80,5 %, tất 13 MPL có số lượng bào tử hình thành tối đa, sau giảm dần từ 21 đến 35 ngày Như vậy, thời gian MPL M anisopliae hình thành bào tử đạt số lượng tối đa khoảng từ 12 đến 14 ngày sau nuôi cấy 3.2.3.4 Ảnh hƣởng nguồn dinh dƣỡng đến phát triển M anisopliae: Hình 3.34 cho thấy, nấm M anisopliae phát triển tốt môi trường SB+KC SDAY+K, MPL Ma(BXĐ-TG), Ma(BXĐ-TV) Ma(RS-Q9) có tốc độ phát triển nhanh 6,57,5mm/ngày Hình 3.35 cho thấy, môi trường SDAY+K môi trường tạo nhiều bào tử, môi trường SB+KC thấp môi trường Dulmage Rhodes 20 Môi trường SB+KC Môi trường SDAY+K Môi trường DUL Tốc độ phát triển (mm/ngày) M a(RNBC) M a(BXĐQ9) M a(RNBT) M a(SCLLA) M a(RNLA) M a(SXĐ P-TN) M a(SXCCCh) M a(SKBTh) M a(SXHBD) M a(CCBTh) M a(BXĐ- M a(BXĐTG) TV) M a(RSQ9) Mẫu phân lập Hình 3.34 Tốc độ phát triển trung bình MPL M anisopliae loại mơi trường dinh dưỡng khác (giá trị trung bình ± SD, nhiệt độ 27±20C 12 sáng/12 tối) Mật số bt (x107bt/cm2) 25 Môi trường SB+KC Môi trường SDAY+K Môi trường DUL 20 15 10 M.a(RNBC) M.a(BXĐQ9) M.a(RNBT ) M.a(SCLLA) M.a(RNLA) M.a( SXĐP -T N) M.a(SXCCCh) M.a(SKBT h) M.a(SXHBD) M.a(CCBT h) M.a(BXĐT G) M.a(BXĐT V) M.a(RSQ9) Mẫu phân lập Hình 3.35 Khả hình thành bào tử MPL M anisopiae loại môi trường dinh dưỡng khác 14 ngày sau nuôi cấy (Giá trị TB ± SD, nhiệt độ 27±20C 12 sáng/12 tối) 3.2.3.5 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến phát triển hình thành bào tử MPL M anisopliae: Nhiệt độ tối ưu để sợi nấm phát triển hình thành bào tử 250-280C, chậm 350C hoàn toàn bị ức chế 370C Sự hình thành bào tử MPL tăng 250C, đạt tối đa 280C sau giảm 300C đến 350C MPL Ma(RS-Q9) có số lượng bào tử cao 61,1x108 bt/cm2 * Khả nảy mầm nấm M anisopliae nhiệt độ cao: Ở chu kỳ nhiệt 350C/250C, có 9/16 MPL nảy mầm 90% Ở 380C/250C, MPL Ma(RN-LA), Ma(SXH-BD) Ma(BXĐ-TV) nảy mầm khoảng từ 66,9 – 79,3%, MPL nảy mầm 80%, MPL M.a(RS-Q9) nảy mầm 90% sau 24 3.2.3.6 Ảnh hƣởng ẩm độ lên hình thành nảy mầm nấm M anisopliae: Bào tử nấm M anisopliae khơng hình thành nảy mầm mức ẩm độ 75,5%, 85% 89% Bào tử bắt đầu hình thành 92% tăng dần 94% đến 100%, ẩm độ thích hợp cho bào tử M anisopliae nảy mầm khoảng 98% 3.2.3.7 Ảnh hƣởng số thuốc trừ sâu, trừ nấm đến phát triển khả nảy mầm bào tử nấm M anisopliae: Hình 3.36 cho thấy, thiamethoxam, triazophos, fipronil độc M anisopliae nồng độ Carbaryl ức chế 100% phát triển nồng độ 500ppm Azadirachtins không ảnh hưởng đến phát triển M anisopliae Các hoạt chất trừ nấm chlorothalonil validamycin ảnh hưởng đến phát triển nấm 50ppm Mancozeb, zineb, carbendazim benomyl ức chế phát triển sợi nấm từ nồng độ thấp (hình 3.37) Sự nảy mầm bào tử M anisopliae không bị ảnh hưởng 21 thiamethoxam, triazophos, deltamethrin azadirachtins nồng độ thí nghiệm Fenitrothion nồng độ thấp 125ppm ảnh hưởng đến nảy mầm bào tử ức chế mạnh nồng độ cao 250 500ppm 120 120 50ppm 125ppm 250ppm 125ppm 100 500ppm % ức chế so với ĐC % ức chế so với ĐC 100 80 60 40 20 250ppm 80 60 40 20 0 Hình 3.36 Ảnh hưởng thuốc trừ sâu lên phát triển M anisopliae thí nghiệm in vitro 1-Thiamethoxam;2-Triazophos;3Deltamethrin; 4-Fipronil; 5-Fenitrothion; 6-Chlorpyrifos; 7- Carbaryl; 8-Azadirachtins Hình 3.37 Ảnh hưởng thuốc trừ nấm lên phát triển M anisopliae thí nghiệm in vitro.1-Chlorothalonil; 2-Validamycin;3-Mancozeb;4-Zineb; 5-Carbendazim; 6- Benomyl 3.2.4 Đánh giá độc tính nấm M anisopliae số sâu hại trồng 3.2.4.1 Xác định nồng độ trừ sâu xanh da láng (S exigua) nấm M anisopliae điều kiện in vitro: tỷ lệ sâu chết nồng độ 104 - 105 bt/ml thấp 40%, tỷ lệ sâu chết tăng dần nồng độ 107 108bt/ml MPL Ma(SXH-BD) Ma(SXĐP-TN) gây chết cho sâu với tỷ lệ cao 81,2- 89,9% (107bt/ml) 86,6 - 93,1% (108bt/ml) Ở nồng độ 108bt/ml, MPL Ma(RS-Q9) gây chết cho sâu cao 82,8% 3.2.4.2 Xác định nồng độ trừ rầy nâu (N lugens) nấm M anisopliae điều kiện nhà lƣới Ở nồng độ 250 triệu bào tử/ml trở xuống hiệu lực trừ rầy nâu thấp, hiệu lực bắt đầu tăng nồng độ 500 triệu bào tử trở lên Các MPL từ sâu, rầy hại lúa có hiệu lực cao 85,0 – 91,6% MPL Ma(RS-Q9) gây chết cho rầy nâu lên đến 77%, Ma(SXHBD) 64% Ma(CC-BTh) 62% 10 ngày sau phun 3.2.4.3 Xác định nồng độ trừ sâu xanh da láng nấm M anisopliae điều kiện nhà lƣới Hiệu lực trừ sâu xanh da láng nồng độ từ 50- 250 triệu bào tử/ml thấp 50,8 – 57,2% Hiệu lực tăng dần nồng độ 500 -700 triệu bào tử với hiệu lực cao 90,5 – 94,1% 3.2.4.4 Khả gây bệnh nấm M anisopliae số sâu hại điều kiện nhà lƣới đồng ruộng a) Kết thí nghiệm nhà lƣới * Đối với rầy nâu hại lúa (N lugens): Đa số MPL từ sâu, rầy hại lúa có khả gây bệnh cao cho ấu trùng thành trùng MPL Ma(RN-LA) thể khả gây bệnh cao nhất, MPL Ma(RS-Q9) gây chết cho ấu trùng rầy nâu 63,8% 55,8% thành trùng (hình 3.39) * Đối với sâu xanh da láng hại hành (S exigua): Hình 3.40 cho thấy, hiệu lực MPL từ sâu, rầy hại lúa sâu xanh da láng thấp MPL Ma(SXH-BD) gây chết 22 cho sâu cao với tỷ lệ lên đến 83,8%, MPL Ma(SXĐP-TN) 82,8% Ma(CC-BTh) 50,2% 100 90 Ấu trùng 80 Thành trùng Hiệu lực (%) 70 60 50 40 30 20 10 Ma(RNBC) Ma(BXĐQ9) Ma(RNBT) Ma(BXĐTG) Ma(SCLLA) Ma(BXĐTV) Ma(RNLA) MPL từ sâu, rầy hại lúa Ma(SXĐP- Ma(SXCTN) CC) Ma(RSQ9) Ma(SKBTh) Ma(SXHBD) Ma(CCBTh) Ometar MPL từ sâu hại trồng cạn Hình 3.39 Hiệu lực trừ rầy nâu (%) nấm M anisopliae (2,5x107bt/ml) thí nghiệm nhà lưới (Đại Học Nông Lâm TP.HCM, năm 2005 Nhiệt độ TB 27,30C, ẩm độ TB 80,5% Hiệu lực hiệu đính theo Abbott, 1925 90 80 Hiệu lực (%) 70 60 50 40 30 20 10 Ma(RN- Ma(BXĐ- Ma(RN- Ma(BXĐ- Ma(SCL- Ma(BXĐ- Ma(RNBC) Q9) BT) TG) LA) TV) LA) Ma(SXĐ Ma(SXCP-TN) CC) Ma(RSQ9) Ma(SKBTh) Ma(SXHBD) Ma(CCBTh) Ometar MPL từ sâu hại trồng cạn MPL từ sâu, rầy hại lúa Hình 3.40 Hiệu lực trừ sâu xanh da láng chết (%) nấm M anisopliae (2,5x107 bt/ml) thí nghiệm nhà lưới (Đại Học Nông Lâm TP.HCM, năm 2005) Nhiệt độ TB 27,30C, ẩm độ TB 80,5% Hiệu lực hiệu đính theo Abbott, 1925 b) Kết thí nghiện ngồi đồng diện tích nhỏ Trong điều kiện kết hợp với thuốc hóa học, hiệu lực nấm rầy nâu tăng dần từ NSP kéo dài đến 21 NSP, suất không khác biệt chưa thấy ảnh hưởng nấm thiên dịch ruộng lúa Đối với sâu xanh da láng hành lá, hiệu lực nấm M anisopliae xử lý đơn kết hợp với thuốc Hostathion 20EC kéo dài đến 21 ngày c) Kết thí nghiệm ngồi đồng diện tích rộng * Hiệu lực trừ rầy nâu hại lúa nấm M anisopliae Đức Hòa - Long An, vụ hè thu 2006 đông xuân 2006-2007 Đồ thị mật số rầy nâu từ hình 3.41 cho thấy, sử dụng nấm M anisopliae với lần phun (40 60 ngày sau sạ) khống chế mật số rầy ruộng 1000 con/m2 75 ngày sau sạ Tỷ lệ rầy nâu chết bị nấm ký sinh cao so với ruộng nông dân phun lần thuốc Actara 25WG + Trebon 10EC (hình 3.42) Hình 3.44, suất lúa ruộng phun nấm không khác biệt so với suất ruộng nơng dân phun lần thuốc hóa học Actara 25WG + Trebon 10EC * Sử dụng nấm M anisopliae trừ sâu xanh da láng (S exigua) hành Tân Hạnh, Đồng Nai Số liệu từ bảng 3.38 cho thấy, mật số sâu xanh da láng khơng có 23 khác biệt so với ruộng nông dân Tỷ lệ bụi hành bị sâu hại (%) ruộng khơng có khác biệt có ý nghĩa qua phân tích thống kê T-test Năng suất hành ruộng thí nghiệm khơng khác biệt so với suất ruộng nông dân nông dân phun tới 13 lần thuốc hóa học 75.3 80 1200 Tỷ lệ RN bị nấm ký sinh (%) Mật số rầy (con/m2) 1400 RTN RND 1000 800 600 400 200 NSS 14 21 28 35 42 49 56 63 60 69 65 39 38 32 28 30 22.7 17.3 20 10 29 23 20 10 ĐX 2006-2007 Hình 3.42 Tỷ lệ rầy nâu (Nilaparvata lugens) (%) bị nhiễm M anisopliae sau thí nghiệm Đức Hòa Long An, vụ hè thu 2006 đông xuân 2006-2007 B) 40 30 51 49 50 54 50 40 30 60 76 71 RND 40 HT 2006 82 A) RTN 50 Mật số (con/m2) Mật số (con/m2) 80 70 60 75 Hình 3.41 Mật số rầy nâu ruộng thí nghiệm ruộng nông dân sau ki xử lý M anisopliae Ruộng thí nghiệm phun lần (40 60 ngày sau sạ); Ruộng nông dân phun lần thuốc Actara 25WG + Trebon (20, 40 60 ngày sau sạ) 90 67.7 70 46 45 33 29 22 10 21 19 20 17 0 25NSS 35NSS 45NSS 55NSS RTN 65NSS 25NSS 75NSS 35NSS 45NSS 55NSS RTN RND 65NSS 75NSS RND Hình 3.43 Mật số bọ xít mù xanh nhện bắt mồi ăn thịt ruộng thí nghiệm Đức Hòa Long An, vụ hè thu 2006 đông xuân 2006-2007 A) Mật số nhện bắt mồi ăn thịt bọ xít mù xanh vụ hè thu B) Mật số nhện bắt mồi ăn thịt bọ xít mù xanh, vụ đơng xn NSTT (T/ha) RTN RND Hình 3.44 Ảnh hưởng việc phun nấm M anisopliae để trừ rầy nâu đến suất lúa (T/ha) vụ hè thu năm 2006 đơng xn 20062007, Đức Hòa, Long An ĐX 2006-2007 HT 2006 Bảng 3.38 Kết sử dụng nấm M anisopliae để trừ sâu xanh da láng (S exigua) hành Tân Hạnh, Đồng Nai, năm 2006 Chỉ tiêu theo dõi Mật số sâu (con/m2) Tỷ lệ bụi hành bị hại (%) Năng suất (t/ha) RTN Đợt RND Ttính RTN Đợt RND Ttính 36,8 35,2 24,5 19,6 RTN Đợt RND Ttính -1,98ns 26,1 30,7 -2,34ns 34,5 30,2 -1,34ns 22,9 -0,81ns 16,5 21,2 -2,13ns 22,6 19,3 -0,85ns 20,7 1,02ns 23,1 22,8 0,19ns 20,7 21,5 0,32ns RTN: ruộng thí nghiệm; RND: ruộng nơng dân Ruộng thí nghiệm: phun lần nấm M anisopliae, lần thuốc vi sinh success 25EC (Spinosad), lần thuốc thảo mộc Nimbecidin 0,03EC (Azadirachtins) Ruộng nông dân phun 13 lần thuốc trừ sâu hóa học: Endosol 35EC, Lannat 40SP, Padan 95SP 24 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN Kết định danh theo phương pháp truyền thống xác định 13 MPL Beauveria thuộc loài B bassiana 16 MPL Metarhizium thuộc loài M anisopliae Theo phương pháp sinh học phân tử, phân tích trình tự DNA vùng ITS-rDNA xác định 13 MPL Beauveria thuộc loài B bassiana 16 MPL Metarhizium lồi M anisopliae Sự biến động trình tự DNA vùng ITS-rDNA 13 MPL B bassiana với nhóm di truyền nhóm di truyền nấm M anisopliae nhận biết vùng ITS-rDNA Phát 10 số 16 MPL M anisopliae có gen Pr1 phương pháp nested-PCR với nhóm di truyền khác biệt dựa phân tích trình tự gen Pr1 Kết nghiên cứu đặc điểm sinh học nấm B bassiana M anisopliae cho thấy, nấm M anisopliae nảy mầm sớm, hình thành bào tử nhiều hơn, chịu nhiệt cao hơn, khả gây bệnh cho sâu hại cao nấm B bassiana Mơi trường SDAY+K thích hợp cho nấm tạo nhiều bào tử Ẩm độ thích hợp cho nấm nảy mầm 98% Số lượng bào tử cao 12-14 ngày sau nuôi cấy Thiamethoxam, triazophos, deltamethrin azadirachtins nồng độ khuyến cáo không ảnh hưởng đến B bassiana M anisopliae Tất loại thuốc trừ nấm bệnh ảnh hưởng đến phát triển nồng độ thấp Kết đánh giá hiệu lực nấm B bassiana M anisopliae trừ rầy nâu sâu xanh da láng cho thấy: - Trong phòng nhà lƣới: Nồng độ 108bt/ml, hiệu lực nấm B bassiana sâu xanh da láng 86,1 88,6% Đối với M anisopliae hiệu lực trừ sâu cao hơn, 86,6% 93,1% Ở nồng độ 2,5x107bt/ml, hiệu lực B bassiana ấu trùng rầy nâu từ 85,6% - 88,3%, thành trùng 80,3% -85,5% Hiệu lực M anisopliae ấu trùng 91,8%, thành trùng 86,7% Ở nồng độ từ - 7x108bt/ml, hiệu lực trừ rầy nâu nấm B bassiana từ 90,6% - 91,6% Hiệu lực M anisopliae trừ sâu xanh da láng cao từ 90,4% - 94,1% 10 ngày sau phun - Ngoài đồng ruộng: Hiệu lực nấm B bassiana M anisopliae rầy nâu 14 ngày sau phun đạt từ 59,1-77,5% 68,7-75,8% Đối với sâu xanh da láng 61,4 72,2% kéo dài đến 21 ngày sau phun Sử dụng nấm B bassiana M anisopliae diện tích rộng khống chế mật số sâu rầy vào cuối vụ Chưa thấy có ảnh hưởng bất lợi cho thiên địch sâu hại hệ sinh thái ruộng lúa nhện bắt mồi ăn thịt (Lycosa sp.) bọ xít mù xanh (Cyrtorhinus lividipennis) 3.3.2 ĐỀ NGHỊ Tiếp tục thử nghiệm MPL B bassiana M anisopliae nghiên cứu vùng sinh thái khác nhau, loại sâu hại khác để xác định phổ ký chủ hiệu lực nấm Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến hiệu lực nấm sau phóng thích ngồi đồng Tiếp tục nghiên cứu khác biệt di truyền quần thể nấm B bassiana M anisopliae tồn nước ta với marker phân tử khác Nghiên cứu nguồn gốc phân bố địa lý nhóm tự nhiên, mối tương quan trình hình thành bệnh nấm với trùng ký chủ môi trường sống ... khả gây bệnh mẫu nấm phát liệu sở khơng nhiều thông tin di truyền phân tử Từ sở trên, đề tài Nghiên cứu đặc tính sinh học đánh giá độc tính mẫu phân lập nấm Beauveria Metarhizium ký sinh côn trùng. .. trùng gây hại thực Mục tiêu nghiên cứu Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để định danh loài từ chi nấm Beauveria Metarhizium Nghiên cứu số đặc điểm sinh học, khả gây bệnh, yếu tố ảnh hưởng đến độc. .. hưởng đến độc tính mẫu nấm Beauveria Metarhizium định danh loài nhằm thiết lập sở liệu sinh học cho mẫu nấm địa, cung cấp thông tin cho việc chọn mẫu nấm có độc tính cao sâu hại nghiên cứu ứng dụng