NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG CÀ CHUA NHỜ MARKER PHÂN TỬ SSR NHẰM XÁC ĐỊNH NGUỒN NGUYÊN LIỆU KHÁNG BỆNH HÉO RŨ VI KHUẨN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG CÀ CHUA NHỜ MARKER PHÂN TỬ SSR NHẰM XÁC ĐỊNH NGUỒN NGUYÊN LIỆU KHÁNG BỆNH HÉO RŨ VI KHUẨN Ralstonia solanacearum Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : HUỲNH THỊ XUÂN TRANG Niên khóa : 2007 – 2011 Tháng 07 năm 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG CÀ CHUA NHỜ MARKER PHÂN TỬ SSR NHẰM XÁC ĐỊNH NGUỒN NGUYÊN LIỆU KHÁNG BỆNH HÉO RŨ VI KHUẨN Ralstonia solanacearum Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực ThS TRƯƠNG QUỐC ÁNH HUỲNH THỊ XUÂN TRANG Tháng 07 năm 2011 LỜI CẢM ƠN Lời muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cha mẹ anh chị người thân gia đình chỗ dựa vững cho tạo điều kiện cho học tập tốt Xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh tạo điều kiện cho suốt thời gian học tập trường Quý Thầy, Cô Bộ môn Công Nghệ Sinh Học quý thầy cô giảng dạy suốt bốn năm học ThS Trương Quốc Ánh tận tình hướng dẫn, bảo thời gian thực luận văn tốt nghiệp ThS Bùi Phú Nam Anh anh chị thuộc Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam quan tâm giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài Toàn thể lớp DH07SH giúp đỡ động viên suốt bốn năm qua i TÓM TẮT Bệnh héo rũ vi khuẩn cà chua, mô tả Smith (1896) cách 100 năm, xếp vào số bệnh nguy hiểm cà chua vùng nhiệt đới cận nhiệt đới Hiện bệnh héo rũ nguyên nhân chủ yếu làm giảm sản lượng cà chua nhiều vùng Việt Nam Bệnh héo rũ vi khuẩn đất Ralstonia solanacearum Bệnh gây hại tất phận lá, thân, rễ Hiện nay, sử dụng giống kháng phương pháp hữu hiệu để kiểm soát bệnh Tuy nhiên, phương pháp chọn giống kháng truyền thống khó khăn tốn thời gian Vì mục tiêu luận văn nghiên cứu tính đa hình di truyền số giống cà chua thị phân tử SSR từ xác định giống kháng thích hợp nòi vi khuẩn Ralstonia solanacearum phân lập Việt Nam Phương pháp cho ta vượt qua nhiều vấn đề khó khăn chọn giống phương pháp truyền thống Kết phân tích đánh giá kiểu hình phương pháp lây nhiễm nhân tạo giai đoạn cho thấy nòi vi khuẩn phân lập vùng sinh thái TP Hồ Chí Minh Lâm Đồng xác định nòi có độc tính Kết đánh giá xác định giống số 10 giống nhiễm, giống số 18 giống kháng giống số 1, 4, 7, 12, 15 kháng trung bình Kết phản ứng PCR cho thấy SSR306 định vị NST 4, liên kết với gen kháng Bw4 cho đa hình giống 1, 4, 7, 12, 15, 18 Kết tạo tiền đề cho công tác chọn, tạo giống cà chua kháng bệnh héo rũ thị phân tử Việt Nam ii SUMMARY Title: The primary of research on polymorphism to tomato varieties by molecular marker SSR for identifying resistant bacterial wilt Ralstonia solanacearum Bacterial wilt of tomato, described by Smith (1896) over 100 years ago, caused among the most serious diseases of tomato in tropical and subtropical It is now the major constraint on production of tomato in many parts of VietNam Bacterial wilt is caused by the soilborne bacterium Ralstonia solanacearum This oomycete pathogen attacks on leaves, stems, roots of tomato Introduction of resistant varieties is therefore the most effective measure to control this disease However, conventional breeding approach for disease resistance is difficult, labor and cost time The objective of this thesis is to research on genetic polymophism using molecular marker SSR for identifying to tomato varieties so that we can define resistant varieties with Ralstonia solanacearum isolate that collected in VietNam This method help us overcome difficult problems when we apply conventional approach The result of phenotypic evaluation by artificial infection methods showed that bacterial isolates separate of two ecological HoChiMinh city and LamDong province, isolates are exhibited the virulence Result also showed line of 10 is susceptible, line of 18 is resistant and lines of 1, and 7, 12, 15 are medium resistance The result of PCR reaction showed that SSR306 was located on chromosome 4, linked to Bw4 resistant gene, have polymorphism with line od tomato as 1, 4, 7, 12, 15, 18 This result opens up for MAS (Marker Assisted Selection) of bacterial wilt resistant improvement of tomato varieties in Vietnam Keywords: Ralstonia solanacearum, bacterial wilt, conventional breeding approach, , genetic polymophism, molecular marker SSR, resistant gene iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT iii SUMMARY ii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH SÁCH CÁC BẢNG vii DANH SÁCH CÁC HÌNH viii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan cà chua Error! Bookmark not defined 2.1.1 Giá trị dinh dưỡng 2.1.2 Đặc điểm thực vật cà chua 2.2 Tình hình sản xuất cà chua giới Việt Nam 2.2.1 Tình hình sản xuất cà chua nước 2.2.2 Tình hình sản xuất cà chua giới 2.3 Bệnh héo rũ cà chua 2.3.1 Triệu chứng nguyên nhân gây bệnh 2.3.2 Đặc điểm phát sinh, phát triển gây hại bệnh 10 2.3.3 Biện pháp phòng bệnh 10 2.4 Nghiên cứu bệnh héo rũ 11 2.4.1 Các nghiên cứu nước 11 2.4.2 Các nghiên cứu nước 12 2.5 Chỉ thị phân tử 15 2.5.1 Phân loại 16 2.5.2 Ứng dụng thị phân tử chọn giống thực vật 17 2.5.3 Chỉ thị phân tử SSR 18 2.5.3.1 Khái niệm thị phân tử SSR 18 iv 2.5.3.2 Phân loại thị phân tử SSR 19 2.5.3.3 Ưu, khuyết điểm phương pháp SSR 20 2.5.3.4.Ứng dụng microsatellite chọn tạo giống cà chua 20 2.6 Phương pháp PCR 21 2.6.1 Khái niệm 21 2.6.2 Nguyên tắc 21 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Thời gian địa điểm thực 22 3.2 Nguyên vật liệu 22 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 22 3.2.2 Nguồn vi khuẩn nhiễm bệnh 22 3.2.3 Hóa chất thí nghiệm 22 3.2.4 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm 23 3.3.1 Đánh giá tính kháng héo rũ mẫu giống cà chua thu thập 24 3.3.2 Phương pháp dánh giá kiểu gen 26 3.3.2.1 Quy trình ly trích DNA tổng số 26 3.3.2.2 Kiểm tra DNA tổng số điện di 26 3.3.2.3 Định lượng DNA máy đo quang phổ kế 27 3.3.2.4 Thực phản ứng PCR, xác định SSR cho kết đa hình 27 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4.1 Đánh giá kiểu hình tính kháng bệnh héo rũ mẫu giống cà chua 28 4.2 Xác định đa hình mẫu với SSR liên kết với gene kháng Bw4 bệnh héo rũ 29 4.2.1 Sản phẩm ly trích DNA tổng số 30 4.2.2 Tuyển chọn thị SSR cho phản ứng PCR 30 4.2.3 Thực phản ứng PCR, xác định SSR cho đa hình mẫu cà chua thu thập 32 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35 5.1 Kết luận 36 5.2 Đề nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 PHỤ LỤC v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism Ctv Cộng tác viên AVRDC Asian Vegetable Research and Development Center cM CentiMorgan CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide CtTNHH - TM Công ty nhiệm hữu hạn - thương mại ĐD Đơn Dương DI Disease incidence ĐT Đức Trọng dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate EB Extraction buffer EDTA Ethylene Diamine Tetra acetic Acid MAS Marker Assisted Selection NST Nhiễm sắc thể PCI Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol (25 : 24 : 1) PCR Polymerase Chain Reaction PVP Polyvidon QTL Quantitative Trait Loci RAPD Random Amplified Polymorphic DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism Rs Ralstonia solanacearum SDS Sodium Dodecyl Sulfat SSR Simple Sequence Repeat Ta Annealing temperature TE Tris - EDTA TZC Triphenyltetrazolium chloride vi DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần hóa học 100 g cà chua Bảng 2.2 Gen dự tuyển QTL 14 Bảng 2.3 Các loại thị phân tử 16 Bảng 3.1 Danh sách nòi phân lập 22 Bảng 3.2 Danh sách mẫu hạt giống đánh giá tính kháng .25 Bảng 3.3 Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR .27 Bảng 3.4 Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR 27 Bảng 4.1 Tính kháng bệnh mẫu giống cà chua 28 Bảng 4.2 Danh sách thị SSR làm thí nghiệm 32 vii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Cây cà chua Hình 2.2 Phần trăm sản lượng cà chua nước sản xuất (2009) Hình 2.3 Vườn cà chua nhiễm bệnh héo rũ vi khuẩn .8 Hình 2.4 Triệu chứng bệnh (a) dịch vi khuẩn thân; (b) rễ, (c) cây, (d) thân Hình 2.5 Các nước thành viên tham gia dự án giải trình tự hệ gene cà chua 13 Hình 2.6 Bản đồ QTL gen kháng bệnh héo rũ NST số 3, 4, 6, 7, 10 15 Hình 2.7 Chỉ thị phân tử kiểu gene A, B, C, D 16 Hình 2.8 So sánh (a) thị phân tử đồng trội (b) thị phân tử trội 17 Hình 4.1 Khuẩn lạc Ralstonia solanacearum môi trường TZC 29 Hình 4.2 DNA tổng số 14 mẫu cà chua nghiên cứu 30 Hình 4.3 Cơng cụ tìm kiếm marker SSR306 31 Hình 4.4 Nhiễm sắc thể số vùng 51cM - 71cM 31 Hình 4.5 Sản phẩm PCR với mồi SSR72 33 Hình 4.6 Sản phẩm PCR với mồi SSR306 33 Hình 4.7 Sản phẩm PCR với mồi SSR306 33 viii − Máy ly tâm (MiKRO 22R, eppendort 22331) − Bể ổn nhiệt ( Memmert - WNB22) − Tủ lạnh − Cân phân tích, ống đong, lò vi song − Micropipette (1 - 10 µl, 10 - 100 µl, 20 - 200 µl, 100 - 1000 µl) − Cối chày sứ − Các loại Tubes Plates sử dụng cho chạy PCR (0, - 1,5 ml) − Tube PCR ml − Aliquot µl − Tủ lạnh sâu - 20oC − Máy PCR, nguồn bồn điện di 3.3.1 Đánh giá tính kháng héo rũ mẫu giống cà chua thu thập Thu thập mẫu bệnh: mẫu bệnh thu thập vùng chuyên canh cà chua Đơn Dương, Đức Trọng Mỗi địa điểm chọn ruộng thu mẫu với triệu chứng bệnh điển bắt đầu héo non Phân lập tác nhân gây bệnh: Mẫu bệnh rửa vòi nước, khử trùng cồn 70 % để loại bỏ sinh vật biểu sinh Cắt nhỏ vết bệnh ngâm vào 10 ml nước tiệt trùng phút để vi khuẩn khuếch tán từ mô bệnh dung dịch nước, dung dịch chứa mẫu bệnh cấy trans môi trường chọn lọc TZC, đặt đĩa nhiệt độ phòng, sau 48 quan sát, chọn lọc khuẩn lạc Ralstonia solanacearum mọc riêng lẻ cấy chuyền tạo dòng Chủng bệnh: thí nghiệm bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên, lần lập lại, lần lặp lại Cà chua trồng khay xốp loại 32 hốc/khay Cà chua chủng bệnh giai đoạn - thật Dung dịch vi khuẩn nhân sinh khối môi trường lỏng NA (Nutrient broth g/L, nước cất 1L, pH 7,2) đạt mật số 108 CFU/ml Mỗi tưới vào gốc 10 ml dung dịch khuẩn Đánh giá tính mẫn cảm giống cà chua qua biểu triệu chứng héo 4, 7, 14 21 ngày sau chủng bệnh Cây cà chua bệnh phân lập lại so sánh tác nhân gây bệnh với vi khuẩn chủng bệnh ban đầu 24 Bảng 3.2 Danh sách mẫu hạt giống đánh giá tính kháng STT Tên thương mại Nguồn gốc F1 Safina 404 Ct cổ phần phát triển đầu tư nhiệt đới F1 TN457 Ct TNHH – TM Trang Nông Cà chua Cherry F1 TN 148 Ct TNHH – TM Trang Nông Cà chua Cherry F1 Red Crown 250 Ct cổ phần giống trồng miền Nam Nhập từ Đài Loan F1 Teminator Ct TNHH Sản xuất thương mại Xanh Nhập nội từ Pháp F1 TN 52 Ct TNHH – TM Trang Nông Nhập từ Ấn Độ F1 Mongal (T11) Ct TNHH Sản xuất thương mại Xanh Nhập nội từ Pháp F1 tropic Ct TNHH Sản xuất thương mại Xanh Nhập nội từ Pháp Red star F1 CN 345 Ct hạt giống Chia tai Sản phẩm Thái Lan 10 Seeda Tomato Ct hạt giống Chua Yong Seng Ct hạt giống Chiatai 11 F1 Caribo Ct TNHH Sản xuất thương mại Xanh Nhập nội từ Pháp 12 F1 TN 323 Ct TNHH – TM Trang Nông Nhập nội từ Pháp 15 F1 TG 105 CTS 386 Ct TNHH – TM Trang Nông Ct hạt giống Chiatai 18 Vimina Viện KHKTNN miền Nam Giống lai tạo Ghi Dữ liệu thu thập phân tích qua cơng thức Winstead Kelman, 1952: Mức 0: khơng có dấu hiệu Mức 1: bị héo Mức 2: hai bị héo Mức 3: ba đến bốn bị héo Mức 4: toàn bị héo Mức 5: chết DI = ×i )/ (N t ×5) ]×100% Ni: số thứ I tương ứng với mức phản ứng bệnh cấp thứ i N t : tổng số thí nghiệm Phản ứng bệnh: kháng ID < 10% Kháng trung bình ID = 10% - 20% Mẫn cảm ID = 21% - 40% Nhiễm ID >40% 25 3.3.2 Phương pháp dánh giá kiểu gen 3.3.2.1 Quy trình ly trích DNA tổng số − Nghiền mịn mẫu với nitơ lỏng cối chày cho vào tube 1,5 ml − Thêm 600 µl dung dịch washing buffer, lắc liên tục đá phút Sau li tâm lạnh 4oC 10.000 vòng/phút 10 phút, lấy phần cặn − Thêm 600 µl dung dịch extracting buffer, ủ 60oC 1giờ, lắc tay định kì − Thêm đồng lượng 600 µl Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol = 25:24:1, lắc mạnh phút, sau để yên nhiệt độ phòng phút − Ly tâm lạnh 4oC 10.000 vòng/phút 10 phút, lấy dịch sang tube − Thêm đồng lượng 600 µl Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol = 25:24:1, lắc mạnh phút, sau để yên nhiệt độ phòng phút − Ly tâm lạnh 4oC 10.000 vòng/phút 10 phút, lấy dịch sang tube − Cho vào 2/3 thể tích isopropanol, lắc đều, ủ - 20oC 1giờ, sau li tâm lạnh 4oC 10.000 vòng/phút 30 phút, bỏ isopropanol lấy phần cặn − Rửa cặn với ml ethanol 70%, sau ly tâm lạnh 10.000 vòng/phút phút, để khơ ethanol, hồ tan cặn 50 µl dung dịch bảo quản đệm TE, giữ - 200C 3.3.2.2 Kiểm tra DNA tổng số điện di DNA sau ly trích định tính phương pháp điện di gel agarose 1% Sau điện di gel, đoạn DNA phân tách tùy theo trọng lượng phân tử Chúng quan sát mắt thường nhờ kỹ thuật nhuộm màu với ethidium bromide chụp gel tia UV • Pha gel agarose với nồng độ 1%: Cân 0,125 g agarose cho vào 12,5 ml dung dịch TAE 0,5 X Đun sôi lò Viba bước sóng 650 W agarose tan hoàn toàn Để nguội đến khoảng 600C • Đổ gel, chờ agarose đông • Load mẫu vào giếng với tỷ lệ µl loading dye àl DNA mu Chy in di iu kiện 100 V, 250 mA, thời gian 20 phút • Nhuộm gel dung dịch ethidium bromide 10 mg/ml 20 phút, sau đưa vào máy Geldoc đọc kết Nếu mẫu có DNA băng DNA phát sáng dạng vạch gel điện di 26 3.3.2.3 Định lượng DNA máy đo quang phổ kế Các mẫu DNA ly trích sau định tính phương pháp điện di, kiểm tra độ tinh ước lượng hàm lượng DNA cách đo mật độ quang OD, với bước sóng 260 nm 280 nm máy quang phổ kế với độ pha lỗng 100 lần Hàm lượng DNA tính theo cơng thức: Hàm lượng DNA (ng/µl) = [(62,9 x OD 260nm ) – (36 x OD 280nm )] x 100 DNA xem tỉ số OD260nm/OD280nm nằm khoảng 1,8 đến 2,2 3.3.2.4 Thực phản ứng PCR, xác định thị SSR cho kết đa hình Bảng 3.3 Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian 95 5phút 95 phút Ta 45 giây 72 phút 72 10 phút 35 Giữ 40C Bảng 3.4 Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR Hóa chất Nồng độ sử dụng PCR buffer 1,25X MgCl 0,625 mM dNTP 0,2 mM Primer µM Taq polymerase 2,5U DNA mẫu 200 ng H2O Thêm vừa đủ 20 µl Sản phẩm PCR kiểm tra kích thước điện di gel agarose 2%, dung dịch đệm TBE 0,5X, hiệu điện 200V 50 phút Sau đó, gel ngâm dung dịch ethidium bromide 10 mg/ml 20 phút băng DNA quan sát tia UV 27 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Đánh giá kiểu hình tính kháng bệnh héo rũ mẫu giống cà chua Bảng 4.1 Tính kháng bệnh mẫu giống cà chua STT Tên giống Isolate vi khuẩn RsĐT6 RsĐT3 RsĐD1 F1 Safina 404 + + ++ F1 TN457 - + - F1 TN 148 - + - F1 Red Crown 250 + + ++ F1 Teminator - F1 TN 52 - + - F1 Mongal (T11) + + ++ F1 Tropic - ++ ++ Tomato - ++ + 10 Seeda Tomato - - - 11 F1 Caribo - - ++ 12 F1 TN 323 + ++ ++ 15 F1 TG 105 CTS 386 + + ++ 18 Vimina +++ +++ +++ ++ (+++: kháng ; ++: kháng trung bình; +: mẫn cảm; ++ - : nhiễm) Kết bảng 4.1 cho thấy giống 18 giống kháng, kháng với nòi vi khuẩn giống 10 giống nhiễm, nhiễm với nòi vi khuẩn Nòi RsĐT6 có giống 1, 4, 7, 12, 15 mẫn cảm giống 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11 nhiễm, RsĐT3 giống 5, 8, 9, 12 kháng trung bình, giống 1, 2, 3, 4, 6, 7, 15 mẫn cảm giống 11 nhiễm cuối RsĐD1 có giống 1, 4, 5, 6, 7, 8, 11, 12 kháng trung bình, giống 9, 15 mẫn cảm giống 2, nhiễm Vi khuẩn gây bệnh héo rũ Việt Nam tìm thấy nòi với nòi phân lập khác mức kháng mẫu giống thay đổi Trên mơi trường chọn lọc TZC dùng phân biệt dòng vi khuẩn độc không độc, vi khuẩn Ralstonia solanacearum có đặc điểm hình thái khuẩn lạc màu hồng đến đỏ 28 nhạt, rìa khuẩn lạc có màu trắng kem, khuẩn lạc nhầy môi trường đặc điểm phân biệt dòng có độc tính cao dòng khơng độc Đối với khuẩn lạc có màu tím sậm mơi trường TZC, xung quanh khuẩn lạc khơng có màu trắng kem dòng khơng độc Có dòng độc gây bệnh cà chua RsĐD1, RsĐT6, RsĐT3 A B C Hình 4.1 Khuẩn lạc Ralstonia solanacearum môi trường TZC (A),(B)khuẩn lạc đơn mơi trường TZC; (C) cấy chuyền tạo dòng 4.2 Xác định đa hình mẫu với SSR liên kết với gene kháng Bw4 bệnh héo rũ 4.2.1 Sản phẩm ly trích DNA tổng số Hình 4.1 cho thấy quy trình ly trích DNA phù hợp band DNA rõ chứng tỏ ly trích có DNA, tạp ít, ly trích 14 mẫu giống đánh số thứ tự hình tương ứng tên giống bảng 4.1 trước Sau cắt cân mẫu xong, mẫu phải giữ lạnh N lỏng chất lượng DNA ly trích tốt Dịch trích EB bảo quản thường có tượng kết tủa (do có chứa CTAB) ảnh hưởng đến kết ly trích Do đó, cần ủ dung dịch EB 650C 15 phút trước sử dụng Nghiền mẫu thành bột mịn, nghiền tay, không nghiền mạnh để tránh làm đứt gãy DNA Khi nghiền xong phải cho mẫu vào eppendorf để tránh tượng mẫu bị tan chảy ảnh hưởng đến kết ly trích Dịch trích EB phải cho vào eppendorf có chứa mẫu lấy khỏi N lỏng Sau thêm phenol : chloroform : isoamylalcohol (25 : 24 : 1) vào phải lắc ly tâm ngay, để lâu DNA bị gãy Khi chuyển lấy dịch trong, cần cẩn thận tránh lấy phạm vào phần tạp phía dưới, khơng độ tinh khơng cao Khi phơi khô cặn cần lưu ý, để khơ làm hỏng DNA, ethanol ảnh hưởng xấu đến DNA trình bảo quản phản ứng PCR 29 Hình 4.2 DNA tổng số 14 mẫu cà chua nghiên cứu 4.2.2 Tuyển chọn thị SSR cho phản ứng PCR Bắt đầu từ thập niên 1980, nhiều loại thị phân tử khác phát triển cà chua như: RFLP, SSR, CAPs, AFLP SNP, RFLP thị tạo Hiện nay, có 15000 thị sưu tập trang web www.solgenomics.net, nơi có cơng cụ chun biệt “marker search” cho việc tìm kiếm thị định vị đồ Chỉ thị tìm kiếm tên, vị trí nhiễm sắc thể, quần thể lập đồ Hiện nay, có nhiều loại thị phân tử dùng để nghiên cứu di truyền, lập đồ gen đáng ý thị SSR Chỉ thị SSR có khả ứng dụng tốt chọn giống, nghiên cứu di truyền nhờ đặc tính đồng trội (biểu alen trội lặn), đồng phân ly, cho đa hình cao, khả tái sử dụng cao, có biến thiên đa alen thực công đoạn cắt enzyme sau phản ứng PCR 30 Hình 4.3 Cơng cụ tìm kiếm thị SSR306 (http://solgenomics.net/search/direct_search.pl?search=markers) Hình 4.4 Chỉ thị SSR306 vùng 51cM – 71cM NST (www.sgn.cornell.edu) 31 Khảo sát thị SSR nhiễm sắc thể số 4, số số 10 Dựa vùng nhiễm sắc thể số 4, 7, 10 này, thu thập 10 thị Bảng 4.2 Danh sách thị SSR làm thí nghiệm Vị trí NST Chỉ thị SSR72 SSR296 SSR43 SSR306 SSR52 SSR276 10 SSR526 10 SSR318 10 SSR360 10 SSR85 Trình tự F-GGTTCCCTTCTCTCTTTGTCC R-GCGTGTTCTTCGATTTGACA F-CCGGAACAAGTCCCTTCATA R-TCAGCCAAGTTCATGGTACATC F-CTCCAAATTGGGCAATAACA R-GCGATGAGGATGACATTGAG F-ACATGAGCCCAATGAACCTC R-AACCATTCCGCACGTACATA F-TGATGGCAGCATCGTAGAAG R-GGTGCGAAGGGATTTACAGA F-CTCCGGCAAGAGTGAACATT R-CGACGGAGTACTTCGCATTT F-AGGGTCCTTCGTTTGGAACT R-GCATTCCACTTGTGAAGCAT F-GCAGAGGATATTGCATTCGC R-CAAACCGAACTCATCAAGGG F-ATCAGCCCTTCCACTGATTG R-TAAGCAACCACCAATGTTCA F-ATCCGTTAGCTATTGTGCCG R-TTGCCATGCACTTATCTTCG Ta 50 48 42 48 50 50 48 50 45 48 4.2.3 Thực phản ứng PCR, xác định SSR cho đa hình mẫu cà chua thu thập Xác định tính đa hình 14 mẫu nghiên cứu đánh số tương ứng bảng 3.2 Trong 14 mẫu, tất cho band có kích thướt 182bp, với giống kháng 18 giống nhiễm 10, thị SSR72 khơng đa hình khơng phân biệt kiểu gen hay khác biệt kích thướt alen khơng có ý nghĩa nghiên cứu 32 Hình 4.5 Sản phẩm PCR với mồi SSR72 Hình 4.6 Sản phẩm PCR với mồi SSR306 Hình 4.7 Sản phẩm PCR với mồi SSR306 33 Xác định tính đa hình 14 mẫu nghiên cứu với thị SSR306 NST số hình 4.6 4.7 có thay đổi thứ tự mẫu, hình 4.6 mẫu 9, 10 band mờ, mẫu 11 khơng có sản phẩm Hình 4.7 tất mẫu band sáng trừ mẫu 11 band mờ Gọi M allen thị SSR306 với kích thướt 290bp m allen với kích thướt 258bp Gen kháng Bw4, B allen trội qui định tính kháng, b allen lặn khơng qui định tính kháng Phản ứng PCR, giống kháng 18 giống nhiễm 10, kết hợp bảng 4.1 đánh giá tính kháng bệnh giống kháng, mẫu 18 kháng với nòi RsĐT6 cho band kích thướt 290bp chứng tỏ allen M thị liên kết allen B, qui định tính kháng , mẫu 2, 3, 5, 6, 8, 9, 10, 11 cho band kích thướt 258bp, nhiễm nòi RsĐT6 chứng tỏ allen m liên kết allen b, allen b khơng qui định tính kháng , mẫu 1, 4, 7, 12, 15 cho band kích thước 258bp 290bp mẫn cảm với nòi RsĐT6 có kiểu gen dị hợp Bb Gen kháng nằm allen trội allen B ảnh hưởng nhiều đến tính kháng, xuất allen b kiểu gen dị hợp Bb làm giảm tính kháng bệnh, allen trội B có tác động kháng RsĐT6 nhiều Gen kháng Bw4 NST4 tạo tính kháng chuyên biệt RsĐT6 Với isolate RsĐD1, RsĐT3, trừ mẫu số 10 nhiễm nòi phân lập, mẫu 11 mang kiểu gen bb nhiễm nòi RsĐT6 RsĐT3, mẫu 2, 3, 5, 6, 8, mang kiểu gen bb nhiễm RsĐT6 kháng trung bình mẫn cảm RsĐT3 Tương tự, nòi RsĐD1 mẫu 2, mang kiểu gen bb nhiễm nòi RsĐT6 RsĐD1, mẫu 5, 6, 8, 9, 11 mang kiểu gen bb nhiễm RsĐT6 kháng trung bình mẫn cảm RsĐD1 Gen kháng không liên kết locus thị SSR306, gen kháng Bw4 khơng có tác động nòi RsĐT3, RsĐD1 tính kháng RsĐT3, RsĐD1 ngồi chịu ảnh hưởng gen kháng Bw4 chịu tác động gen kháng khác Có nhiều nghiên cứu liên quan đến nòi vi khuẫn héo rũ đặc tính hóa sinh học vi khuẩn héo rũ Các nòi vi khuẩn sử dụng thí nghiệm đánh giá tính kháng thu thập từ Lâm Đồng Tp Hồ Chí Minh vùng trồng cà chua phổ biến Nam Việt Nam Trong nòi thu thập được, xác định nòi khơng gây độc tính nòi gây độc tính (virulent) sử dụng lây nhiễm nhân tạo để đánh giá kiểu hình tính kháng cho giống cà chua thu thập Giải thích mối quan hệ ký sinh ký chủ tính kháng không tương hợp trồng nguồn bệnh 34 Khái niệm gene đối gene sau: thiên nhiên, tương ứng với gene điều khiển tính kháng nhiễm bệnh kí chủ, ln ln có gene điều khiển tính gây bệnh yếu mạnh kí sinh Nói cách khác, kí sinh kí chủ ln có mối tác động qua lại lẫn gene bổ thể (Flor H.H, 1971) Như vậy, gene gây bệnh mạnh hay yếu kí sinh nhận có tương tác với gene nhiễm kháng bệnh giống kí chủ tương ứng Và ngược lại, gene kháng bệnh nhiễm bệnh giống nhận tương tác với dòng sinh lý tương ứng kí sinh Tuy nhiên, tương quan phù hợp trường hợp kí sinh có tính chun biệt cao kí sinh bắt buộc khơng áp dụng với kí sinh khơng chun tính Đánh giá kiểu hình theo mơ hình chuẩn quan trọng không cho nghiên cứu QTL, xác định marker phân tử định đến việc tìm xác gene mục tiêu quan tâm mà ứng dụng lai tạo cải thiện giống trồng Trong nghiên cứu này, marker phân tử liên kết với gene kháng xác định SSR306 làm sở cho nghiên cứu ứng dụng marker phân tử cải thiện giống kháng 35 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận - Giống số 18 Vimina giống kháng, kháng với nòi vi khuẩn, giống 10 Seeda Tomato giống nhiễm, nhiễm với nòi vi khuẩn, giống số 2, 3, 5, 6, 8, 9, 10, 11 nhiễm RsĐT6, mẫn cảm kháng trung bình RsĐD1,RsĐT, giống số 1, 4, 7, 12, 15 kháng trung bình mẫn cảm RsĐT6, mẫn cảm kháng trung bình RsĐD1,RsĐT3 - Qua tuyển chọn marker NST số 4, 7,10, xác định locus marker SSR306 liên kết gen kháng Bw4 NST4 cho đa hình mẫu 1, 4, 7, 12, 15, 18 kháng chuyên biệt RsĐT6 5.2 Đề nghị - Isolate thu thập vùng trồng cà chua trọng điểm Đơn Dương Đức Trọng nên tìm thêm isolate vùng có isolate khác nhau, tác động khác Từ đó, tìm giống phù hợp kháng với isolate phân lập vùng - Xem xét gen kháng NST khác, đặc biệt NST số 6, gen kháng ổn định kháng với nhiều nòi, từ đánh giá đầy đủ xác tác động gen kháng với isolate RsĐD1,RsĐT3, RsĐT6 - Ứng dụng phương pháp MAS tìm thêm giống cà chua kháng bệnh héo rũ 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bùi Chí Bửu, 2002 Cơ sở di truyền tính kháng sâu bệnh hại trồng Nhà xuất Nông Nghiệp Tp Hồ Chí Minh Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2004 Di truyền phân tử Nhà xuất Nông Nghiệp Tp Hồ Chí Minh Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002 Sinh học phân tử Nhà xuất Giáo Dục Kết nghiên cứu đề tài chương trình giống trồng, vật nuôi, giai đoạn 2001 – Nghiên cứu chọn tạo, công nghệ nhân giống kỹ thuật thâm canh số giống rau chủ yếu Nguyễn Văn Viên – Đỗ Tấn Dũng, 2008 Bệnh hại cà chua Nấm, Vi khuẩn biện pháp phòng chống Nhà xuất Nơng Nghiệp Tp Hồ Chí Minh Phạm Hồng Cúc, 2008 Cây cà chua Nhà xuất Nơng Nghiệp Tp Hồ Chí Minh Tạ Thị Thu Cúc, 1979 Giáo trình trồng rau Nhà xuất Nông Nghiệp Hà Nội Trương Quốc Ánh, 2009 Nghiên cứu tính đa hình di truyền số giống cà chua nhờ dấu chuẩn phân tử nhằm xác định nguồn nguyên liệu kháng bệnh héo rũ vi khuẩn Ralstonia solanacearum Thuyết minh đề tài nghiên cứu khoa học công nghệ Vũ Triệu Mân – Lê Lương Tề, 2001 Giáo trình bệnh nơng nghiệp Nhà xuất Nông Nghiệp Hà Nội TÀI LIỆU TIẾNG ANH Panet A and Khorana HG, 1974 Studied on polynucleotides The linkage of deoxyribopolynucleotide templates to cellulose and its use in their replication.J Biol.Chem 294: 5231 – 522 Mangin B, Thoquet P, Olivier J, and N H Grimsley, 1996 Temporal and multiple quantitative trait loci analyses of resistance to Bacterial wilt in tomato permit the resolution of linked loci Genetics, 151: 1165 – 1172 Danesh D, Aarons S, G E McGill, and N D Young, 1994 Genetic dissection of oligogenic resistance to bacterial wilt in tomat Molecular Plant-Microbe Interaction, 7: 464 - 471 Majid R Foolad, 2007 Genome Mapping and Molecular Breeding of Tomato Published by Hindawi Publishing Corporation, International, Journal of Plant Genomics: 16 Wang J F, Chen, Hanson, Licardo, P.M, Hanudin, 1998 Diallel Analysis of Bacterial Wilt Resistance in Tomato deriverd from different sources 82: 74 – 78 Subramaniam Geethanjali , Kai-Yi Chen, Davidson V Pastrana, Jaw-Fen Wang, 2010 Development and characterization of tomato SSR markersfrom genomic sequences of anchored BAC clones on chromosom : - Esquinas-Alcazar, 1981 Genetic resources of tomatoes and wild relatives: a global report: 37 10 11 12 13 14 15 16 Ensminger, M.E, Oldfield, J.L Heinemann, 1990 Feedsand Nutrition Publishing Co, USA:3 - 17 French, Martin, 1979 Progess in the integrated control of bacterial wilt Published in Peru : 90 – 100 Collard, Jahufer, Brouwer and Pang, 2005 An introduction to markers, Quantitative Trait Loci (QTL) mapping and marker – assisted selection for crop improvement: The Basis Concepts Euphytica 142: 169 – 196 Hayward, A.C 1991 Biology and epidemiology of bacterial wilt caused by Pseudomonas solanacearum Annu Rev Phytopathol 29:65-87 Kleppe, K.E et al (1971) Studies on polynucleotides XCVI:repair replication of short synthetic DNAs as catalyzed by DNA polymerase J Mol Biol 56: 341-61 Rogers SO, Bendich AJ, 1988 Extraction of DNA from plant tissues Plan Molecular Biology Manual 46: – 10 Maharaj K Razdan, Autar K Mattoo, 2007 Genetic improvement of Solanaceous Crops Published by Science Publishers, Enfield, NH, USA An imprint of Edenbridge Ltd , printed in India 2: 414-418 Patricia Stevens , Jan Dirk van Elsas, 2010 A putative genomic island, PGI-1, in Ralstonia solanacearum biovar revealed by subtractive hybridization :4 - 10 Rajput S.G.1, Wable K.J.2, Sharma K.M.1 , Kubde P.D.2 and Mulay S.A, 2005 Reproducibility testing of RAPD and SSR markers in Tomato : – TÀI LIỆU TỪ INTERNET 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 www.bio.davidson.edu www.vegetable-garden-guide.com www.researchingchina.com http://isa-cnsh.org http://isuagcenter.com www.diggingri.wordpress.com/2009/08/ www.faostat.fao.org www.sgn.cornell.edu/solanaceae - project www.solgenomics.net/ www.tradewindsfruit.com Nattaya Srisawad, Chataporn chunwongse, Julapark Chunwongse Population structure and association mapping of bacterial wilt resistance in tomato www sol-symposium2011.com/sci/18 - 6.pdf 38 ... phong phú, cà chua không giúp hộ nông dân nâng cao thu nhập, cải thi n đời sống mà giúp phần cải thi n bữa ăn, thỏa mãn nhu cầu vitamin thi t yếu chất khoáng chủ yếu, tạo rau cho gia đình sống thành... có loài hoang dại Các dạng dại thường thi u tính trạng cần thi t cho nhu cầu người, thường cho suất thấp, chất lượng Để hạn chế hàng loạt gene không cần thi t kèm với số gene cần q trình lai... làm héo, chết bị thi u nước (Wang.J.F ctv, 1998) 2.3.2 Đặc điểm phát sinh, phát triển gây hại bệnh Ảnh hưởng môi trường: vi khuẩn thích hợp nhiệt độ 30 - 370C, nhiệt độ tối thi u 100C, tối đa