Mục đích nghiên cứu của luận án nhằm nghiên cứu đánh giá các đặc điểm sinh học cơ bản và biện pháp kỹ thuật nhân giống in vitro phục vụ công tác bảo tồn và phát triển hai loài lan quý Nghệ tâm và Hạc vỹ, từng bước góp phần vào sản xuất cây dược liệu, cây cảnh có giá trị của Việt Nam.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ LÀI NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG PHỤC VỤ BẢO TỒN HAI LOÀI LAN NGHỆ TÂM (Dendrobium loddigesii Rolfe), HẠC VỸ (Dendrobium aphyllum (Roxb.) Fisher) CỦA VIỆT NAM Chuyên ngành: Mã số: Khoa học trồng 62 01 10 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Vũ Mạnh Hải TS Phạm Hương Sơn HÀ NỘI - 2019 Cơng trình hồn thành tại: VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Vũ Mạnh Hải TS Phạm Hương Sơn Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp Viện khoa học Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi phút, ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Thư viện Quốc gia Việt Nam Thư viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Thư viện…………………………………………… MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Nghệ tâm (Dendrobium loddigesii Rolfe) Hạc vỹ (Dendrobium aphyllum (Roxb.) Fisher) thuộc chi Hoàng thảo (Dendrobium) hai loài lan rừng đẹp, có giá trị y học giá trị thương mại cao Theo y học cổ truyền Trung Quốc, Nghệ tâm có tác dụng ngăn ngừa tế bào ung thư dày, ung thư phổi, chất chống đông máu (Tsai et al., 2010); ung thư tuyến giáp, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư thực quản, ung thư tuyến tụy, có tác dụng điều trị bệnh tiểu đường (Veronika Cakova et al., 2017); làm trắng da (Ho Kyung Jung et al., 2015) Hạc vỹ dùng trị ho, đau họng, bỏng lửa, toàn điều trị kinh phong trẻ em, ăn uống bị ngộ độc (Sách Đỏ Việt Nam, 2007) Trong xu nhu cầu sử dụng làm hoa cảnh dược liệu tăng mạnh năm gần đây, hai loài Nghệ tâm Hạc vỹ bị khai thác ạt, dẫn đến nguồn nguyên liệu trở nên cạn kiệt Mặt khác, tỷ lệ nảy mầm từ hạt tự nhiên thấp vùng phân bố Nghệ tâm Hạc vỹ bị thu hẹp nên hai lồi lan tình trạng gần dần tự nhiên Vì vậy, việc nghiên cứu cơng nghệ nhân giống phục vụ cho công tác bảo tồn phát triển hai loài lan cần thiết Một biện pháp hữu hiệu để nhân nhanh bảo tồn lồi lan q nói chung Nghệ tâm, Hạc vỹ nói riêng kỹ thuật nhân giống in vitro tạo hạt giống nhân tạo, kéo dài trình bảo quản cung cấp hạt giống cho sản xuất Nhằm góp phần làm phong phú nguồn dược liệu quý Việt Nam, làm đẹp môi trường cảnh quan, nâng cao thu nhập cho người trồng lan, thực đề tài:“Nghiên cứu đặc điểm sinh học kỹ thuật nhân giống phục vụ bảo tồn hai loài lan Nghệ tâm (Dendrobium loddigesii Rolfe), Hạc vỹ (Dendrobium aphyllum (Roxb.) Fisher) Việt Nam” Mục tiêu đề tài Nghiên cứu đánh giá đặc điểm sinh học biện pháp kỹ thuật nhân giống in vitro phục vụ công tác bảo tồn phát triển hai loài lan quý Nghệ tâm Hạc vỹ, bước góp phần vào sản xuất dược liệu, cảnh có giá trị Việt Nam Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài - Ý nghĩa khoa học Các kết nghiên cứu đề tài cung cấp liệu khoa học có giá trị số biện pháp kỹ thuật nhân giống dựa đặc điểm sinh học hai lồi lan Nghệ tâm Hạc vỹ, góp phần bảo tồn, khai thác phát triển chúng cách phù hợp điều kiện Việt Nam Các kết nghiên cứu có tính hệ thống đặc điểm nơng sinh học, dược tính cơng nghệ tạo hạt giống nhân tạo lan Nghệ tâm Hạc vỹ nguồn tư liệu có giá trị, làm sở cho nghiên cứu ứng dụng tiếp theo, bổ sung vào tài liệu giảng dạy chuyên ngành trường đại học, chương trình phổ biến kiến thức cho cộng đồng - Ý nghĩa thực tiễn đề tài Kết đề tài góp phần tích cực vào cơng tác bảo tồn hai lồi lan dược liệu quý Nghệ tâm Hạc vỹ Việt Nam thông qua việc thu thập lưu giữ với đầy đủ thông tin giống gốc địa Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro, đề tài nhân giống tạo hạt giống nhân tạo số lượng lớn giống bệnh, khỏe với hệ số nhân cao, góp phần mở rộng diện tích trồng hai lồi lan Nghệ tâm Hạc vỹ cho mục đích sản xuất dược phẩm mỹ phẩm phục vụ nội tiêu hướng tới xuất với hiệu kinh tế cao Đóng góp đề tài - Đề tài cơng trình nghiên cứu có hệ thống đặc điểm hình thái, cấu trúc vi phẫu thành phần hóa sinh hai lồi lan Nghệ tâm (D loddigesii) Hạc vỹ (D aphyllum) có giá trị làm thuốc làm cảnh cao - Đã xây dựng quy trình nhân giống in vitro cho hai loài lan quý Nghệ tâm Hạc vỹ phù hợp với điều kiện Việt Nam, dễ áp dụng với nguồn ngun vật liệu nước nên có tính khả thi cao - Quy trình tạo hạt giống nhân tạo nhân giống in vitro sau bảo quản hạt hai loài lan kéo dài thời gian bảo quản với tỷ lệ hạt nảy mầm từ 68% đến 70%, chi phí thấp giữ đặc tính giống - Đã xác định biện pháp kỹ thuật sản xuất giống in vitro vườn sản xuất làm sở để xây dựng quy trình cơng nghệ hồn chỉnh kỹ thuật sản suất hai loài lan Nghệ tâm Hạc vỹ Việt Nam Cấu trúc luận án Luận án gồm 130 trang không kể tài liệu tham khảo phần phụ lục, 36 bảng kết nghiên cứu, 36 hình ảnh,169 tài liệu tham khảo nước Nội dung luận án gồm phần: Mở đầu: trang, Chương 1: Tổng quan tài liệu sở khoa học đề tài 34 trang, Chương 2: Vật liệu, nội dung phương pháp nghiên cứu 14 trang, Chương 3: Kết thảo luận 72 trang, Kết luận, đề nghị trang, Tài liệu tham khảo 16 trang phần phụ lục 25 trang CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc phân bố hai loài lan Nghệ tâm (D loddigesii) Hạc vỹ (D aphyllum) Việt Nam Chi Hoàng thảo (Dendrobium) đặt tên vào năm 1799, Dendrobium hiểu lan sống cây, tiếng Việt Nam gọi lan Hoàng thảo (Trần Duy Quý, 2005) Chi lan Hoàng thảo Việt nam đa dạng phong phú phân bố chúng đặc thù Lan Nghệ tâm Nam có mặt Thái Nguyên, Hà Giang, Lai Châu, Nghệ An (Averyanov et al., 2005) Lan Hạc vỹ phân bố Lâm Đồng, Khánh Hòa, Lào Cai, Bắc Cạn, Ninh Thuận (Averyanov et al., 2005); Sách đỏ Việt Nam, 2007) 1.2 Một số đặc điểm thực vật học hai loài lan Nghệ tâm (D loddigesii) Hạc vỹ (D aphyllum) Bảng 1.1 Đặc điểm thực vật hai loài lan nghiên cứu Đặc điểm Thân Lá Hoa Nghệ tâm (D loddigesii) Lan sống phụ sinh, mọc bụi nhỏ, thân mềm buông xuống dài 10 - 20 cm, có đốt thưa (Trần Hợp, 1998) Lá thn hình giáo, dài - cm, rộng - cm, dễ rụng (Trần Hợp, 1998) Cụm hoa mọc nách lá, - hoa, mọc thân mang lá, màu đậm (gân đỏ) có đốm đậm Cánh mơi tròn, mép có nhiều lơng mịn có màu vàng nghệ Mùa hoa tháng - (Trần Hợp, 1998; Zhu Guanghua et al., 2009) Hạc vỹ (D aphyllum) Lan sống phụ sinh, thân buông xuống, mảnh dài 100 cm (Trần Hợp, 1998) Lá xếp thành hình mác nhọn, dài - cm, rộng 1,5 - cm (Sách Đỏ Việt Nam, 2007) Cụm hoa bên, - hoa, mọc suốt dọc chiều dài thân khơng mang lá, màu tím nhạt hay trắng Cánh mơi màu vàng nhạt có gân Mùa hoa tháng - (Trần Hợp, 1998; Sách Đỏ Việt Nam, 2007) 1.3 Giá trị sử dụng thực trạng khai thác hai loài lan Nghệ tâm (D loddigesii) Hạc vỹ (D aphyllum) Việt Nam Theo y học cổ truyền Trung Quốc, Nghệ tâm có tác dụng ngăn ngừa tế bào ung thư dày, ung thư phổi, chống đông máu (Tsai et al., 2010); ung thư tuyến giáp, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư thực quản, ung thư tuyến tụy, có tác dụng điều trị bệnh tiểu đường (Veronika Cakova et al., 2017); làm trắng da (Ho Kyung Jung et al., 2015) Lan Hạc vỹ có tác dụng bổ âm nhiệt, tạo nước bọt giúp tiêu hóa, bổ phế giảm ho (Zhao Yong Ling et al., 1994) Do có giá trị làm hoa cảnh, dược liệu giá trị kinh tế cao nên lan Nghệ tâm Hạc vỹ số năm gần bị khai thác mức dẫn đến nguy hẳn tự nhiên 1.4 Tình hình sản xuất tiêu thụ lan Hoàng thảo (Dendrobium) giới Việt Nam Với hoa lan, thị trường thương mại toàn cầu chủ yếu hoa chậu hoa cắt cành, ước tính khoảng 10% hoa tươi cắt cành tiêu thụ thị trường quốc tế với giá trị trung bình giai đoạn từ năm 2007 đến năm 2012 483 triệu USD (Jayarama Reddy, 2016) Hà Lan nước dẫn đầu giới sản xuất xuất hoa lan (39,7%), Thái Lan (28,4%), Đài Loan (10%), Singapore (10%) New Zealand (6%) Các nước nhập chủ yếu Nhật Bản (30%), Anh (12%), Ý (10%), Pháp (7%) Mỹ (6%) Lan cắt cành trao đổi thương mại giới chủ yếu loài lan Dendrobium (chiếm 85%) Phalaenopsis, Cymbidium (chiếm 15%) (Cheamuangphan et al., 2013; De et al., 2014) Tại Hà Lan, việc sản xuất hoa lan Dendrobium chậu tăng phổ biến đạt 40 đến 50 triệu (De et al., 2014) Ở Việt Nam diện tích trồng hoa lan khiêm tốn, chiếm 10% diện tích loại hoa trồng Sản xuất hoa lan Việt Nam tập trung theo hướng sản xuất theo quy mơ cơng nghiệp lồi lan lai tạo nhập nội (lan công nghiệp) khai thác, nuôi trồng loài hoa lan địa (lan rừng) Đối với thị trường nước, sản lượng hoa phong lan chưa đáp ứng nhu cầu người tiêu dùng, khoảng 30 - 40% nhu cầu lan cắt cành lại phải nhập từ nước khác 1.5 Tình hình nghiên cứu thực vật học nhân giống lan Hoàng thảo (Dendrobium) giới Việt Nam 1.5.1 Nghiên cứu thực vật học lan Hoàng thảo (Dendrobium) Shi-Jian Yang et al., (2016), nghiên cứu đặc điểm giải phẫu sinh lý giả hành loài D chrysotoxum, D officinale D crystallinum D crystallinum liên quan đến cân nước Metusala et al., (2017) nghiên cứu vi phẫu thân hai loài D capra D arcuatum môi trường sống khác liên quan đến khả thích ứng hai lồi điều kiện khơ hạn Theo y học cổ truyền, lan Nghệ tâm (D loddigesii) có tác dụng chống tế bào ung thư dày ung thư phổi, chất chống đông máu (Tsai et al., 2010), điều trị bệnh tiểu đường type (Zhang et al., 2011) Trong lan Nghệ tâm có chứa shihunine, 9,10 dihydrophenanthrene 2,4,7 triol, moscatin, loddigesiinols C, moscatilin, gigantol tristin (Li Chunyan et al., 2013) Theo nghiên cứu Ho Kyung Jung et al., (2015) chất chiết xuất từ lan Nghệ tâm có hiệu ức chế melanin, ức chế hoạt động tyrosinase phát triển dendrite, có tác dụng làm trắng da Veronika Cakova et al., (2017) cho moscatilin Nghệ tâm có tác dụng ngăn ngừa tế bào ung thư tuyến giáp, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư thực quản, ung thư tuyến tụy Loddigessinol G-J, Crepidatuol B có tác dụng điều trị bệnh tiểu đường Trong thân lan Hạc vỹ có polysaccharides hợp chất phenol như: moscatin, moscatilin tricetin 3', 4', 5'-trimetyl ete 7-O--glucopyranoside, ức chế sản xuất NO, có hoạt động điều hòa miễn dịch Các chất chống oxy hoá peptide chiết xuất từ Hạc vỹ (D aphyllum) bao gồm superoxidedismutase, catalase glutathione peroxidase Các axit amin: Ala, Val, Ile, Leu, Tyr, Phe, Try, Pro, Met Cys peptit DA-P có hàm lượng chất dinh dưỡng cao có hoạt động chống oxy hoá tối ưu (Huifan Liu et al., 2017) Ở Việt Nam, năm gần hầu hết cơng trình nghiên cứu tập trung hình thái học thân, lá, hoa, rễ (Trần Hợp, 1998; Sách Đỏ Việt Nam, 2007; Dương Đức Huyến, 2007), nghiên cứu vi phẫu, phân loại dựa thị hình thái với lan Hồng thảo hạn chế Cao Phi Bằng cs., (2017) tiến hành nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng, giải phẫu thoát nước phong lan Phi điệp tím (D anosmum Lindl.) trình luyện ex vitro Nguyễn Thị Mỹ Duyên cs., (2012) nghiên cứu phân loại dựa đặc điểm hình thái tìm ba lồi D pulchellum, D gatton Sunray, D moschatum có mối quan hệ gần mức tương đồng 96,5% 95% Trần Duy Dương, (2015) kết hợp thị hình thái thị phân tử để đánh giá đa dạng di truyền 32 mẫu giống Hoàng thảo địa Việt Nam có lồi có giá trị làm thuốc Hoàng thảo Vảy rắn, Vảy rồng, Hạc vỹ… Ở Việt Nam chưa có cơng trình cơng bố thành phần hóa sinh lan Hồng thảo 1.5.2 Nghiên cứu nhân giống lan Hoàng thảo (Dendrobium) giới 1.5.2.1 Nghiên cứu nhân giống in vitro Trên giới có nhiều tác giả nghiên cứu nhân giống in vitro Dake Zhao et al., (2013) nghiên cứu nhân giống tạo hoa ống nghiệm loài lan D wangliangii Xin Qian et al., (2014) nghiên cứu sản xuất hoa hạt giống loài lan D officinate ống nghiệm tạo calluses từ đỉnh chồi môi trường MS bổ sung 0,2 mg/l BA + 0,05 mg/l αNAA, nhiều chồi tái sinh từ mẫu PLBs cấy môi trường MS + mg/l αNAA Các in vitro cao - cm, có khả hoa cao (83,2%) với tỷ lệ hoa bình thường 73,6% cấy môi trường MS + 15% nước dừa + 0,1 mg/l TDZ tuần Mohammad Musharof Hossain et al., (2013) nghiên cứu nhân giống lan Hạc vỹ cho môi trường Phytamax (Sigma) + mg/l BA giúp cho hạt nảy mầm tốt lúc hệ số nhân protocorm môi trường Phytamax + mg/l BA + mg/l αNAA cao Đối với loài lan D jerdonianum Wight (Sagaya Mary et al., 2016) cho môi trường MS thích hợp cho ni cấy từ hoa, mơi trường KC phù hợp với nuôi cấy từ lá, môi trường VW phù hợp với nuôi cấy từ đốt thân Tapash Kumar Bhowmik et al., (2017) kết luận: môi trường Phytamax (PM) có bổ sung 20 g/l sucro đem lại tỷ lệ hạt nảy mầm loài D palpebra, cao so với gluco fructo Thejaswini et al., (2017) cho nước ép cà chua nước dứa 15% cho tỷ lệ nảy mầm tốt gieo hạt in vitro lan D ovatum (Willd.) Theo Edy Setiti WidaUtami et al., (2017), bổ sung g/l peptone môi trường VW chứng minh hàm lượng thích hợp cho nảy mầm hạt, hình thành chồi với phát triển protocorm Nghiên cứu nuôi cấy cắt lát mỏng tác giả thực số đối tượng: nuôi cấy cắt lát mỏng ngang thân in vitro lan D chrysotoxum (chiều dày mm) Saranjeet Kaur, (2017); Paromik Bhattacharyya et al., (2018) nhân giống lan D aphyllum từ lớp tế bào lát mỏng cắt ngang (t-TCL); Parthibhan et al., (2018) nghiên cứu tái sinh phơi soma hình thành từ lớp tế bào lát mỏng cắt ngang (tTCL) lan D aqueum Lindley Ở Việt Nam, Nguyễn Thanh Tùng cs., (2010) nghiên cứu lát cắt mỏng đoạn thân theo chiều ngang chồi in vitro lan Hoàng thảo thân gãy (D aduncum), số nghiên cứu nhân giống từ hạt in vitro tiến hành D nobile Lindl (Vũ Ngọc Lan cs., 2013), D officinale (Nguyễn Thị Sơn cs., 2014), D lituiflorum Lindley (Nguyễn Văn Việt, (2017), D transparens (La Việt Hồng cs., 2017), D officinale (Lê Thị Diễm Võ Thị Bạch Mai, 2017),… 1.5.2.2 Nghiên cứu tạo hạt giống nhân tạo hoa lan Các nghiên cứu tạo hạt giống nhân tạo hoa lan chủ yếu sử dụng protocorm (Bunnag et al., 2010; Zhang et al., 2011; Mohanty et al., 2013; Bustam Suryanti et al., 2013; Sukhumpinij et al., 2015) từ PLBs (Nhut cs., 2005; 2007; Trần Thị Ngọc Lan, 2013) 1.5.2.3 Nghiên cứu sinh trưởng phát triển từ hạt nhân tạo có khơng qua bảo quản Sử dụng kỹ thuật RAPD để đánh giá đặc tính di truyền lồi Cineraria maritana, Srivastava et al., (2009) kết luận khơng có khác biệt di truyền gieo hạt không bảo quản từ hạt bảo quản tháng Kết tương tự Mishra et al., (2011) ghi nhận Picrorhiza kurrooa (bảo quản tháng); Mohanty et al., (2013) D densiflorum (bảo quản 60 ngày) 1.5.2.4 Các nghiên cứu ni trồng lan Hồng thảo Mohammad Musharof Hossain et al., (2013) cho giá thể thích hợp trồng D aphyllum hỗn hợp mảnh gạch, than, xơ dừa chất khoáng (1: 1: 0,5: 0,5) Winarto et al., (2015) khuyến cáo với D ‘Zahra FR 62’ D ‘Gradita 31’: trồng giá thể Cycas rumphii tháng, sau chuyển sang giá thể than : C rumphii (1:1), giảm cường độ ánh sáng (100-150 μmol⋅m-2⋅s-1) cách che lưới 50% với độ ẩm tương đối 85 - 95% Tỷ lệ sống đạt 90 -100% Theo Selvaraju Parthibhan et al., (2015), trồng D aqueum Lindley giá thể mảnh gạch than củi (1:1), để rêu bầu chụp túi polyethylene giữ ẩm, tỷ lệ sống cao Abdul Aziz Mirani et al., (2017) nghiên cứu loài lan D nobile, kết luận: cấy môi trường MS + mg/l αNAA, sau đem trồng giá thể hỗn hợp than bùn xừa: cát: đá trân châu (1,0: 1,0: 0,2) cho tỉ lệ sống 100% sau 120 ngày Bên cạnh phân bón, số chế phẩm sinh học chất kích thích sinh trưởng sử dụng để kích thích sinh trưởng, phát triển lan Dendrobium Với loài lan D cv sonia -17 trồng nhà kính, Bhatt et al., (2012) cho phun GA3 nồng độ 15 mg/l, số lượng chồi, chiều dài chồi số lượng hoa đạt tối đa cây, BA với nồng độ 15 mg/l lại có tác dụng làm tăng số lượng lá/cây tháng thứ thứ hai… Ở Việt nam, nghiên cứu chăm sóc ni trồng lan Hồng thảo sau ống nghiệm hạn chế Phạm Thị Liên cs., (2010) đề xuất quy trình trồng số giống lan Hoàng thảo (Dendrobium) miền Bắc với giá thể than củi + xơ dừa tỷ lệ 1:1, sử dụng phân bón tan chậm N:P:K tỷ lệ 20:20:20 phân bón Grow more Vũ Ngọc Lan (2012) xác định giá thể phù hợp trồng loài D.nobile D.chrysanthum bột xơ dừa, phun chế phẩm dinh dưỡng Komix ml/l, - 10 ngày/lần sau đưa in vitro vườn ươm tháng Hồng Xn Lam (2014) cho thời vụ ngơi tháng 4, giá thể than + xỉ bọt núi lửa + rong biển (2:2:1); sử dụng phân bón Growmore (N:P:K = 30:10:10) chất điều tiết sinh trưởng Atonik 1,8 SL (0,1%) có tác dụng tốt đến sinh trưởng, phát triển lan D cherry red Nguyễn Thế Cường cs., (2018) cho trồng mật độ 44 cây/m2 sử dụng phân bón Growmore có tác dụng tốt đến sinh trưởng phát triển lan D officinale CHƯƠNG VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu - Mẫu giống sử dụng đánh giá đặc điểm hình thái, vi phẫu phân tích thành phần hóa sinh mẫu lan Nghệ tâm (D loddigesii) thu thập Định Hóa - Thái Nguyên Hạc vỹ (D aphyllum) thu thập Hòn Bà - Khánh Hòa - Vật liệu nuôi cấy mô chồi mẫu lan Nghệ tâm mẫu Hạc vỹ có chiều cao - 10 cm - Vật liệu tạo phôi sinh dưỡng: Các PLBs (protocorm like bodies) tạo thành sau tuần, hình thành từ ni cấy đỉnh sinh trưởng Sau tuần nuôi cấy, PLBs đồng cắt với kích thước - mm để làm nguyên liệu tạo hạt nhân tạo - Giai đoạn vườn ươm: Cây in vitro nhân giống từ hạt nhân tạo: đạt chiều cao - cm, có - - rễ - Giai đoạn vườn sản xuất: Cây có chiều cao -7 cm, - lá/cây, - rễ - Dịch chiết hữu từ loại củ quả: Cà chua, tảo, bí ngơ… - Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân nhanh in vitro: saccaroza, than hoạt tính - Các giá thể: Rêu, vỏ thông đỏ, xơ dừa sợi, đá bọt núi lửa dớn bảng - Các chế phẩm dinh dưỡng: Orchid Focus grow, Seaweed (Rong biển) 95%, Đầu trâu 502, B1 Thái Lan, Growmore - Chất kích thích sinh trưởng Superthrive 2.2 Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu đặc điểm sinh học hai loài lan Nghệ tâm (D loddigesii) Hạc vỹ (D aphyllum) 11 - Thí nghiệm 23: Nghiên cứu xác định giá thể cho giai đoạn vườn sản xuất - Thí nghiệm 24: Nghiên cứu chế độ dinh dưỡng cho giai đoạn vườn sản suất - Thí nghiệm 25: Nghiên cứu bổ sung Superthrive cho giai đoạn vườn sản xuất Các tiêu theo dõi: + Các tiêu rễ: - Số rễ (rễ/cây), chiều dài rễ (cm) Chỉ tiêu giải phẫu: Kích thước vỏ, kích thước trụ, số bó dẫn kích thước bó dẫn… - Các tiêu giải phẫu: Dày hậu mô, số lượng bó dẫn, tỷ lệ bó to/bó nhỏ, kích thước bó + Các tiêu lá: - Hình dạng lá: thn dài, hình lưỡi, hình mác, chiều dài (cm), chiều rộng (cm) - Chỉ tiêu vi phẫu: Kích thước biểu bì, mơ đồng hóa, số bó dẫn kích thước bó + Các tiêu hoa: - Đường kính hoa (cm), chiều dài cành hoa (cm), kích thước cánh hoa (cm): đo chiều dài, chiều rộng cánh đài, cánh tràng cánh môi, - Chỉ tiêu vi phẫu: bao phấn,… + Các tiêu theo dõi nuôi cấy in vitro tạo hạt nhân tạo Tỷ lệ mẫu nhiễm (%), Tỷ lệ sống (%), Số PLBs/tTCL (PLBs), tỷ lệ tạo PLBs (%), Tỷ lệ mẫu tạo protocorm (%), Hệ số nhân protocorm (lần), Chiều cao chồi (cm); số lá/chồi (lá), tỷ lệ hạt nảy mầm (%), số chồi/hạt (chồi), chiều dài chồi (mm), tỷ lệ hạt rễ (%), số rễ/chồi (rễ) + Các tiêu sinh trưởng phát triển (giai đoạn vườn ươm vườn sản xuất) - Tỷ lệ sống (%), chiều cao (cm), đường kính thân (cm), số lá/cây (lá), chiều dài (cm), chiều rộng (cm), số nhánh/cây, số rễ trung bình/cây (rễ) 2.4 Điều kiện thí nghiệm Địa điểm thời gian nghiên cứu - Nghiên cứu đặc điểm hình thái mẫu lan Hoàng thảo thực Trung tâm Sinh học Thực nghiệm, Viện Ứng dụng Công nghệ, năm 2013 - 2014 - Nghiên cứu cấu tạo vi phẫu thực tại: Phòng thí nghiệm Bộ 12 môn Thực Vật - Khoa Nông học - Học Viện Nông nghiệp Việt Nam, năm 2014 - 2015 - Thí nghiệm nghiên cứu khảo sát số thành phần hóa sinh chủ yếu có hai lồi lan: Nghệ tâm Hạc vỹ thực tại: Khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dược Liệu, Bộ Y tế, năm 2013 - 2014 - Các thí nghiệm nhân giống, tạo hạt nhân tạo, nuôi trồng thực phòng ni cấy mơ tế bào thực vật nhà lưới Trung tâm Sinh học Thực nghiệm - Viện Ứng dụng Công nghệ - Bộ Khoa học Công nghệ, năm 2013 - 2017 Điều kiện nuôi cấy - Nhiệt độ phòng 25 ± 20C, ẩm độ 60 - 70%, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, cường độ ánh sáng 1.500 - 2.300 lux Điều kiện trồng chăm sóc - Nhà lưới có mái che mưa che lưới đen, độ che sáng > 70%, có nhiệt độ 25 ± 20C, độ ẩm khơng khí 70 - 80%, tưới phun sương lần/ngày - Phòng trừ bệnh hại: phun định kỳ 10 ngày/lần Antracol 70WP nồng độ 0,1% 2.5 Phương pháp xử lý số liệu Sử dụng phương pháp thống kê sinh học để phân tích số liệu thí nghiệm phần mềm (Excel, IRRISTAT 5.0) CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đặc điểm sinh học lan Nghệ tâm (D loddigesii) Hạc vỹ (D aphyllum) 3.1.1 Đặc điểm hình thái học lan Nghệ tâm Hạc vỹ Rễ hai lồi Nghệ tâm Hạc vỹ có đặc điểm chung rễ chùm, khí sinh, mảnh, hình trụ, màu xanh chuyển thành nâu già, rễ thường ôm lấy giá thể buông thõng xuống, khả tái sinh mạnh, hút nước dinh dưỡng tốt Thân hai loài Nghệ tâm Hạc vỹ thuộc loại đa thân, dài, có nhiều đốt, đốt mầm ngủ Lan Nghệ tâm có thân mềm, mảnh, hình trụ, rủ xuống, dài 40,2 cm, đường kính 0,50 cm; thân lan Hạc vỹ hình trụ, thn, thõng xuống, dài 70,4 cm, đường kính 0,8 cm Lan Nghệ tâm có hình lưỡi, hình mũi mác thn dài, chóp nhọn, màu xanh đậm, phiến dày, cứng, dài 5,0 cm, rộng 1,5 cm, có 17 Hạc vỹ có hình mác nhọn, trơng giống da, mép nhẵn Lá màu xanh nhạt, phiến mỏng, mềm, chiều dài 7,62 cm, rộng 3,1 có 32 13 Lan Nghệ tâm có hoa mọc đơn, - hoa thân mang lá, hoa màu trắng ánh tím, trung tâm màu nghệ vàng Cuống hoa dài 0,4 - 0,8 cm, màu xanh nhạt Bao hoa có phiến dạng màng, có màu trắng ánh tím nhạt Đường kính hoa 5,2 cm Cánh đài có dạng thn, chóp tù; cánh đài bên dài 2,5 cm, rộng 0,7 cm Cánh tràng hình bầu dục, đỉnh tròn, dài 1,7 cm, rộng cm Cánh mơi viền ngồi trắng, phần màu vàng nghệ, gốc màu trắng, hình gần tròn, mép lượn sóng có tua rua màu trắng, dài 1,9 cm, rộng 3,1 cm Hoa có mùi thơm nở vào tháng - hoa bền từ 30 - 35 ngày Lan Hạc vỹ có hoa mọc thành cụm - hoa, mọc suốt chiều dài thân khơng Cuống hoa dài 0,2 - 0,6 cm, màu tím nhạt Đường kính hoa 4,8 cm Hoa màu trắng sọc tím với trung tâm màu tím đậm Bao hoa có phiến dạng màng, màu trắng ánh tím nhạt Ba cánh đài kích thước gần tương tự nhau: cánh đài bên dài 3,6 cm, rộng 0,9 cm Cánh tràng thuôn, đỉnh nhọn, dài 3,4 cm, rộng 1,1 cm Cánh mơi hình gần tròn, mép có tua; dài 3,7 cm, rộng 3,6 cm Hoa nở vào tháng - hoa bền từ 27 - 30 ngày 3.1.2 Cấu tạo vi phẫu hai loài lan Nghệ tâm Hạc vỹ Rễ hai lồi lan có kích thước đường kính rễ, vỏ trong, vỏ ngồi, ngoại bì, nội bì sai khác khơng nhiều Điểm khác biệt lớn cấu tạo vi phẫu rễ hai lồi số lượng bó dẫn Số lượng bó gỗ (libe) rễ Nghệ tâm từ đến bó rễ Hạc vỹ từ đến bó Điều liên quan đến khả dẫn truyền nước cây, Hạc vỹ có khả chịu khơ hạn tốt Nghệ tâm Vì vậy, lan Nghệ tâm cần độ ẩm cao tưới nước nhiều Hạc vỹ có kích thước thân lớn gấp 1,12 lần số lượng bó dẫn nhiều gấp 1,5 lần Nghệ tâm Ở Hạc vỹ, bó dẫn nằm sát biểu bì; Nghệ tâm, bó dẫn tập trung phần thân, kích thước bó dẫn lớn hai lồi tương tự Đặc điểm vi phẫu cho thấy thân Hạc vỹ có khả nâng đỡ chống chịu tốt so với Nghệ tâm Vì vậy, trồng lồi Nghệ tâm ngồi vườn sản xuất cần có giá chống đỡ như: dùng que buộc thân lại trồngtrên giàn, trồng chậu nên treo lên,… Lá Hạc vỹ mỏng, mềm, phiến rộng Ngược lại, Nghệ tâm có phiến dày, cứng bề rộng phiến hẹp nhiều so với Hạc vỹ Nghệ tâm có phiến dày gấp 2,5 lần phiến Hạc vỹ, mơ đồng hóa dày gấp 2,78 lần mơ đồng hóa Hạc vỹ Tuy nhiên, kích thước bó dẫn gân hai lồi tương tự 14 Lan Nghệ tâm có hoa mọc đơn thân mang lá, màu trắng ánh tím, với trung tâm màu vàng nghệ Bao hoa có phiến dạng màng, màu trắng ánh tím nhạt Cánh đài có dạng thn, chóp tù; cánh đài bên dài 2,2 2,5 cm, rộng 0,7 cm, lớn cánh đài đối diện cánh môi (dài 1,6 - 1,9 cm, rộng 0,7 - 0,8 cm) Cánh tràng hình bầu dục, đỉnh tròn, dài 1,6 - 1,7 cm, rộng 0,8 - cm Cánh mơi viền ngồi trắng, phần màu vàng nghệ, gốc màu trắng, hình gần tròn, mép lượn sóng có tua rua màu trắng, dài 1,7 - 1,9 cm, rộng 2,1 - 3,1 cm, chia thùy Các thùy gốc tù, thùy bao rộng; miền có lơng nhung họng; gốc màu vàng nghệ Cánh mơi dính với cột nhị - nhụy gốc Trục nhị nhụy ngắn, có dạng nửa hình trụ, dài 0,7 - 0,8 cm Bầu nhụy ô, dài 3,1 - 3,5 cm, màu xanh nhạt Bao phấn ngọn, có nắp tạo thành mũ nhọn, gồm ô phấn với khối phấn xếp đơi Hạc vỹ có hoa mọc đơn độc thành cụm - hoa, thân già khơng lá, hoa màu trắng sọc tím với trung tâm màu tím đậm Ba cánh đài kích thước gần tương tự nhau: cánh đài bên dài 2,7- 3,6 cm, rộng 0,7 0,9 cm; cánh đài đối diện cánh môi dài 2,5 - 3,1 cm, rộng 0,6 - 0,7 cm Cánh tràng thuôn, đỉnh nhọn, dài 2,7 - 3,4 cm, rộng - 1,1 cm Cánh mơi hình gần tròn, mép có tua; dài 3,1 - 3,7 cm, rộng - 3,6 cm; chia thùy rõ rệt: hai thùy bên có gân sọc tím đậm rõ; thùy màu trắng ngà, có gân trắng rõ giữa, có lơng nhung bao phủ hai mặt Các thùy gốc tù, thùy bao rộng Cánh mơi dính với cột nhị - nhụy gốc Trục nhị nhụy ngắn, có dạng nửa hình trụ, dài 0,9 - 1,3 cm Bầu nhụy ô, dài 2,4 - 3,1 cm, màu tím nhạt Bao phấn ngọn, có nắp tạo thành mũ nhọn, gồm ô phấn với khối phấn xếp đôi 3.1.3 Một số thành phần hóa sinh lan Nghệ tâm Hạc vỹ Kết phân tích bảng 3.6 cho thấy: Hàm lượng alkaloids tồn phần hai loài giống nhau, chiếm 0,35%; hàm lượng flavonoids toàn phần tương đối thấp (0,92% lan Nghệ tâm 0,56% lan Hạc vỹ) Hàm lượng polysaccharides toàn phần: lan Nghệ tâm có hàm lượng polysaccharides tồn phần đạt 1,42% lan Hạc vỹ 4,2%, cao nhiều so với flavonoids alkaloids Hàm lượng protein, Ca, Mg Fe lan Nghệ tâm Hạc vỹ không chênh nhiều với giá trị 6%, 12030 mg/kg, 1726 mg/kg, 168 mg/kg (lan Nghệ tâm) 6,6%, 14821 mg/kg, 2829 mg/kg, 134 mg/kg (lan Hạc vỹ) Bảng 3.6 Kết định lượng số thành phần hóa sinh có hai lồi lan Nghệ tâm Hạc vỹ (Viện Dược liệu, 2013 - 2014) 15 TT Nhóm chất Hàm lượng Alkaloid toàn phần (%) Hàm lượng Flavonoid toàn phần (%) Hàm lượng Polysaccharid toàn phần (%) Hàm lượng Protein (%) Hàm lượng Ca(mg/kg) Hàm lượng Mg(mg/kg) Hàm lượng Fe(mg/kg) Nghệ tâm Hạc vỹ (D loddigesii) (D aphyllum) 0,35 0,35 0,92 0,56 1,42 4,2 6,0 6,6 12030 14821 1726 2829 168 134 3.2 Nghiên cứu biện pháp kỹ thuật nhân giống in vitro, tạo hạt giống nhân tạo nhân giống in vitro từ hạt nhân tạo sau bảo quản hai loài lan Nghệ tâm Hạc vỹ 3.2.1 Xác định chất khử trùng thời gian khử trùng mẫu nuôi cấy Sử dụng NaOCl nồng độ 3% 15 phút 1‰ cefotaxime, tỷ lệ mẫu sống vô trùng sau tuần đạt cao (79,9% với Nghệ tâm; 86% với Hạc vỹ) 3.2.2 Nghiên cứu tạo vật liệu protocorm like bodies (PLBs) từ lát mỏng tế bào nằm ngang (tTCL) 3.2.2.1 Ảnh hưởng BA đến khả tạo PLBs từ lát mỏng tế bào nằm ngang (tTCL) Trên môi trường VW + 20 g/l sucrose + 10% nước dừa + g/l agar bổ sung 1,5 mg/l BA cho kết tốt số lượng PLBs hình thành tỷ lệ tTCL phát sinh PLBs (30,1 PLBs/tTCL; tỷ lệ tTCL phát sinh PLBs 52% với lan Nghệ tâm 28,7 PLBs/tTCL, tỷ lệ tTCL phát sinh PLBs 49,2% với lan Hạc vỹ sau tuần nuôi cấy) 3.2.2.2 Ảnh hưởng tổ hợp (BA + αNAA) lên khả tạo PLBs từ lát mỏng tế bào nằm ngang (tTCL) Bảng 3.10 Ảnh hưởng tổ hợp (BA + αNAA) lên khả tạo PLBs từ tTCL (6 tuần nuôi cấy) Chất kích thích sinh Tỷ lệ mẫu tạo PLBs Số PLBs/tTCL trưởng (mg/l) (%) BA αNAA NT HV NT HV 30,40 17,83 1,5 0(Đ/C) 52, 03 30,12 1,5 0,5 38,0 21,00 49,22 28,71 1,5 1,0 31,0 38,30 19,00 20,70 1,5 1,5 21,9 19,96 12,80 12,30 16 1,5 2,0 CV (%) LSD0,05 16,0 3,1 7,6 14,80 4,3 1,93 7,00 3,3 0,4 7,45 3,6 0,19 Kết bảng 3.10 cho thấy: Đối với loài lan Nghệ tâm việc bổ sung αNAA kết hợp BA vào môi trường không làm tăng tỷ lệ tTCL phát sinh PLBs số PLBs hình thành từ tTCL so với môi trường VW bổ sung BA Với lan Hạc vỹ bổ sung 1,5 mg/l BA kết hợp với 0,5 mg/l αNAA tốt đạt 49,22% mẫu tạo thành PLBs số lượng PLBs tái sinh từ lát cắt mỏng tế bào 28,71, PLBs to có màu xanh, có lơng hút nhiều 3.2.3 Tái sinh chồi từ protocorm like bodies (PLBs) 3.2.3.1 Ảnh hưởng tổ hợp (BA + IBA) đến khả tái sinh chồi từ PLBs Bổ sung BA+ IBA vào môi trường nuôi cấy thúc đẩy trình hình thành chồi từ cụm PLBs sau tuần nuôi cấy Tổ hợp 1,5 mg/l BA + 0,5 mg/l IBA có tỷ lệ tái sinh chồi chiều cao chồi cao (6,8 chồi/mẫu, chồi cao 2,86 cm với lan Nghệ tâm; 6,9 chồi/mẫu, chồi cao 2,9 cm với lan Hạc vỹ) 3.2.3.2 Ảnh hưởng dịch nghiền bí ngô đến khả tái sinh chồi từ PLBs Bổ sung dịch nghiền bí ngơ làm tăng số chồi tái sinh từ PLBs rõ rệt Trên môi trường VW + 20 g/l sucrose + 10% nước dừa + g/l agar +1 g/l than hoạt tính + g/l peptone+ 1,5 mg/l BA + 0,5 mg/l IBA + 30 g/l dịch nghiền bí ngơ, sau tuần ni cấy, tỷ lệ chồi tái sinh đạt 10,6 chồi/mẫu, chiều cao chồi đạt 4,2 cm (với lan Nghệ tâm) 11,6 chồi/mẫu, chiều cao chồi đạt 4,43 cm (với lan Hạc vỹ) Tuy nhiên, bổ sung nồng độ cao 30 g/l số chồi chồi có xu hướng giảm 3.2.3.3 Ảnh hưởng bột tảo Spirulina đến khả tái sinh chồi từ PLBs Số liệu bảng 3.13 cho thấy: Bổ sung g/l tảo Spirulina vào môi trường VW + 20 g/l sucrose + 10% nước dừa + g/l agar + g/l than hoạt tính + g/l peptone + 1,5 mg/l BA + 0,5 mg/l IBA + 30 g/l dịch nghiền bí ngơ, pH 5,5 đem lại kết tốt cho tái sinh chồi từ PLBs Bảng 3.13 Ảnh hưởng bột tảo Spirulina lên khả tái sinh chồi từ PLBs (sau tuần nuôi cấy) Chiều cao Dịch Tảo Số chồi/mẫu chồi (cm) nghiền bí Spirulina Chất lượng chồi ngơ (g/l) (g/l) NT HV NT HV 17 30 0,0 (Đ/C) 10,59 11,60 4,20 4,34 30 16,82 17,10 6,14 6,22 30 14,50 14,60 5,00 5,10 30 11,24 11,30 4,50 4,46 3,6 2,16 3,0 1,02 2,9 1,42 3,3 0,41 CV (%) LSD0,05 Chồi to, khỏe, màu xanh đặc trưng Chồi to, khỏe, màu xanh bóng Chồi to, khỏe, màu xanh đặc trưng Chồi nhỏ, bé màu xanh nhạt 3.2.4 Nghiên cứu tạo in vitro hoàn chỉnh Trong bước tạo in vitro hoàn chỉnh, bổ sung IBA PAA nồng độ khác vào môi trường VW + 20 g/l sucrose + 10% nước dừa + g/l agar + g/l THT, kết thể bảng 3.14 bảng 3.15 Với lan Nghệ tâm, bổ sung mg/l IBA làm tăng sinh trưởng rõ rệt, sau tuần nuôi cấy, cao 6,5 cm với 5,3 lá/cây, 7,3 rễ/cây; chiều dài rễ 2,87 cm, rễ dài mập (bảng 3.14) Còn với lan Hạc vỹ (bảng 3.15), bổ sung 0,5 mg/l PAA cho kết tốt nhất, sau tuần nuôi cấy cao 6,96 cm, 5,7 lá/cây, 7,4 rễ/cây; rễ dài 3,02 cm vượt trội so với bổ sung mg/l IBA không lớn Bảng 3.14 Ảnh hưởng IBA đến khả tạo rễ chồi lan in vitro (sau tuần nuôi cấy) Nồng độ IBA (mg/l) 0,0 (Đ/C) 0,5 1,0 1,5 2,0 CV (%) LSD0,05 Chiều cao (cm) NT 3,50 5,30 6,50 5,00 4,60 3,3 0,93 HV 3,52 5,38 6,80 5,72 5,35 3,0 0,39 Số (lá) NT 3,00 4,20 5,30 4,08 4,00 4,1 0,6 HV 3,00 4,50 5,40 4,10 3,90 3,0 0,38 Số rễ (rễ) NT 2,50 6,20 7,30 4,90 3,70 3,7 0,32 HV 2,50 6,00 7,00 5,10 4,10 3,8 0,53 Chiều dài rễ (cm) NT 1,12 2,13 2,87 1,92 1,26 3,9 0,74 HV 1,14 2,24 2,80 1,86 1,24 3,8 0,16 Bảng 3.15 Ảnh hưởng PAA đến khả tạo rễ chồi lan in vitro (sau tuần nuôi cấy) Nồng độ Chiều cao Chiều dài rễ Số (lá) Số rễ (rễ) PAA (cm) (cm) (mg/l) NT HV NT HV NT HV NT HV 18 0,0 (Đ/C) 3,53 3,52 3,00 3,00 2,50 2,50 1,10 1,15 0,5 6,16 6,96 5,18 5,7 6,50 7,40 2,46 3,02 1,0 5,42 5,50 5,46 5,1 5,40 5,90 2,00 2,20 1,5 5,10 5,22 5,08 4,8 4,50 5,20 1,30 1,60 2,0 4,20 4,60 5,02 4,2 3,60 4,50 0,92 1,03 CV (%) 3,3 3,3 4,5 3,1 4,0 3,2 2,7 3,1 LSD0,05 0,79 0,31 0,35 0,42 0,34 0,46 0,91 0,19 3.2.5 Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo 3.2.5.1 Ảnh hưởng nồng độ sodium alginate (%) CaCl2.2H2O (mM) đến khả tạo hạt nảy mầm hạt nhân tạo Cho dung dịch sodium alginate nồng độ 3% có chứa PLBs vào dung dịch CaCl2.2H2O 100; 125 mM nồng độ 4% vào dung dịch CaCl2.2H2O 100 mM có tác dụng tốt đến hình thành hạt nhân tạo cho lan Nghệ tâm Hạc vỹ Tuy nhiên, sodium alginate nồng độ 3% đem lại tỷ lệ nảy mầm hạt nhân tạo cao (92% lan Nghệ tâm; 95,2% lan Hạc vỹ) 3.2.5.2 Ảnh hưởng thời gian tiếp xúc với dung dịch 100 mM CaCl2.2H2O đến khả tạo hạt, nảy mầm khả sinh trưởng hạt nhân tạo Cho dung dịch sodium alginate 3% tiếp xúc với dung dịch CaCl2.2H2O 100 mM 30 phút, tỷ lệ hạt nảy mầm đạt cao với lan Nghệ tâm Hạc vỹ 3.2.5.3 Ảnh hưởng BA, tổ hợp (BA + IBA) đến khả nảy mầm sinh trưởng hạt nhân tạo Tổ hợp mg/l BA + 0,5 mg/l IBA đem lại tỷ lệ hạt nảy mầm, tỷ lệ rễ, số rễ/hạt, số chồi/hạt, chiều cao chồi cao (các giá trị tương ứng 96%; 88%; 4,1 rễ/hạt; 7,6 chồi/hạt; 13 mm với lan Nghệ tâm 98%; 88%; rễ/hạt; chồi/hạt; 14,2 mm với lan Hạc vỹ) 3.2.6 Nghiên cứu kỹ thuật bảo quản hạt nhân tạo 3.2.6.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến thời gian bảo quản hạt nhân tạo Bảo quản hạt nhân tạo 4°C, tỷ lệ nảy mầm hạt cao (68% với lan Nghệ tâm; 71,2% với lan Hạc vỹ), tiêu chiều cao chồi, tỷ lệ rễ, số rễ/hạt trội sau 16 tuần (tương ứng 4,15 mm, 68,2% 2,6 rễ với lan Nghệ tâm; mm, 70% rễ lan Hạc vỹ) 3.2.6.2 Ảnh hưởng ABA đến thời gian bảo quản hạt nhân tạo 19 Bổ sung ABA nồng độ 20 mg/l cho tỷ lệ nảy mầm hạt nhân tạo cao (51,1% với lan Nghệ tâm; 50,02% với lan Hạc vỹ sau 24 tuần bảo quản) Thời gian bảo quản tăng, tỷ lệ hạt giống nảy mầm giảm dần 3.2.6.3 Ảnh hưởng natri benzoat, topsin-M carbendazim đến khả sống sót hạt nhân tạo sau thời gian bảo quản Trong loại hóa chất bảo quản trộn lẫn vào hỗn hợp màng nhân tạo, carbendazim nồng độ 3000 mg/l có tác dụng tốt natri benzoat topsinM Ở nồng độ 3000 mg/l carbendazim, tỷ lệ nhiễm giảm rõ rệt tỷ lệ nảy mầm hạt đạt cao (68,2% lan Nghệ tâm; 70,2% lan Hạc vỹ sau 24 tuần theo dõi).Tuy nhiên nồng độ carbendazim thấp (0 2000 mg/l) tỷ lệ nhiễm hạt nhân tạo cao cao (4000 mg/l) tỷ lệ mẫu chết tăng tỷ lệ nảy mầm thấp 3.2.7 Nghiên cứu khả nhân giống in vitro hạt nhân tạo sau bảo quản 3.2.7.1 Ảnh hưởng tổ hợp (BA + PAA) đến trình nhân nhanh protocorm chồi hạt nhân tạo sau q trình bảo quản Mơi trường VW bổ sung 1,5 mg/l BA + 0,5 mg/l PAA thích hợp cho trình nhân giống hạt nhân tạo Sau tuần nuôi cấy, hệ số nhân protocorm, số chồi, chiều cao chồi cao môi trường nuôi cấy khác (các giá trị 8,5 protocorm; 7,5 chồi, 4,5 cm chiều cao với lan Nghệ tâm 8,3 protocorm; 7,1 chồi; 4,3 cm chiều cao với lan Hạc vỹ) Chồi mập, khỏe, màu xanh biếc, cứng cáp so với tổ hợp mức nồng độ khác 3.2.7.2 Ảnh hưởng dịch nghiền cà chua đến trình nhân nhanh protocorm chồi sau bảo quản Kết bảng 3.26 cho thấy: Tổ hợp chất điều tiết sinh trưởng 1,5 mg/l BA + 0,5 mg/l PAA có bổ sung dịch nghiền cà chua với hàm lượng từ 10 g/l đến 100 g/l môi trường VW + 20 g/l sucrose + g/l agar + 10% nước dừa + 1g/l than hoạt tính, pH 5,5 có tác dụng tốt đến khả nhân protocorm chồi sau bảo quản, hàm lượng 70 g/l dịch nghiền cà chua cho kết tốt nhất, tiêu hệ số nhân protocorm, hệ số nhân chồi cao đáng kể so với công thức khác, chất lượng chồi nằm nhóm tốt hai loại lan nghiên cứu Nghệ tâm Hạc vỹ Bảng 3.26 Ảnh hưởng dịch nghiền cà chua đến khả nhân nhanh protocorm chồi hạt nhân tạo sau q trình bảo quản (sau tuần ni cấy) 20 Dịch nghiền cà chua (g/l) 0,0 (Đ/C) 10 30 50 70 100 CV (%) LSD0,05 Hệ số nhân Hệ số nhân protocorm (lần) chồi (lần) NT HV NT HV 8,50 8,40 7,40 7,20 9,50 9,80 7,90 9,40 10,20 10,10 8,10 10,10 10,40 11,20 10,90 10,50 12,80 16,60 12,30 12,90 9,70 10,60 11,10 12,00 3,8 3,0 3,7 3,0 1,04 1,00 0,34 0,33 Chiều cao chồi (cm) NT HV 4,40 4,30 4,70 4,60 4,90 4,80 5,20 5,30 5,40 5,60 3,20 3,30 3,0 3,0 0,67 1,16 Chất lượng chồi +++ +++ +++ ++++ ++++ +++ Ghi chú: Nền môi trường (VW + 20 g/l sucrose + g/l agar + 10% nước dừa + g/l THT) + + + + Chồi to, cứng, màu xanh bóng, +++ Chồi to, màu xanh đặc trưng, ++ Chồi nhỏ, nhỏ, màu xanh nhạt, + Chồi nhỏ, nhỏ, màu vàng nhạt 3.2.8 Nghiên cứu tạo in vitro hoàn chỉnh từ hạt hạt nhân tạo sau bảo quản Bổ sung 0,5 mg/l PAA vào môi trường (VW + 20 g/l sucrose + g/l agar + 10% nước dừa + g/l THT, pH 5,5) có tác dụng tốt đến rễ trước đưa vườn ươm 3.3 Nghiên cứu kỹ thuật chăm sóc lan Nghệ tâm (D loddigesii) Hạc vỹ (D aphyllum) in vitro giai đoạn vườn ươm 3.3.1 So sánh sinh trưởng nhân giống in vitro truyền thống nhân giống in vitro từ hạt nhân tạo sau bảo quản Chiều cao hạt nhân tạo thấp so với nhân giống in vitro truyền thống có ý nghĩa mức 5% (6,63 cm so với 7,1 cm với lan Nghệ tâm 6,58 cm so với cm với lan Hạc vỹ sau 12 tuần trồng) Các tiêu số số rễ tạo hai loại khơng có khác đáng kể Đáng ý tất đặc trưng hình thái hình dạng lá, màu sắc lá, màu sắc rễ,…giữa hai loại nhân từ hai nguồn thực liệu khác hoàn toàn giống nhau, chứng tỏ tính ổn định di truyền cao 3.4.2 Nghiên cứu xác định thời vụ in vitro giai đoạn vườn ươm Bảng 3.29 Ảnh hưởng thời vụ đến tỷ lệ sống khả sinh trưởng in vitro giai đoạn vườn ươm (12 tuần trồng) 21 Thời vụ Tỷ lệ sống (%) NT HV Chiều cao (cm) NT HV Số (lá) NT HV Số rễ (rễ) NT HV Vụ Thu 78,00 83,00 7,15 7,06 6,30 6,80 3,50 3,46 (18/8/2016) Vụ Đông 62,00 60,00 5,60 5,48 5,60 5,53 2,20 2,10 (18/11/2016) Vụ Xuân 72,0 74,0 6,42 6,54 5,80 6,10 2,73 2,50 (18/02/2017) Vụ Hè 76,00 75,0 6,86 6,70 6,03 6,23 3,00 2,80 (18/5/2017) 4,4 3,9 4,8 4,6 3,7 3,8 CV (%) 0,24 0,22 0,15 0,19 0,24 0,24 LSD0,05 Nhận xét rút từ bảng 3.29: vào vụ thu đạt tỷ lệ sống cao (78% với lan Nghệ tâm; 83% với lan Hạc vỹ) đồng thời tiêu sinh trưởng chủ yếu chiều cao cây, số vượt trội so với thời vụ khác (các giá trị 7,15 cm; 6,3 lá; 3,5 rễ với lan Nghệ tâm 7,06 cm; 6,8 lá; 3,46 rễ với lan Hạc vỹ) 3.3.3 Nghiên cứu xác định giá thể cho in vitro giai đoạn vườn ươm Với lan Nghệ tâm, giá thể rêu + đá bọt (50:50) cho tỷ lệ sống cao (94%), chiều cao (7,8 cm), số (7,20 lá) số rễ (3,9 rễ) vượt trội loại giá thể khác với lan Hạc vỹ, giá thể phù hợp rêu + xơ dừa (70:30); tiêu tỷ lệ sống (92%); chiều cao (7,88 cm); số (7,48 lá) số rễ (4,5) cao hẳn giá thể khác 3.3.4 Nghiên cứu bổ sung chế phẩm dinh dưỡng cho in vitro giai đoạn vườn ươm Ở thời kỳ vườn ươm, sử dụng chế phẩm B1 - Thái Lan phun lên 1tuần/lần với liều lượng 2ml/l có tác dụng thúc đẩy sinh trưởng hai loài lan Nghệ tâm Hạc vỹ, tốt chế phẩm khác Growmore, Đầu trâu 502), xanh khỏe có rễ mập dài (bảng 3.31) Bảng 3.31 Ảnh hưởng số loại chế phẩm dinh dưỡng khác đến khả sinh trưởng in vitro giai đoạn vườn ươm (12 tuần trồng) Chiều cao Số (lá) Số rễ (rễ) Loại phân bón cây(cm) NT HV NT HV NT HV 22 Nước lã (Đ/C) B1- Thái Lan Growmore Mỹ (30:10:10) Ðầu trâu 502 (30:12:10) CV (%) LSD0,05 6,00 9,10 6,50 8,76 5,79 7,93 5,51 8,13 1,93 4,60 1,83 5,30 8,30 8,20 7,48 7,82 4,10 4,80 7,30 7,24 6,62 6,79 3,40 3,33 4,6 0,23 4,7 0,29 4,5 0,33 4,6 0,42 4,4 0,29 4,6 0,26 Ghi chú: Lan Nghệ tâm trồng giá thể thể rêu + đá bọt (50:50) Lan Hạc vỹ trồng giá thể rêu + xơ dừa (70:30) 3.4 Nghiên cứu kỹ thuật chăm sóc lan Nghệ tâm (D loddigesii) Hạc vỹ (D aphyllum) giai đoạn vườn sản suất 3.4.1 Nghiên cứu xác định giá thể cho giai đoạn vườn sản xuất Đối với lan Nghệ tâm, giá thể vỏ thông + đá bọt + rêu (tỷ lệ 40:40:20), có độ xốp cao, nhẹ thống ảnh hưởng tích cực đến khả sinh trưởng con, tiêu chiều cao (13,35 cm), đường kính thân (0,37 cm), số nhánh (1,2); số lá/cây (9,6), chiều dài (5,05 cm); chiều rộng (1,29 cm) cao so với giá thể khác Với lan Hạc vỹ, giá thể Dớn bảng coi thích hợp nhất, sinh trưởng tốt (cây cao 13,46 cm; đường kính thân 0,41 cm, số nhánh 1,1 nhánh, 9,7 lá/cây, dài 4,98 cm; rộng 1,35 cm đồng thời giá trị thẩm mỹ tăng lên 3.4.2 Nghiên cứu chế độ dinh dưỡng cho lan giai đoạn vườn sản suất Trên giá thể phù hợp trình bày phần 3.4.1, tổ hợp chế phẩm dinh dưỡng B1 Thái Lan + Rong biển 95% có tác dụng tốt đến sinh trưởng hai loài lan so với chế phẩm khác B1 Thái Lan + Growmore B1 Thái Lan + Orchid focus Grow Các tiêu chiều cao cây, đường kính thân cao (14,85 cm; 0,55 cm với lan Nghệ tâm 17,3 cm; 0,62 cm với lan Hạc vỹ), tiêu số nhánh, số lá, chiều dài chiều rộng vượt trội (các giá trị tương ứng 1,5 nhánh/cây; 10,6 lá/cây; dài 5,49 cm; rộng 1,30 cm với lan Nghệ tâm 1,7 nhánh/cây; 10,8 lá/cây; dài 5,47 cm; rộng 1,51 cm với lan Hạc vỹ) 3.4.3 Nghiên cứu bổ sung Superthrive cho lan giai đoạn vườn sản xuất Phun bổ sung Superthrive liều lượng 0,2 ml/l có tác dụng tốt đến sinh trưởng hai loài lan, tiêu chiều cao cây, đường kính thân trội 23 so với liều lượng 0,1 mg/l đối chứng không phun (các giá trị tương ứng 18,4 cm, 1,06 cm với lan Nghệ tâm 23,7 cm; 1,21 cm với lan Hạc vỹ sau tháng trồng) Ngoài ra, khả để nhánh, số lá, chiều dài, chiều rộng liều lượng trội rõ rệt (2,7 nhánh; 12,8 lá; 6,01 cm dài; 1,53 cm rộng với lan Nghệ tâm 2,4 nhánh; 12 lá; 6,31 cm dài; 1,78 cm rộng với lan Hạc vỹ) KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Hai loài lan Nghệ tâm (D loddigesii) Hạc vỹ (D aphyllum) có dạng rễ chùm, thân rủ Trong lan Nghệ tâm có hoa đơn, cuống dài, hoa trắng ánh tím với trung tâm màu nghệ vàng, Hạc vỹ có hoa mọc thành cụm, cuống ngắn, hoa trắng sọc tím với trung tâm màu tím đậm Cấu tạo vi phẫu hai loài lan phù hợp với mơi trường sống phụ sinh, số lượng khí khổng nên có khả chịu hạn tốt Ngồi giá trị trang trí, làm cảnh, hai lồi lan có chứa số hoạt chất có tính dược lý: alkaloids (0,35%); flavonoids toàn phần (0,92% lan Nghệ tâm; 0,56% lan Hạc vỹ); polysaccharides toàn phần (1,42% lan Nghệ tâm, 4,20% lan Hạc vỹ) nên sử dụng chế biến dược liệu Các hóa chất mơi trường phù hợp sử dụng ni cấy in vitro hai lồi lan bao gồm: Chất khử trùng: 3% NaOCl ngâm 15 phút với 1‰ cefotaxime; môi trường tạo vật liệu PLBs từ tTCL: VW + 20 g/l sucrose + 10% nước dừa + g/l agar + g/l THT + 1,5 mg/l BA với lan Nghệ tâm; VW + 20 g/l sucrose + 10% nước dừa + g/l agar + g/l THT + 1,5 mg/l BA + 0,5 mg/l αNAA với lan Hạc vỹ; Môi trường tái sinh chồi từ PLBs: g/l THT + g/l peptone + 1,5 mg/l BA + 0,5 mg/l IBA + 30 g/l dịch nghiền bí ngơ + g/l tảo Spirulina: Mơi trường tạo hồn chỉnh: mơi trường ni cấy bổ sung g/l THT + mg/l IBA với lan Nghệ tâm bổ sung g/l THT + 0,5 mg/l PAA với lan Hạc vỹ Đối với hạt nhân tạo, môi trường phù hợp cho hình thành MS + 3% sodium alginate + mg/l BA + 0,5 mg/l IBA + 20 g/l sucrose + g/l THT + 20 mg/l ABA + 3000 mg/l carbendazim tiếp xúc với dung dịch CaCl2.2H2O 100 mM 30 phút; bảo quản hạt tốt nhiệt độ 4°C điều kiện tối, tỷ lệ nảy mầm hạt đạt 24 cao (68,2% lan Nghệ tâm; 70,2% lan Hạc vỹ) sau 24 tuần bảo quản; môi trường nhân nhanh protocorm chồi từ hạt nhân tạo sau bảo quản 1,5 mg/l BA + 0,5 mg/l PAA + 70 g/l dịch nghiền cà chua môi trường tạo in vitro hoàn chỉnh sau bảo quản g/l THT + 0,5 mg/l PAA, pH 5,5, (hệ số nhân protocorm 12,8 với lan Nghệ tâm, 16,6 với lan Hạc vỹ, hệ số nhân chồi đạt 12,3 với lan Nghệ tâm 12,9 với lan Hạc vỹ) Thời vụ thích hợp đưa in vitro vườn ươm cho hai loài lan vụ Thu giá thể hỗn hợp rêu + đá bọt (50:50) với lan lan Nghệ tâm hỗn hợp rêu + xơ dừa (70:30) với lan Hạc vỹ cho tỷ lệ sống cao (lần lượt 94% 92%) Việc bổ sung chế phẩm B1 Thái Lan định kỳ tuần/lần với liều lượng ml/l có tác dụng làm mập, chiều cao đạt từ 8,76 cm - 9,10 cm với số 7,9 - 8,1 số rễ 4,6 - 5,3 rễ Ở giai đoạn sản xuất, giá thể trồng thích hợp cho lan Nghệ tâm vỏ thông + đá bọt + rêu (tỷ lệ 40:40:20) lan Hạc vỹ Dớn bảng Bên cạnh đó, bổ sung dinh dưỡng qua hỗn hợp ml/l B1 + 0,5 g/l Rong biển 95% + 0,2 ml/l Superthrive có tác dụng rõ rệt đến nhánh, thúc đẩy sinh trưởng (cây cao 18,4 cm, đường kính thân 1,06 cm với 2,7 nhánh; 12,8 lan Nghệ tâm; tiêu tương tự 23,7 cm, 1,21 cm, 2,4 nhánh 12 lan Hạc vỹ) sau tháng trồng Đề nghị Áp dụng kỹ thuật nhân giống biện pháp kỹ thuật nuôi trồng lan Nghệ tâm (D loddigesii) Hạc vỹ (D aphyllum) vào sản xuất Tiếp tục đánh giá khả hoa phân tích tồn diện giá trị làm dược liệu lan Nghệ tâm Hạc vỹ trồng từ hạt giống nhân tạo DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Nguyễn Thị Lài, Phạm Hương Sơn, Nguyễn Hữu Cường, (2016), “Nghiên cứu đặc điểm cấu tạo Hoàng thảo Hạc vỹ Hoàng thảo Nghệ tâm”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam, Số 10(71), tr 27-31 Nguyễn Thị Lài, Phạm Hương Sơn, (2017), “Nghiên cứu tạo hạt giống nhân tạo lan Hạc vỹ (Dendrobium aphyllum)”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nông nghiệp Việt Nam, Số 1(74), tr 84 - 90 Nguyễn Thị Lài, Phạm Hương Sơn, Vũ Mạnh Hải, Tống Xuân Trung (2018), “Nghiên cứu nhân giống lan Hoàng thảo Nghệ tâm (Dendrobium loddigesii Rolfe) phương pháp ni cấy lát mỏng tế bào”, Tạp chí Khoa học Công nghệ Việt Nam, Số 60(5), tr 60 - 64 Nguyễn Thị Lài, Vũ Mạnh Hải, Phạm Hương Sơn, Bùi Thị Thanh Phương, (2018), "Nghiên cứu nuôi trồng lan Hoàng thảo Nghệ tâm (Dendrobium loddigesii Rolfe) giai đoạn vườn ươm”, Tạp chí Khoa học Công nghệ Việt Nam, Số 60(12), tr 36 - 39 ... cho người trồng lan, thực đề tài: Nghiên cứu đặc điểm sinh học kỹ thuật nhân giống phục vụ bảo tồn hai loài lan Nghệ tâm (Dendrobium loddigesii Rolfe), Hạc vỹ (Dendrobium aphyllum (Roxb.) Fisher)... số đặc điểm thực vật học hai lồi lan Nghệ tâm (D loddigesii) Hạc vỹ (D aphyllum) Bảng 1.1 Đặc điểm thực vật hai lồi lan nghiên cứu Đặc điểm Thân Lá Hoa Nghệ tâm (D loddigesii) Lan sống phụ sinh, ... Lan, Growmore - Chất kích thích sinh trưởng Superthrive 2.2 Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu đặc điểm sinh học hai loài lan Nghệ tâm (D loddigesii) Hạc vỹ (D aphyllum) - Nghiên cứu kỹ thuật nhân