Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nụng nghiệp ...42
1. Nghiên cứu công thức khử trùng mẫu
2. Nghiên cứu khả năng phát sinh mô sẹo (callus) của các cơ quan khác nhau 3. Nghiên cứu khả năng phát sinh chồi của các cơ quan khác nhau
4. Nghiên cứu khả năng nhân chồi của các cơ quan khác nhau 5. Tạo cây hoàn chỉnh.
Nội dung 2: Nghiên cứu chuyển gen Glucanase-Osmotin vào giống cà chua Balan, H18 và dòng dại L. pennelli
1. Xây dựng quy trình chuyển gen Glucanase-Osmotin vào cây cà chua thông qua chủng vi khuẩn và Vector mang gen kháng nấm:
- Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA105 có chứa plasmid pCAMBIA 1300 GLU-AP (Osmotin), mang 2 gen kháng nấm: Glucanase-Osmotin và gen kháng Hygomicine (hpt). Gen hpt có promoter 35S, còn gen Glucanase-Osmotin có promoter A9, cả 2 promoter này đều hoạt động rất mạnh ở genome thực vật.
- Gen kháng nấm Glucanase-Osmotin ủược tách từ Nicotiana tobacco (nguồn NCBI - Genbank).
- Vector mang gen kháng nấm Glucanase-Osmotin đ−ợc cung cấp từ INRA- Pháp. Cấu trúc của Vector đ−ợc trình bầy ở hình 1
Hình 2.1. Cấu trúc vector mang gen kháng nấm Glucanase
2. Đánh giá hiệu suất chuyển gen và kiểm tra sự có mặt tạm thời của gen chuyển. 3. Thu đ−ợc cây cà chua có gen Glucanase-Osmotin.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nụng nghiệp ...43 Licopersicon pennelli
1. Nghiên cứu quá trình chuyển gen Defensin vào cây cà chua thông qua chủng vi khuẩn và Vector mang gen kháng nấm sau:
- Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA4404, có chứa vector pBI121 mang gen kháng nấm: Defensin và gen kháng Kanamycin (nptII). Gen nptII có promoter Nos, còn gen Defensin có promoter CaMV35S, cả 2 promoter này đều hoạt động rất mạnh ở genome thực vật.
- Gen kháng nấm Defensin ủược tách từ Raphanus sativus (nguồn NCBI- Genbank).
- Vector mang gen kháng nấm Defensin đ−ợc cung cấp từ INRA- Pháp. Cấu trúc của Vector đ−ợc trình bầy ở hình 2.2.
Hình 2.2. Cấu trúc vector mang gen kháng nấm Defensin
2. Đánh giá hiệu suất chuyển gen và kiểm tra sự có mặt tạm thời của gen chuyển. 3. Thu đ−ợc cây cà chua có gen Defensin
Nội dung 4: Nghiên cứu chuyển gen Chitinase vào cà chua giống P375 Và Pháp lùn 1. Xây dựng quy trình chuyển gen Chitinase vào cây cà chua thông qua vi khuẩn và vector sau:
- Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA105 có chứa plasmid pCAMBIA 1300 CHI-GLU, mang gen kháng nấm: Chitinase và gen kháng Hygomicine (hpt). Gen hpt có promoter 35S, còn gen Chitinase có promoter A9, cả
RB Nos-Pro Nptll Nos-ter CaMV 35S Gen uidA Nos-ter LB Defensin
Pstl Sphl HindIII
ATG
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nụng nghiệp ...44
2 promoter này đều hoạt động rất mạnh ở genome thực vật,
- Gen kháng nấm Chitinase ủược tách từ Phaseolus vulgaris cv Saxa (nguồn NCBI-Genbank).
- Vector mang gen kháng nấm Chitinase đ−ợc cung cấp từ INRA- Pháp. Cấu trúc của Vector đ−ợc trình bầy ở hình 3.
Hình 2.3. Cấu trúc vector mang gen kháng nấm Chitinase
2. Đánh giá hiệu suất chuyển gen và kiểm tra sự có mặt tạm thời của gen chuyển. 3. Thu đ−ợc cây cà chua có gen Chitinase.
2.3 Ph−ơng pháp nghiên cứu
Nội dung 1: Xác định các môi tr−ờng nuôi cấy in vitro trên cây cà chua để phục vụ cho công tác chuyển gen.
1. ứng dụng kỹ thuật DAS-ELISA để kiểm tra tình hình nhiễm bệnh virus của hạt cà chua tr−ớc khi đ−a vào nuôi cấy In vitro
DAS-ELISA (Double Antibody SADNwich - Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) (Clark và Adams 1977) [49]. là một kỹ thuật miễn dịch liên kết Enzyme dạng cặp chả đang đ−ợc sử dụng rộng r0i nhất để phát hiện các tác nhân gây bệnh thực vật. Ph−ơng pháp này đ−ợc hoàn thiện vào năm 1971 và đến năm 1977 Clark và Adams ở Anh đ0 sử dụng để phát hiện 2 bệnh virus thực vật là AMV (Arabis Mosaic Virus) và PPV (Plum Pox Virus). Nó đ−ợc sử dụng rộng r0i do có độ nhạy cao, tốc dộ phản ứng nhanh và chính xác, sử dụng enzym làm phân tử đánh dấu và các bộ KIT chẩn đoán. (Clark và Adam A.M. 1977) [49].
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nụng nghiệp ...45 virus rất ít ỏi nh− các vật liệu trong nuôi cấy in vitro. Maury Y. và cs. (1985) [77], đ0 sử dụng ph−ơng pháp này để chẩn đoán các loại virus lan truyền qua hạt và cấp chứng chỉ hạt giống
Nguyên lí của ph−ơng pháp này là sử dụng 2 lớp kháng thể: Một lớp kháng thể đặc hiệu, lớp kháng thể khác đ−ợc gắn với 1 enzyme nhận biết. DAS-ELISA dựa vào tính chất của phản ứng giữa kháng nguyên (antigen) và kháng thể (antibody).. Virus đ−ợc chọn lọc và giữ lại bằng cách cố định 1 kháng thể đặc hiệu hấp thụ trên bề mặt giếng của đĩa plaque. Phản ứng của virus đ−ợc tập trung và tăng c−ờng bằng cách đ−a thêm vào một kháng thể đặc hiệu có gắn 1 enzyme đánh dấu (Phosphatase alkaline). Khi cho chất hiện màu Substrat (thực chất là chất nền của enzyme), enzyme gắn trong kháng thể sẽ thuỷ phân chất nến làm xuất hiện màu vàng. Màu vàng này cho biết virus có mặt trong mẫu bệnh đ−ợc kiểm tra hay không. Trong tr−ờng hợp không có virus trong mẫu mình định kiểm tra, enzyme đ−ợc gắn với kháng thể không đ−ợc giữ lại và nh− vậy sẽ không biểu hiện màu. Ph−ơng pháp này làm tăng độ nhậy của phép thử lên 1000 lần so với các ph−ơng pháp thử miễn dịch khác và cho phép định tính và định l−ợng số l−ợng virus có trong mẫunghiên cứu.
Ph−ơng pháp DAS-ELISA (Double Antibody SADNwich-Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) theo Clark và Adams (1977) [49] và dựa theo Maury Y. và cs. (1985) [77]. Các b−ớc thực hiện của phép thử DAS-ELISA: gồm 5 b−ớc (phụ lục I).
Chuẩn bị mẫu cho phép thử ELISA:
Hạt thu thập từ các nguồn khác nhau. Mỗi nguồn thu thập đ−ợc phân lô/giống (12 000 hạt/lô), mỗi lô lấy 4000 hạt và nghiền trong dung dịch đệm P.B.S.-T + P.V.P
- Kháng thể đặc hiệu và kháng thể có gắn enzyme đ−ợc pha lo0ng trong dung dịch P.B.S.-T + 2% P.V.P. theo tỷ lệ cho sẵn của h0ng.
- Chất hiện màu: hoà 1 viên /5 ml dung dịch đệm Substrat. - Tất cả các chất trên chỉ chuẩn bị tr−ớc khi cần sử dụng.
2. Ph−ơng pháp thí nghiệm phục vụ cho những nghiên cứu tái sinh cây cà chua in vitro Môi tr−ờng tái sinh cà chua in vitro trong các thí nghiệm này dựa trên môi tr−ờng cơ bản của Murashige ADN Skoog (MS-1962)[85], và dựa trên các tài liệu
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nụng nghiệp ...46
tham khảo của Peres L. và cs. 2001 [93], Sung H. Park (2003) [107], Moghaieb R. và cs. (2004) [82], N. Gorinnova và cs. (2005)[ 87], Romero(2001)[102], Bhatia và cs (2008)[40].
Mỗithí nghiệm nuôi cấy in vitro dùng 150 chồi (50 chồix3 lần nhắc lại) a. Khử trùng mẫu
- Hạt cà chua cho vào ống đong 30 ml cồn ethanol 70% để khử trùng bề mặt trong 1 phút. Sau đó hạt đ−ợc xử lý với dung dịch Hypoclorit calcium 10% cho thêm 2 giọt Tween 20 với 3 thời gian khác nhau: 10, 15 và 20 phút, mẫu đ−ợc rửa lại 4 lần với n−ớc cất 2 lần trong vòng 30 phút rồi hạt đ−ợc gieo lên môi tr−ờng gieo hạt pH 5,7, chúng đ−ợc đặt trong điều kiện t0 = 250C ± 2,ánh sáng tự nhiên.
- Môi tr−ờng gieo hạt: Môi tr−ờng dinh d−ỡng MS (1962) bao gồm cả vitamin+25 g/l sucrose+0,7% Agar; pH 5,7.
b. Nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo (callus):
Mỗi thí nghiệm dùng 150 chồi (50 chồix3 lần nhắc lại). Sau khi hạt cà chua đ−ợc gieo trong đĩa petri, chúng nẩy mầm và khi cây đ−ợc 10-12 ngày thì các lá mầm, lá thật và trụ lá mầm đ−ợc cắt nhỏ và đ−a vào nuôi cấy trong môi tr−ờng tạo mô sẹo. Các mẫu cấy đ−ợc đặt trong điêu kiện t0 = 25 ± 20C,để từ 7-10 ngày trong tối, sau đó đ−a ra ánh sáng tự nhiên. Kết quả đ−ợc ghi lại sau 4 tuần nuôi cấy.
- Môi tr−ờng tạo callus:là môi tr−ờng MS (1962)+3% sucrose+7g/l agar, pH 5,7 với các nồng độ và các tổ hợp khác nhau giữa các hợp chất điều hòa sinh tr−ởng Cytokinin (BA, kinetin, Zeatin) và Auxin (NAA, IAA, 2,4D).
c. Nghiên cứu khả năng tạo chồi, nhân chồi và tạo cây hoàn chỉnh
Các mẫu tạo callus đ−ợc tách và cấy chuyển sang môi tr−ờng tạo chồi. sau 4- 5 tuần các chồi đ−ợc tách và chuyển sang môi tr−ờng nhân chồi, sau đó chúng đ−ợc chuyển sang môi tr−ờng tạo cây hoàn chỉnh.
- Môi tr−ờng tạo chồi và nhân chồi: là môi tr−ờng MS (1962)+3% sucrose +7g/l agar, pH 5,8 với các nồng độ và các tổ hợp khác nhau giữa các hợp chất điều hòa sinh tr−ởng Cytokinin(BA, kinetin, Zeatin) và Auxin (NAA, IAA, 2,4D).
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nụng nghiệp ...47 - Môi tr−ờng tạo cây hoàn chỉnh: là môi tr−ờng MS (1962) + 2,5% sucrose + 5 g/l agar; và các nồng độ và các tổ hợp khác nhau giữa các hợp chất điều hòa sinh tr−ởng. Thí nghiệm khử trùng mẫu hạt dùng 300 hạt (100x 3 lần nhắc lại)
Nội dung 2: Nghiên cứu của chuyển gen Glucanase-Osmotin Glucanase- Osmotin vào giống cà chua Balan, H18 và dòng dại L. pennelli
Chuyển gen gián tiếp qua Agrobacterium tumefaciens: dựa theo quy trình của Datta và cs. 2001 [51], của Park (2003)[107] và Gorinova (2005)[87]
Tiền nuôi cấy (phụ lục I)
Nuôi chủng Agrobacterium tumefaciens và ủồng nuôi cấy. (phụ lục I) Rửa mẫu và chọn lọc:
- Rửa mẫu 3 lần bằng n−ớc cất khử trùng có chứa 250 mg/l Cefotaxime - Cấy chuyển mẫu sang môi tr−ờng MS1 có chứa kháng sinh Cefotaxime 500 mg/l và kháng sinh Hygromycine 50 mg/l để chọn lọc. Các mô đ0 đ−ợc biến nạp (ít nhất là qua 3 vòng chọn lọc). Sau đó các mẫu đ0 đ−ợc chọn lọc sẽ đ−ợc nuôi cấy và tái sinh theo quy trình nuôi cấy mô thông th−ờng với các kháng sinh và nồng độ t−ơng ứng.
Kiểm tra sự có mặt tạm thời của gen chuyển
Có nhiều ph−ơng pháp để xác định đối với thể thực vật biến nạp. Tuy nhiên, hiện nay có 4 ph−ơng pháp chính sau đây th−ờng đ−ợc sử dụng:
1) Thử khả năng tồn tại và phát triển của mô (hoặc tế bào) trên môi tr−ờng nuôi cấy có chứa chủng loại và nồng độ kháng sinh thích hợp.
2) Phản ứng hoá mô nếu chuyển gen GUS vào cây.
3) Tiến hành nhân đoạn gen cần kiểm tra trong tế bào bằng phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction - PCR).
4) Ph−ơng pháp lai ADN Sounthern Blotting.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nụng nghiệp ...48
kỹ thuật phân tích di truyền hiện đại đ−ợc sử dụng rộng r0i trong di truyền phân tử. Phản ứng PCR đ−ợc trình bầy ở phụ lục I.
Kiểm tra sự có mặt tạm thời của gen kháng kháng sinh Hygromycin (hpt)
Cặp mồi đặc hiệu của gen kháng kháng sinh chọn lọc hpt
HPT5 5’-CTGCCTGAAACCGAACTGC-3’
HPT3 5’-CTTCTGCGGGCGATTTGTG- 3’
Chu trình phản ứng chuỗi trùng hợp PCR cho gen hpt (phụ lục I)
Xác định sự có mặt tạm thời của gen kháng nấm Glucanase
Với cặp mồi đặc hiệu của gen Glucanase
GL.F: 5’-GGGGCTCAATCGATAGGTGGT-3’ GL.R: 5’-GCCGACAGTGGTCCCAAAGAT-3’
Chu trình phản ứng chuỗi trùng hợp PCR cho gen Glucanase
Kiểm tra sự có mặt tạm thời của gen kháng nấm Osmotin (AP)
Cặp mồi đặc hiệu của gen Osmotin
AP.F: 5’- ATGGGCAACTTGAGATCTTCT-3’ AP.R: 5’-GCCGACAGTGGTCCCAAAGAT-3’
Chu trình phản ứng chuỗi trùng hợp PCR cho gen Osmotin (AP) (phụ lục 1) Nội dung 3: Nghiên cứu chuyển gen Defencin kháng nấm vào cà chua H18 và Licopersicon pennelli
Chuyển gen gián tiếp qua Agrobacterium tumefaciens. (dựa theo quy trình của Datta và cs. 2001 [51], của Sung Hun Park (2003)[107], NoraGorinova (2005)[87].
Tiền nuôi cấy: Giống nh− quy trình ở mục chuyển gen Glucanase (Mục II.3.1.3) Nuôi chủng Agrobacterium tumefaciens và ủồng nuôi cấy (phụ lục I).
Rửa mẫu và chọn lọc:
- Rửa mẫu 3 lần bằng n−ớc cất khử trùng có chứa 250 mg/l Cefotaxime
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nụng nghiệp ...49
mg/l và kháng sinh Kanamycyn 100 mg/l để chọn lọc. Các mô đ0 đ−ợc biến nạp (ít nhất là qua 3 vòng chọn lọc). Sau đó các mẫu đ0 đ−ợc chọn lọc sẽ đ−ợc nuôi cấy và tái sinh theo quy trình nuôi cấy mô thông th−ờng với các kháng sinh và nồng độ t−ơng ứng.
Kiểm tra sự có mặt tạm thời của gen chuyển
Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng kỹ thuật PCR Phản ứng PCR đ−ợc trình bầy ở phụ lục I.
Kiểm tra sự có mặt tạm thời của gen nptII với cặp mồi đặc hiệu: NPT5': 5’-CCGCCGATGACGCGGGACAAGCC-3’
NPT3': 5’-GGTCCGCCACACCCAGCCGGCCA-3’
Chu trình phản ứng chuỗi trùng hợp PCR cho gen nptII (phụ lục1)
Kiểm tra sự có mặt tạm thời của gen Defensin
Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu: Def.F: 5’-AGTCGAGTGAGATGAATAAA-3’ Def.R: 5′-CTCTTTATTCATCTCACTCGACT-3′;
Chu trình phản ứng chuỗi trùng hợp PCR cho Defensin (phụ lục 1)
Nội dung 4: Nghiên cứu chuyển gen Chitinase vào cà chua giống P375 và Pháp lùn Dựa theo quy trình của Swapan Datta và cs. 2001[51], của Sung Hun Park (2003) và Nora Gorinova (2005).
Tiền nuôi cấy.Giống nh− quy trình ở mục chuyển gen Glucanase
Nuôi chủng Agrobacterium tumefaciens và ủồng nuôi cấy. Giống nh− quy trình đồng nuôi cấy ở mục chuyển gen Glucanase
Rửa mẫu và chọn lọc: Giống nh− quy trình đồng nuôi cấy ở mục chuyển gen Glucanase
Xác định sự có mặt tạm thời của gen Chitinase
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nụng nghiệp ...50
Cặp mồi đặc tr−ng của gen Chitinase
CHI.F: 5’-ATGGGGAAGAATAGGATGATG-3’ CHI.R: 5’-GCCGACAGTGGTCCCAAAGAT-3’
Chu trình phản ứng chuỗi trùng hợp PCR cho gen Chitinase (phụ lục 1) 2.4 Ph−ơng pháp xử lý số liệu
Chúng tôi theo dõi hệ số nhân chồi trung bình/ mẫu của các bộ phận trụ lá mầm, lá thật và lá mầm của 5 giống và độ lệch chuẩn của trung bình 3 lần nhắc lại cũng đ−ợc tính toán theo ch−ơng trình IRISTAT 4.0 (Phạm Tiến Dũng,2003)[2].
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nụng nghiệp ...51 Ch−ơng 3