Huyền phự húa cặn vi khuẩn bằng MS1 lỏng (MS0 +1 mg/l BA + 0.1mg/l NAA) cú chứa 250 mg/l Acetosyringone, OD600 = 0.3. Ngõm mẫu vào dung dịch lắc nhẹ 5-7 phỳt, chuyển mẫu sang MS1 cứng + 250 mg/l acetosyringone ủểủồng nuụi cấy trong 48 giờ
Mẫu ủược cấy trờn mụi trường MS1+ 50 mg/l hygromycin + 250 mg/l cefotaxime, ở 25oC+2, 6-8 tuần, chuyển mẫu sang MS2 (MS0
+ 2mg/l zeatin, 0.1 mg/l IAA) + 50mg/l hygromycin +250 mg/l cefitaxime, ở 250C +2, trong thời gian 8-10 tuần
Cấy chồi ủó ủược tỏch tiếp tục trờn mụi trường MS1 cú bổ sung 50mg/l hygromycin + 250 mg/l cefotaxime, ở 250C+2ủể nhõn chồi
Cỏc chồi cú chiều cao từ 1-2 cm ủược cấy chuyển sang mụi trường tạo cõy hoàn chỉnh MS3 (MS0 + 2mg/l Kinetin + 1mg/l IAA) + 50mg/l hygromycin và 250 mg/l cefotaxime * Rửa mẫu 3 lần bằng 7mg/l dung dịch Cefotaxime 250 mg/l vụ trựng * Làm khụ mẫu bằng giấy thấm tiệt trựng CHỌN LỌC NHÂN CHỒI TẠO CÂY HOÀN CHỈNH 2. NUễI CẤY VI KHUẨN
Nuụi từng chủng Agrobaoterium EHA 105 cú chứa plasmid p. CAMBIA 1300 mang cỏc gen khỏng nấm chitinase, glucanase và osmotin vaf gen kháng KS Hygromycin trong mụi trường LB lỏng cú chứa 50 mg/l Rifamycin và 50 mg/l Hygromycin, ở 280C, OD600 = 0.3
* Ly tõm ở 3000 vũng/ phỳt trong 10 phỳt * Rửa cặn bằng dung dịch MgS04 (10mM) BIẾN NẠP
Cỏc mẫu ủược cắt thành cỏc mảnh nhỏ cú kớch thước 0,1x0,3 mm, ủược nuụi cấy trờn mụi trường tạo callus MS1. Quỏ trỡnh ti ền nuụi cấy ủược tiến
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nụng nghiệp ...103 3.3 Kết quả chuyển gen defensin vào cà chua
Mục đích của thí nghiệm tạo ra cây cà chua mang gen Defensin nhằm kháng đ−ợc một số bệnh nấm hại trên cây cà chua nh− Fusarium oxysporium và Botritis cineraDefensin đ−ợc sử dụng ở đây là Defensin Rs-AFP2 có nguồn gốc từ thực vật, gen này đ−ợc tách từ Raphanus sativus thiết kế với một promoter thích hợp. Protein Defensin là những thành phần trong hệ thống miễn dịch bẩm sinh thực vật. Protein Defensin thực vật có trọng l−ợng phân tử nhỏ (<10 kDa), thành phần protein cơ bản cao và th−ờng chứa đựng một l−ợng cystein lắng đọng (điển hình là 4, 6 hoặc 8). Dựa trên ảnh h−ởng của Defensin thực vật lên sự phát triển và hình thái học của nấm Fusarium culmorum, nó đ−ợc phân loại thành 2 nhóm. Defensin tạo hình gây giảm sự kéo dài sợi nấm nh−ng kèm theo tăng tạo nhánh của sợi nấm, nh−ng ng−ợc lại Defensin không tạo hình sẽ gây giảm tốc độ kéo dài sợi nấm, nh−ng không gây ra sự méo mó hình dạng. Defensin thực vật mà chúng tôi sử dụng trong thí nghiệm này là Defensin tạo hình Rs-AFP2. Cơ chế chính xác về khả năng ức chế sự phát triển của nấm hại ch−a đ−ợc hiểu hết, nh−ng nhìn chung đều chấp nhận rằng chúng hoạt động ở vị trí màng nguyên sinh chất, nó có khả năng ức chế với các hiệu lực khác nhau và các phổ nấm hại khác nhau.
Theo công bố của Terras và cs., (1995) [110] cây cải dầu khi đ−ợc chuyển gen Defensin có khả năng kháng đ−ợc nấm bệnh Alternaria longipes và t−ơng tự đối với cà chua, kháng đ−ợc nấm bệnh Alternaria solani.
Chúng tôi đ0 nghiên cứu chuyển gen vào dòng cà chua H18 và dòng hoang dại L.pennelli vì dòng này không có khả năng tạo chồi hoàn chỉnh khi đ−ợc chuyển gen Glucanase. Đây là 1 dòng bất dục đực TBC, vì vậy chúng tôi muốnkiểm tra liệu khi sử dụng một chủng vi khuẩn khác, với 1 vector khác và một gen khác thì chúng có khả năng tái sinh để tạo thành các chồi hoàn chỉnh và thu đ−ợc các cây chuyển gen phục vụ cho công tác chọn tạo giống hay không. Những mẫu đ0 đ−ợc sử dụng trong thí nghiệm này là lá mầm và trụ lá mầm.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nụng nghiệp ...104
3.3.1 Khả năng tái sinh cây in vitro của hai giống cà chua H18 và L. pennelli
trong điều kiện không có kháng sinh
Kết quả về khả năng tái sinh của hai giống (dòng) H18 và L. pennelli đ−ợc trình bầy ở bảng 3.16.
Bảng 3.16. Khả năng tái sinh các mẫu trụ lá mầm và lá mầm của giống H18 và dòng L. pennelli
Phần trăm tạo callus (%)
Phần trăm tái sinh chồi (%)
Khả năng tái sinh chồi / mẫu Kiểu gen Trụ lá mầm Lá mầm Trụ lá mầm Lá mầm Trụ lá mầm Lá mầm H18 81,8 92,3 27,8 58,9 4,2 4,1 L. pennelli 88,9 96,8 40,8 81,6 5,6 4,9
- Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA4404, có chứa vector pBI121 mang gen kháng nấm: Defensin và gen kháng Kanamycin (nptII). Gen nptII có promoter Nos, còn gen Defensin có promoter 35S.
3.3.2 Tiền nuôi cấy và biến nạp
Các mẫu lá mầm và trụ lá mầm đ−ợc cắt thành những mảnh nhỏ có kích th−ớc 0,1x0,3 cm để nuôi cấy in vitro. Với kích th−ớc này, các mảnh mẫu có bề mặt tiếp xúc đủ lớn đồng thời không ảnh h−ởng tới quá trình tái sinh chồi sau này. Các mẫu cà chua đ−ợc nuôi cấy trên môi tr−ờng MS1. Quá trình tiền nuôi cấy đ−ợc tiến hành trong thời gian 24 tiếng, ở 250C-260 trong tối. Cần thiết phải qua giai đoạn tiền nuôi cấy với lí do chính trong giai đoạn này tế bào phân chia mạnh tạo ra phôi sinh khối lớn và ch−a biệt hoá, thuận lợi cho quá trình chuyển gen.
Chuyển gen gián tiếp qua Agrobacterium tumefaciens. (dựa theo quy trình của Datta và cs. 2001[ 51], của Park (2003)[107] và Gorinova (2005)[87].
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nụng nghiệp ...105
- Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens có chứa gen Defensine đ−ợc nuôi 18 giờ trong môi tr−ờng LB lỏng với 50 mg/l Kanmycin và 50mg/l Rifamycine ở 280C.
- Ly tâm dung dịch ở 3000 vòng/phút trong 20 phút.
- Đo mật độ quang học ở b−ớc sóng 600 nm, khi mật độ quang học OD=0,5- 0,6. Dung dịch vi khuẩn đ−ợc hoà lo0ng với 3 nồng độ huyền phù khác nhau thích hợp cho chuyển gen (1:10; 1:15 và 1:20).
- Trộn lẫn dịch huyền phù tế bào vi khuẩn với các mẫulá mầm và trụ lá mầm (in vitro) đ−ợc cắt nhỏ. Lắc nhẹ từ 3-5 phút sau đó thấm khô mẫu bằng giấy thấm whatman đ0 đ−ợc khử trùng và chuyển chúng sang môi tr−ờng đồng nuôi cấy MS1 bổ sung 250 mg/l Acetosiringone trong 36 giờ, 48 giờ và 60 giờ ở điều kiện tối.
Rửa mẫu và chọn lọc:
- Rửa mẫu 3 lần bằng n−ớc cất khử trùng có chứa 250 mg/l Cefotaxime - Cấy chuyển mẫu sang môi tr−ờng MS1 có chứa kháng sinh Cefotaxime 500 mg/l và kháng sinh Kanamycyn 100 mg/l để chọn lọc. Các mô đ0 đ−ợc biến nạp (ít nhất là qua 3 vòng chọn lọc). Sau đó các mẫu đ0 đ−ợc chọn lọc sẽ đ−ợc nuôi cấy và tái sinh theo quy trình nuôi cấy mô thông th−ờng với các kháng sinh và nồng độ t−ơng ứng.
3.3.3 Quá trình biến nạp gen Defensin (Dựa theo quy trình của Sung và cs,
2003[ 107] và Nora, Gorinova (2005) [87]
Các mẫu lá mầm và trụ lá mầm đ−ợc cắt thành những mảnh nhỏ có kích th−ớc 0,1x0,3 cm ủể tạo vết thương, đ−ợc tiền nuôi cấy invitro trong môi tr−ờng tạo callus (MS1). Dựa vào các tài liệu tham khảo và các kết quả thu đ−ợc khi chuyển gen Glucanase vào các giống cà chua Balan, H18 và dòng L. pennelli, trong quá trình biến nạp với P375 và Pháp lùn nhằm chuyển gen Defensin chúng tôi cũng thực hiện đồng nuôi cấy (hình 3.37) với 3 nồng độ khác nhau của vi khuẩn (1:10; 1:15 và 1:20) với 3 thời gian đồng nuôi cấy khác nhau (36 tiếng; 48 tiếng và 60 tiếng),
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nụng nghiệp ...106
(hình 3.37). Trong thí nghiệm này sử dụng chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA4404, có chứa vector pBI121 mang gen kháng nấm: Defensin và gen kháng Kanamycin (nptII). Gen nptII có promoter Nos, còn gen Defensin có promoter 35S, cả 2 promoter này đều hoạt động rất mạnh ở genome thực vật.
Quá trình chuyển nạp gen Defensin vào tế bào cà chua ủược thực hiện trên cơ sở vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ủược nhiễm vào các tế bào bị thương ủang phân chia mạnh, vì vậy cần thiết phải qua giai đoạn tiền nuôi cấy, sau tiền nuôi cấy các mẫu lá mầm và trụ lá mầm lại đ−ợc tạo thêm vết th−ơng mới làm tăng khả năng tiếp xúc của vi khuẩn.
3.3.4 Các kết quả nghiên cứu khả năng tái sinh của các mẫu cấy trên môi
tr−ờng có chứa kháng sinh a. Tạo mô sẹo và tái sinh chồi.
Đ−ợc thực hiện nh− chuyển gen với Glucanase chỉ khác 1 điều khi chuyển gen Defensin, kháng sinh chọn lọc đ−ợc sử dụng là Kanamycin.
Sau khi nuôi chung, mẫu lá đ−ợc lấy ra và rửa sạch khuẩn bằng môi tr−ờng MS lỏng bổ sung 500mg/l Cefotaxime, mẫu biến nạp đ−ợc chuyển sang môi tr−ờng chọn lọc MS1 có bổ sung đồng thời 2 loại kháng sinh: Cefotaxime (500 mg/l) và Kanamycin (100 mg/l). Cefotaxime nhằm ức chế sự phát triển trở lại của vi khuẩn, còn Kanamycin là kháng sinh chọn lọc các tế bào và các mô đ0 đ−ợc biến nạp. Trong quá trình này các mẫu đối chứng đ−ợc lấy ra rửa bằng MS1 lỏng có bổ sung 500 mg/l Cefotaxime. Trên thực tế các mẫu lá mầm và trụ lá mầm biến nạp vẫn có sự phát triển tiếp tục của vi khuẩn Agrobacterium nên chúng tôi đ0 tiến hành cấy chuyển nhiều lần nhằm loại bỏ tối đa vi khuẩn. Sau ba tuần đ−ợc nuôi cấy trong tối, những callus có khả năng sống sót trên môi tr−ờng chọn lọc đ−ợc tiếp tục chọn lọc ít nhất 3 vòng trên môi tr−ờng chọn lọc MS1 với thời gian chiếu sáng 15/24 giờ nhiệt độ nuôi là 250C ± 20C rồi chúng đ−ợc cấy chuyển sang môi tr−ờng tái sinh chồi MS2 có bổ sung 2 loại kháng sinh Cefotaxime (500mg/l) và Kanamycin (100mg/l) và đ−ợc nuôi d−ới ánh sáng đèn nêông với c−ờng độ 2000 lux, thời gian
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nụng nghiệp ...107
chiếu sáng 15/24 giờ, nhiệt độ nuôi là 250C ± 20C. Những mô sống sót trên môi tr−ờng tái sinh MS2 cứ sau ba-bốn tuần cấy chuyển một lần cho tới khi có sự tái sinh phôi hoặc đa chồi (ít nhất sau 3 chu kỳ chọn lọc).
b. ảnh h−ởng của kháng sinh lên khả năng tái sinh
ở những thí nghiệm đối chứng, không có sự biến nạp, chúng tôi đ0 xác định đ−ợc ảnh h−ởng của Kanamycin đến sự tái sinh và phát triển của các mẫu không đ−ợc biến nạp gen. Trong môi tr−ờng chọn lọc có chứa 100 mg/l Kanamycin, sự tái sinh phôi của các mẫu không đ−ợc biến nạp đ0 hoàn toàn bị kìm h0m, chúng đ0 chết sau vài tuần nuôi cấy. Trái lại, với các thí nghiệm biến nạp với gen Defensin sử dụng chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA4404, có chứa vector pBI121 mang gen kháng nấm: Defensin và gen kháng Kanamycin (nptII). Gen nptII có promoter Nos, còn gen Defensin có promoter 35S. Trong quá trình lây nhiễm với vi khuẩn, phần T-ADN sát nhập vào genome cây chủ, gen kháng Kanamycin (nptII) và gen kháng nấm Defensin đ−ợc gắn vào giữa T- ADN nên chúng cũng đ−ợc sát gộp đồng thời vào genome cây chủ, vì thế, cây đ−ợc biến nạp hoàn toàn sẽ thể hiện các tính trạng của gen nptII, và gen Defensin.
Trong thí nghiệm này, sau 3-4 tuần nuôi cấy trên môi tr−ờng tái sinh chồi tính kháng với kháng sinh Kanamycin đ−ợc bắt đầu biểu hiện. Chúng tôi đ0 tiến hành kiểm tra và đánh giá các mẫu biến nạp và quan sát thấy:
- Giống nh− các tr−ờng hợp chuyển Glucanase-Osmotin, các mô phát triển không đồng đều tuỳ thuộc vào giống cà chua và mẫu cấy (hình 3.40 - hình3.38).
- Đối với dòng L. pennelli, phần lớn các mô bị bạch tạng, chúng bị bạc dần sau nhiều lần cấy chuyển, ít có cấu trúc sinh phôi, có khả năng phát triển nh−ng trông chúng nh− bị trơ hoá. Một phần nhỏ có khả năng tái sinh chồi, tuy nhiên chúng không phát triển nhanh và có xu h−ớng tạo ra các chồi không hoàn chỉnh.
- Đối với giống H18, cũng giống nh− dòng L.pennelli cũng quan sát thấy 2 loại mô: một loại có số l−ợng ít hơn, có cấu trúc sinh phôi hoặc đa chồi, trong số
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nụng nghiệp ...108
chúng xuất hiện chồi xanh phát triển bình th−ờng, còn 1 loại thì bị hoá nâu không phát triển và chết (hình 3.40); các mô có khả năng sinh phôi có khả năng phát triển thành chồi sau nhiều lần cấy chuyển (hình 3.41).
Các mô, tế bào hoá nâu hay bị bạch tạng không có khả năng phát triển rồi chết, hiện t−ợng này biểu hiện các mô tế bào này không đ−ợc mang gen ngoại lai hptII. Do đó, trên môi tr−ờng nuôi cấy có chứa Kanamycin, các mô tế bào đ0 bị kháng sinh này ức chế quá trình sinh tổng hợp protein làm mất sức sống và khả năng phát triển hóa của mẫu. Còn các mẫu sống sót đ−ợc trên môi tr−ờng có chứa kháng sinh tỏ ra có khả năng kháng đ−ợc trên môi tr−ờng này, tính kháng này có đ−ợc là do tế bào có thể đ0 mang gen ngoại lai nptII đ−ợc điều khiển bởi Promotor nos. Khi Promotor hoạt động, gen nptII sẽ m0 hoá cho Kanamycin phosphotrasnferase làm mất hoạt tính của kháng sinh Kanamycin nên mô (chồi) vẫn phát triển tốt.
Việc các phôi có khả năng sống sót trên môi tr−ờng có chứa kháng sinh Kanamycin chúng có mang gen Defensin hay không cần phải đ−ợc kiểm tra thông qua kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu.
Ngoài ảnh h−ởng của các kháng sinh chọn lọc và kháng sinh diệt vi khuẩn Agrobacterium d− thừa tồn đọng trong môi tr−ờng nuôi cấy có chứa các gen gây độc vir. cũng ức chế sự sinh tr−ởng và phát triển của tế bào, thậm chí làm chết tế bào. Vì vậy hệ số tái sinh sau chuyển gen giảm một cách rõ rệt là điều rất dễ hiểu (bảng 3.16 và hình 3.35). Các nghiên cứu về ảnh h−ởng của nồng độ vi khuẩn và thời gian đồng nuôi cấy lên hiệu quả biến nạp đ0 đ−ợc nghiên cứu.
c. ảnh h−ởng của nồng độ vi khuẩn và thời gian đồng nuôi cấy lên khả năng tái sinh chồi.
Chủng vi khuẩn Agrobacterium d− thừa tồn đọng trong môi tr−ờng nuôi cấy có chứa các gen gây độc vir cũng có khả năng ức chế sự sinh tr−ởng và phát triển của tế bào giống nh− các loại kháng sinh chọn lọc và kháng sinh diệt khuẩn, thậm chí gây chết tế bào, hoặc chúng còn ảnh h−ởng rất lâu dài đến sự sinh tr−ởng phát triển của cây con sau này.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nụng nghiệp ...109
Dựa vào các tài liệu tham khảo trong quá trình biến nạp gen Defensin vào giống cà chua H18 và dòng L. pennelli, nồng độ vi khuẩn ở dạng huyền phù cũng đ−ợc hoà lo0ng với 3 tỷ lệ khác nhau, t−ơng ứng 1:10; 1:15; 1:20, với 3 thời gian đồng nuôi cấy. Giống nh− tr−ờng hợp chuyển gen Glucanase vào giống Balan, H18 và L. pennelli. Theo dõi các thí nghiệm cho thấy khi sử dụng nồng độ tế bào vi khuẩn thấp (nồng độ 1:20), tỷ lệ tái sinh thấp, không đáng kể. Tuy nhiên khi sử dụng một l−ợng tế bào vi khuẩn cao hơn gấp 2 lần (1:10), ở tỷ lệ này tỷ lệ tái sinh thu đ−ợc sau xử lý cũng giảm đáng kể. Quan sát các thí nghiệm ở nồng độ vi khuẩn 1:15 cho thấy đây là nồng độ vi khuẩn thích hợp t−ơng đ−ơng nồng độ vi khuẩn đo ở b−ớc sóng 600 nm với OD = 0,3 đ0 cho tỷ lệ tái sinh cao nhất.
Quan sát các chồi tái sinh trên môi tr−ờng có chứa kháng sinh Kanamycin thu đ−ợc sau khi đ0 chuyển gen, cho thấy: Nồng độ vi khuẩn có tỷ lệ 1:15 (t−ơng đ−ơng với O.D đo ở b−ớc sóng 600 nm = 0,3). Đặc biệt mẫu là lá mầm cho tỷ lệ tái sinh cao hơn mẫu là trụ lá mầm (bảng 3.17, hình 3.36) và đồng nuôi cấy trong 48 tiếng cho tỷ lệ tái sinh cao nhất (bảng 3.17, hình 3.35).
0 1 2 3 4 5 L.pennelli H18 1:10 TLM 1:10 LM 1:15 TLM 1:15 LM 1:20 TLM 1:20 LM
Hình 3.35. ảnh h−ởng của nồng độ vi khuẩn và mẫu cấy lên khả năng tái sinh
Hình 3.35 minh họa ảnh h−ởng của thời gian đồng nuôi cấy lên tỷ lệ tái sinh mẫu của H18 và dòng L.pennelli khi đ−ợc chuyển gen Defensin
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nụng nghiệp ...110 0 5 10 15 20 25 L.pennelli H18 36 tiếng