2.1 Vật liệu nghiên cứu
Các giống, dòng cà chua đ−ợc sử dụng:
- Balan, Pháp lùn: Các giống đ−ợc trồng trong sản xuất từ lâu. - P375, H18: Nhập nội từ Đài loan
- Dòng cà chua dại L. pennelli (dòng này có chứa gen bất dục đực TBC) đ−ợc cung cấp từ AVRDC (Đài loan), với mục đích nghiên cứu làm vật liệu tạo giống −u thế lai.
Chúng là những giống cà chua dễ trồng, năng suất cao, phẩm chất khá nh−ng khả năng chống chịu bệnh nấm không tốt nên hàng năm năng suất bị giảm mạnh khi có dịch.
Kiểm tra độ nhiễm bệnh viruscủa giống chúng tôi sử dụng hạt giống từ các nguồn khác nhau: Từ Viện Di truyền Nông nghiệp, trung tâm AVRDC và một số đ−ợc lấy từ các trạm giống.
- Hai Virus đ−ợc nghiên cứu trong thí nghiệm này là 2 loại virus lan truyền qua hạt.
+ Virus gây ra bệnh khảm trên cà chua (Tomato Mosaic Virus - ToMV). Đ−ợc miêu tả bởi (Broadbent, 1976) [43].
+ Virus gây bệnh khảm thuốc lá (Tobacco Mosaic virus - TMV). Đ−ợc miêu tả bởi Samuel. G., (1934). Cả hai đều thuộc nhóm Tobamovirus.
- Các loại kháng thể đặc hiệu (IgG) và các kháng thể có gắn enzyme của 2 virut ToMV và TMV đ−ợc cung cấp từ H0ng Bio-RAD, Pháp.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nụng nghiệp ...41
Dung dịch đệm Hoá chất Khối l−ợng Hoá chất Khối l−ợng
NaCO3 1,59g NaHCO3 2,93g Dung dịch Coating: pH 9,6 NaN 3 0,20g N−ớc cất 2 lần 1000 ml NaCl 8,00g KCL 0,20g KH2 PO4 0,20g NaN3 0,20g Dung dịch P.B.S.: pH 7,4 Na2HPO4 2,90g N−ớc cất 2 lần 1000ml Dung dịch P.B.S.-T: P.B.S.+ 0,5 ml/l Tween 20 Dung dịch P.B.S.-T + P.V.P P.B.S.-T + 2% P.V.P.(Polyvinyl pyrrolidone
Dung dịch hiện màu (Substrat): pH 9,8
Diethanolamine 97,00 ml NaN3 0,20g
Vi khuẩn dùng để chuyển gen
+Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens EHA 105 + Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens LBA4404
Để chuyển gen Glucanase-Osmotin đ0 sử dụng mẫu lá mầm và trụ lá mầm của ba giống Bal an, H18 và giống cà chua dạiL. pennelli
Để chuyển gen Defensin đ0 sử dụng mẫu lá mầm và trụ lá mầm của hai giống H18 và giống cà chua dạiL. pennelli
Để chuyển gen Chitinase-Glucanase đ0 sử dụng mẫu lá mầm và trụ lá mầm của giống P375 và giống Pháp lùn.
2.2 Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Xác định các môi tr−ờng nuôi cấy in vitro thu cây cà chua tái sinh phục vụ cho chuyển nạp gen
a. ứng dụng kỹ thuật DAS-ELISA để kiểm tra tình hình nhiễm bệnh virus của hạt cà chua tr−ớc khi đ−a vào nuôi cấy In vitro