NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC LOÀI TRE VIỆT NAM BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC LOÀI TRE VIỆT NAM BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : NGUYỄN ANH TÍN Niên khóa : 2007 – 2011 Tháng 7/2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC LOÀI TRE VIỆT NAM BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS DIỆP THỊ MỸ HẠNH NGUYỄN ANH TÍN ThS TRƯƠNG QUỐC ÁNH Tháng 7/2011 LỜI CẢM ƠN Con muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ người thân gia đình ln chỗ dựa vững cho tạo điều kiện cho học tập tốt Cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, Bộ mơn Cơng nghệ Sinh học tạo điều kiện cho suốt thời gian học tập trường Xin chân thành cảm ơn nhóm thực đề tài “Nghiên cứu tính đa dạng di truyền quần thể tre Việt Nam giá trị ứng dụng chúng” bao gồm chủ nhiệm đề tài TS Diệp Thị Mỹ Hạnh, ThS Trương Quốc Ánh, chị Cao Minh Thùy Nguyên, Nguyễn Bích Loan, Nguyễn Hà Phương anh chị thuộc phòng nghiên cứu Công nghệ Sinh học thuộc Viện Khoa học Kỹ thuật Nơng nghiệp miền Nam tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, bảo thời gian thực luận văn tốt nghiệp Cảm ơn tồn thể lớp Cơng nghệ Sinh học niên khóa 2007 – 2011 giúp đỡ động viên suốt bốn năm qua Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2011 Nguyễn Anh Tín i TÓM TẮT Tre phân bố khắp nơi giới, có Việt Nam, với loạt chi khác phù hợp với vùng sinh thái khác Chúng có nhiều ứng dụng sống với tầm quan trọng cao mặt kinh tế giữ nhiều vai trò hệ sinh thái nên cần thiết phải có nỗ lực nghiêm túc để bảo tồn đa dạng tre Tuy nhiên, việc bảo tồn tre phương pháp ex-situ chưa lựa chọn khả thi Những thành tựu sinh học phân tử đại ngày mang lại nhiều cơng cụ mạnh, nhanh chóng xác để phân loại thực vật đóng vai trò quan trọng nghiên cứu đa dạng di truyền phục vụ công tác bảo tồn sử dụng nguồn gene có hiệu Trong đó, hệ thống thị phân tử cho thấy tính đặc hiệu việc phân biệt định danh cá thể dựa đa hình kiểu gene chúng Một thị phân tử thường sử dụng trồng thị Simple Sequence Repeat (SSR) nhờ ưu điểm trội dễ sử dụng tần số biến dị cao Chính thế, đề tài thực để hiểu rõ mối quan hệ di truyền loài tre Việt Nam, phân bố mức độ đa dạng di truyền, từ làm sở cho cơng tác bảo tồn sử dụng có hiệu Kết phân tích mối quan hệ di truyền hai mươi hai mẫu tre dựa chín thị SSR chọn lọc cho thấy hai mươi hai mẫu tre chia làm bốn nhóm di truyền với khoảng cách di truyền bốn nhóm 0,35 Hệ số tương đồng dao động từ 0,44 đến 0,96 với giá trị trung bình tương đối cao 0,65 Chín thị SSR hữu ích việc phân biệt tính đa hình bảy lồi tre thuộc chi Bambusa Chi Dendrocalamus có biến dị lớn chi Gigantochloa cho thấy tính đa dạng thấp Kết chứng tỏ mối quan hệ gần gũi hai chi Bambusa Gigantochloa Chi Neohouzeaua chi Pseudostachyum có mối quan hệ gần gũi với với chi Schizostachyum Tuy nhiên thị lại cho thấy hạn chế việc đánh giá đa dạng di truyền tre mọc rải tre mọc cụm ii SUMMARY Thesis title: Analysis of genetic diversity of bamboo collection in Vietnam by SSR markers Bamboos are distributed throughout the world, including Vietnam, with a variety of different genera adapted to different ecological zones As economically and ecologically important plants, they merit serious attempts to conserve their diversity However, ex-situ conservation has yet to be a viable option Advances in modern molecular biology providing powerful, prompt and accurate tools for a more objective classification will assist effective conservation measures and efficient use of genetic resources Especially, many molecular marker systems have revealed high specificities in plant taxonomy based on their genetic polymorphisms Microsatellites or Simple Sequence Repeats (SSRs) with obvious advantages for crop species, such as ease of use and high levels of simply inherited variation, are one of the most favorable molecular markers For these reasons, this study was conducted to better understand relationships between bamboo species from different regions of Vietnam as well as the distribution and extent of their genetic diversity so that the genetic diversity of Vietnamese bamboo can be safely conserved and efficiently used The result of analysis of genetic relationships among twenty two bamboo accessions based on nine SSR markers were constructed into a UPGMA dendrogram that split the twenty two accessions into four main groups with a genetic distance of 0,35 Similarity coefficients between accessions ranged from 0,44 to 0,96 with a relatively high average of 0,65 These SSR markers were useful in determining genetic diversity among the seven Bambusa species The five Dendrocalamus species showed a wide variation while the genus Gigantochloa was genetically less diverse The results also found a close relationship between the genera Bambusa and Gigantochloa Two genera Neohouzeaua and Pseudostachyum showed a higher affinity to each other than did genus Schizostachyum However, these SSR markers showed limitations in assessing genetic diversity between running and clumping bamboos Keywords: bamboo, conservation, genetic diversity, SSRs (microsatellites) iii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn .i Tóm tắt ii Summary iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt vi Danh sách bảng vii Danh sách hình viii Chương Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Nội dung thực .3 Chương Tổng quan tài liệu 2.1 Cơ sở khoa học tre .4 2.1.1 Phân loại khoa học 2.1.2 Hình thái học sinh lý học 2.2 Vai trò tre 12 2.3 Đa dạng di truyền đa dạng sinh học 14 2.3.1 Khái niệm 14 2.3.2 Ý nghĩa đa dạng di truyền nghiên cứu đa dạng di truyền 14 2.4 Chỉ thị phân tử 15 2.4.1 Khái niệm 15 2.4.2 Chỉ thị phân tử SSR 17 2.5 Giới thiệu kỹ thuật PCR 21 2.5.1 Khái niệm PCR 21 2.5.2 Nguyên tắc phản ứng PCR 21 2.5.3 Các thành phần cần thiết phản ứng PCR 22 2.5.4 Các bước phản ứng PCR 23 2.6 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền lồi tre 25 Chương Vật liệu phương pháp nghiên cứu 27 iv 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 27 3.2 Vật liệu .27 3.2.1 Các mẫu tre dùng nghiên cứu 27 3.2.2 Hóa chất dùng thí nghiệm 28 3.2.3 Thiết bị thí nghiệm 30 3.3 Phương pháp nghiên cứu 30 3.3.1 Ly trích DNA 30 3.3.2 Kiểm tra DNA sau tinh .31 3.3.3 Phản ứng PCR 32 3.3.4 Điện di sản phẩm PCR 33 3.3.5 Thu thập xử lý số liệu 33 Chương Kết thảo luận 35 4.1 Sản phẩm DNA tổng số sau ly trích .35 4.2 Phát đa hình thị phân tử SSR 36 4.3 Đánh giá tương đồng di truyền thị phân tử SSR 40 4.4 Phân nhóm di truyền giản đồ hình 40 Chương Kết luận đề nghị 47 5.1 Kết luận 47 5.2 Đề nghị .48 Tài liệu tham khảo 49 v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AFLPs: Amplified Fragment Length Polymorphisms ALP: Amplicon Length Polymorphisms bp (unit): base pair CAPS: Cleaved Amplified Polymorphic Sequences cpSSRs: Chloroplastic Simple Sequence Repeats DNA: Deoxyribonucleic acid DNase: Deoxyribonuclease dNTPs: Deoxynucleoside triphosphate EST-SSR: Express Sequence Tags – Simple Sequence Repeat ISA: Inter-Simple sequence repeat Amplification MAB: Marker-assisted backrossing MAS: Marker-assisted selection mtSSRs: Mitochondrial Simple Sequence Repeats nuSSRs: Nuclear Simple Sequence Repeats OD: Optical Density (absorbance) PCR: Polymerase Chain Reaction PIC: Polymorphic Information Content QTLs: Quantitative trait loci RAPDs: Random Amplified Polymorphic DNAs RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism RNase: Ribonuclease SCARs: Sequence Characterized Amplified Regions SNPs: Single Nucleotide Polymorphisms SSRs: Simple Sequence Repeats (microsatellite) STS: Sequence-Tagged Sites Ta: Annealing Temperature Tm: Melting Temperature UV: Ultraviolet vi DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Một số loại thị phân tử 16 Bảng 2.2 So sánh ứng dụng thị phân tử đánh giá đa dạng di truyền 17 Bảng 2.3 Phân loại thị SSR 19 Bảng 3.1 Tên 22 mẫu tre dùng nghiên cứu 27 Bảng 3.2 Trình tự nhiệt độ bắt cặp cặp mồi SSR dùng đề tài 29 Bảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR 32 Bảng 3.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR .32 Bảng 3.5 Thông số điều kiện điện di 33 Bảng 4.1 Giá trị OD 22 mẫu DNA sau ly trích dùng để chạy PCR 36 Bảng 4.2 Tổng số phân đoạn hình thành 22 mẫu DNA với mồi SSR .37 Bảng 4.3 Bảng mô tả đặc điểm locus SSR 39 Bảng 4.4 Hệ số tương đồng 22 mẫu tre nghiên cứu .45 vii DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Thân ngầm mọc rải Hình 2.2 Thân ngầm mọc cụm Hình 2.3 Tre mọc rải Hình 2.4 Tre mọc cụm, chi Bambusa Hình 2.5 Rễ tre đặc trưng chi Phyllostachys Hình 2.6 Thân tre với màu sắc khác Hình 2.7 Hoa tre 11 Hình 2.8 Phản ứng PCR .24 Hình 4.1 Kết điện di 22 mẫu tre sau ly trích 35 Hình 4.2 Kết điện di sản phẩm PCR 22 mẫu tre với mồi Boes-5 38 Hình 4.3 Kết điện di sản phẩm PCR 22 mẫu tre với mồi Boes-7 38 Hình 4.4 Kết điện di sản phẩm PCR 22 mẫu tre với mồi Boes-11 38 Hình 4.5 Giản đồ hình mô tả quan hệ di truyền 22 mẫu tre 46 viii Bảng 4.1 Giá trị OD 22 mẫu DNA sau ly trích dùng để chạy PCR Mẫu Nồng độ (mg/ml) OD260nm/OD280nm Nồng độ Mẫu (mg/ml) OD260nm/OD280nm 188,7425 1,9064 51 179,0095 1,8557 147,9827 1,8403 55 178,7128 1,9095 15 135,0485 1,7164 62 181,7753 1,8468 17 179,1510 1,8615 71 153,1650 1,7754 18 127,6937 1,5916 83 141,3326 1,7893 19 182,7383 1,8689 85 155,2272 1,7023 28 145,6085 1,8279 88 184,1607 1,8073 31 182,8361 1,9058 89 194,7053 1,8835 34 185,4286 1,8721 90 180,7137 1,6995 43 191,3571 1,8963 101 154,7883 1,6587 45 138,0794 1,7268 tvr 193,9302 1,7836 4.2 Phát đa hình thị phân tử SSR Sản phẩm DNA tổng số hai mươi hai mẫu tre sau ly trích tiến hành khuếch đại thông qua phản ứng PCR với cặp mồi SSR Tổng số có chín cặp mồi SSR (Boes-3, Boes-4, Boes-5, Boes-6, Boes-7, Boes-8, Boes-11, Boes12, Boes-13) sử dụng đề tài nhằm phân tích đa dạng di truyền loài tre Việt Nam Mức độ đa dạng di truyền đánh giá thơng qua phân tích hệ số tương đồng mẫu mối quan hệ di truyền lồi thể thơng qua giản đồ hình Kết chạy PCR hai mươi hai mẫu DNA với chín cặp mồi SSR thể bảng 4.2 cho thấy có tổng số 434 phân đoạn rõ nét hình thành, trung bình cặp mồi cho 48,2 phân đoạn 100% phân đoạn đa hình Trong đó, mồi Boes-3 cho số phân đoạn nhiều 80 phân đoạn qua hai mươi hai mẫu Mồi Boes7 cho số phân đoạn 27 phân đoạn qua hai mươi hai mẫu Số phân đoạn mẫu qua chín mồi SSR có khác đáng kể Mẫu ký hiệu 83 101 cho số phân đoạn nhiều 36 phân đoạn qua chín mồi Trong đó, mẫu 62 cho phân đoạn nhất, hình thành phân đoạn với chín mồi SSR sử dụng đề tài 36 Bảng 4.2 Tổng số phân đoạn hình thành 22 mẫu DNA với mồi SSR Mồi B3 B4 B5 B6 B7 B8 B11 B12 B13 Tổng 0 9 4 3 17 15 1 1 29 17 1 20 18 2 30 19 2 31 28 3 27 31 1 2 13 34 2 1 3 23 43 3 0 45 0 0 1 51 2 1 55 5 4 34 62 1 1 71 3 5 26 83 3 36 85 0 0 88 4 35 89 0 90 0 0 101 2 4 36 tvr 0 21 Tổng 80 28 73 48 27 31 33 47 67 434 Mẫu 37 Hình 4.2 Kết điện di sản phẩm PCR 22 mẫu tre với mồi Boes-5 Các ký tự 3, 9, 15, 17, 18… mã số mẫu, L thang chuẩn với kích thước thích bên cạnh Hình 4.3 Kết điện di sản phẩm PCR 22 mẫu tre với mồi Boes-7 Các ký tự 3, 9, 15, 17, 18… mã số mẫu, L thang chuẩn với kích thước thích bên cạnh Hình 4.4 Kết điện di sản phẩm PCR 22 mẫu tre với mồi Boes-11 Các ký tự 3, 9, 15, 17, 18… mã số mẫu, L thang chuẩn với kích thước thích bên cạnh 38 Bảng 4.3 Bảng mơ tả đặc điểm locus SSR Trong báo Mồi Trong đề tài Shamrma ctv (2008) Số allele Kích thước (bp) Số allele Kích thước (bp) Phần trăm allele đa hình (%) B3 140 – 180 150 – 1000 100 B4 240 – 280 130 – 600 100 B5 310 – 350 13 100 – 850 100 B6 10 210 – 250 250 – 1000 100 B7 150 – 1000 150 – 1000 100 B8 90 – 95 90 – 600 100 B11 300 – 340 200 – 950 100 B12 240 – 260 180 – 350 100 B13 150 – 170 10 90 – 500 100 Phân tích đa dạng di truyền locus SSR cho thấy số allele khuếch đại dao động từ năm allele đến mười ba allele với giá trị trung bình 7,56 allele locus Trong đó, locus Boes-11 xuất allele với năm allele locus Boes-5 xuất nhiều allele với mười ba allele Tất chín locus SSR nghiên cứu cho 100% allele đa hình Hầu hết allele khuếch đại có kích thước dao động lớn từ 90 đến 600 bp Tuy nhiên, xuất allele với kích thước 600 bp locus Boes-3, Boes-5, Boes-6, Boes-7, Boes-11 Tổng số allele locus phạm vi kích thước allele ghi nhận nghiên cứu số liệu tương ứng báo cáo nghiên cứu Sharma ctv (2008) có khác đáng kể (số liệu mô tả bảng 4.3) Từ kết thu cho thấy, sáu số chín locus phân tích (Boes-3, Boes-4, Boes-5, Boes-8, Boes-12, Boes-13) tương đối đa hình xuất nhiều allele (sáu đến mười ba allele) phạm vi kích thước allele rộng Phạm vi kích thước sản phẩm PCR locus không mong đợi (chênh lệch độ dài allele ngắn allele dài dao động từ 170 đến 850 bp) Sự khác biệt số lượng allele locus phạm vi kích thước allele xuất phát từ khác biệt mẫu tre sử dụng nguồn gốc 39 chúng Ngoài ra, hạn chế dễ dàng nhận thấy đề tài việc điện di sản phẩm PCR gel agarose Độ phân giải loại gel không cho phép phân biệt allele sai khác vài nucleotide Điều ảnh hưởng đến số allele phát q trình phân tích 4.3 Đánh giá tương đồng di truyền thị phân tử SSR Hệ số tương đồng di truyền hai mươi hai mẫu tre nghiên cứu dao động từ 0,44 đến 0,96 với giá trị trung bình 0,65 (bảng 4.4) Theo kết này, hai mẫu với ký hiệu 18 19 có khoảng cách di truyền gần với hệ số tương đồng 0,96 Trong đó, hai mẫu 55 90 có khoảng cách di truyền tương đối xa với hệ số tương đồng thấp 0,44 4.4 Phân nhóm di truyền giản đồ hình Kết phân nhóm di truyền theo phương pháp UPGMA hai mươi hai mẫu tre nghiên cứu khoảng cách di truyền nhóm thể giản đồ hình (hình 4.5) Hai mươi hai mẫu tre chia làm bốn nhóm với độ tương đồng bốn nhóm 65%  Nhóm gồm hai mẫu 55 101 với độ tương đồng 79%  Nhóm gồm sáu mẫu 15, 18, 19, 28, 83 88, chia làm hai nhóm (2.1 2.2) với độ tương đồng 67%  Nhóm 2.1 gồm hai mẫu 83 88 với độ tương đồng cao 78%  Nhóm 2.2 gồm bốn mẫu 15, 18, 19, 28 Trong đó, hai mẫu 18 19 có khoảng cách di truyền gần xếp vào nhóm nhỏ với độ tương đồng cao 96% Đây độ tương đồng cao tổng số hai mươi hai mẫu tre phân tích Hai mẫu 28 15 có độ tương đồng 71,5% 70% với nhóm nhỏ (18, 19)  Nhóm gồm mẫu 71  Nhóm gồm mười ba mẫu lại, chia làm bốn nhóm (4.1, 4.2, 4.3 4.4)  Nhóm 4.1 gồm hai mẫu 34 với hệ số tương đồng cao 0,75  Nhóm 4.2 gồm mẫu ký hiệu 17  Nhóm 4.3 gồm mẫu ký hiệu tvr  Nhóm 4.4 gồm chín mẫu, chia làm ba phân nhóm (4.4.1, 4.4.2 4.4.3)  Phân nhóm 4.4.1 gồm mẫu 31 40  Phân nhóm 4.4.2 gồm hai mẫu 43 51 với độ tương đồng cao 85%  Phân nhóm 4.4.3 gồm sáu mẫu lại chia làm hai cụm ((3, 90), 85) (45, (62, 89)) với độ tương đồng 86% Trong phân nhóm 4.4.3 này, sai khác di truyền thấp hai mẫu 62 89 với 7% sai khác hai mẫu 90 với 10% sai khác Hai mươi hai loài tre dùng nghiên cứu thuộc tám chi bốn phân tông Đa số chúng loài tre mọc cụm Trong đó, chủ yếu thuộc ba chi sau: chi Bambusa với bảy loài, chi Gigantochloa chi Dendrocalamus, chi với năm lồi, thuộc phân tơng Bambusinae Ba lồi tre mọc cụm lại, lồi đại diện cho chi phân tông Melocanninae, cụ thể ba chi Neohouzeaua, Schizostachyum Pseudostachyum Tre mọc rải chiếm số lượng khiêm tốn hai loài thuộc vào chi Sasa, phân tông Arundinariinae chi Phyllostachys, phân tông Shibataeinae Ba chi Bambusa, Gigantochloa Dendrocalamus đơi khó phân biệt với dựa quan sát kiểu hình (Stapleton, 1994) Kết phân nhóm di truyền cho thấy rằng, lồi thuộc chi Dendrocalamus có vị trí khác Cụ thể, lồi Tre giấy nhóm với lồi Tre nước Bambusa sp nhóm 1, lồi Mét nhóm vào cụm với lồi Mặt mày chi Pseudostachyum phân nhóm 4.4.3 lồi Luồng Thanh Hóa lại nhóm với lồi Nứa Daknơng chi Neohouzeaua thành phân nhóm 4.4.2 Đáng ý hai chi Pseudostachyum Neohouzeaua lại thuộc phân tông khác Melocanninae Hiện tại, mối quan hệ di truyền chi Dendrocalamus chưa hiểu rõ Có nghiên cứu lại chia thành nhiều chi khác nhìn chung đa số đồng thuận dùng tên gọi Dendrocalamus (Loh ctv, 2000) Cá biệt, số lồi có đặc điểm hình thái đơi khó phân biệt với lồi thuộc chi Bambusa loài trung gian hai chi (Stapleton, 1994; Li, 1997) Vì thế, sinh học phân tử công cụ mạnh nhằm giải vấn đề không quán Loh ctv (2000) thấy hai lồi D giganteus D brandisi có khác biệt lớn với kiểu thị phân tử AFLP Nghiên cứu Ramanayake ctv (2007) với thị RAPD cho thấy khoảng cách di truyền tương đối xa loài thuộc chi Dendrocalamus Trong đề tài này, vị trí xếp khác loài thuộc chi Dendrocalamus cho thấy biến dị lớn chi Dendrocalamus Kết phân tích cho thấy lồi Tre giấy, có phân loại 41 thuộc chi Dendrocalamus, lại có hệ số tương đồng cao 0,79 với loài Tre nước thuộc chi Bambusa Trong đó, hệ số tương đồng lồi với lồi lại chi Dendrocalamus dao động từ 0,51 đến 0,65 Điều chứng tỏ Tre giấy có mối quan hệ gần gũi với Tre nước thuộc chi Bambusa với lồi lại chi Dendrocalamus Kết đánh giá đa dạng di truyền cho thấy độ tương đồng loài thuộc chi Bambusa dao động từ 53% đến 74% với giá trị trung bình 63% Trong đó, độ tương đồng di truyền cao hai lồi Hóp nước Bái Độ tương đồng thấp Tre nước với lồi Hóp: Hóp nước Hóp sào Ngồi ra, Tre nước có độ tương đồng thấp với lồi lại chi Bambusa Kết bảy lồi tre thuộc chi Bambusa đề tài có tính đa hình phân biệt chín thị SSR sử dụng Ngồi ra, cho thấy tiềm kỹ thuật SSR việc đánh giá biến đổi di truyền mối quan hệ di truyền chi Bambusa Loh ctv (2000) sử dụng thị phân tử AFLP để nghiên cứu tính đa dạng di truyền lồi tre phân tơng Bambusinae có sáu loài thuộc chi Bambusa kết luận chi Bambusa có tính đa nguồn (polyphyletic) Nghiên cứu Loh cho thấy hai chi Bambusa Gigantochloa có mối quan hệ gần gũi phân biệt thị AFLP Ramanayake ctv (2007) có kết luận tương tự nghiên cứu tính đa dạng mối quan hệ di truyền hai chi thị phân tử RAPD Trong đề tài này, tiến hành phân tích với chín thị SSR, khoảng cách di truyền trung bình chi Bambusa chi Gigatochloa 0,39 Kết chứng tỏ mối quan hệ di truyền gần gũi hai chi Đặc biệt, từ giản đồ hình thấy loài Mum Đồng Nai Gigantochloa sp loài Bái thuộc chi Bambusa tách khỏi lồi lại chi hình thành nhóm 2.1 Khoảng cách di truyền hai loài tương đối gần 0,22 gợi ý hai lồi có quan hệ gần gũi với Trong đó, khoảng cách di truyền xa hai mươi hai mẫu tre nghiên cứu hai loài Le đỏ chi Gigatochloa Tre nước chi Bambusa Hai loài có khoảng cách di truyền 0,56 Mặc dù thuộc phân tơng Bambusinae chi Gigantochloa cho thấy tính đa dạng thấp so với hai chi Bambusa Dendrocalamus Bốn số năm mẫu thuộc chi Gigantochloa sử dụng đề tài thuộc phân nhóm 42 4.4.3 Trong đó, ba lồi Aho, Le đỏ Le lơng nhóm cụm với độ tương đồng cao từ 87 đến 90% Ngồi ra, độ sai khác di truyền trung bình loài thuộc chi Gigantochloa nghiên cứu mức 28%, thấp so với độ sai khác di truyền trung bình lồi thuộc chi Bambusa Dendrocalamus Loh ctv (2000) nghiên cứu với kiểu thị AFLP nhận thấy tính đa dạng thấp loài chi Gigantochloa Kết cho thấy ba chi Neohouzeaua, Pseudostachyum Schizostachyum, thuộc phân tơng Melocanninae, có phân bố khác Chi Schizostachyum đại diện lồi Giang lớn hình thành nhóm riêng rẽ (nhóm 3) Trong đó, hai chi Neohouzeaua Pseudostachyum rơi vào nhóm mối quan hệ di truyền với loài thuộc phân tơng Bambusinae Cụ thể, chi Neohouzeaua đại diện lồi Nứa Daknơng tạo thành phân nhóm 4.4.2 với lồi Luồng Thanh Hóa chi Dendrocalamus chi Pseudostachyum đại diện lồi Mặt mày lại rơi vào phân nhóm 4.4.3 với loài Mét thuộc chi Dendrocalamus loài khác thuộc chi Gigantochloa Kết đánh giá tương đồng di truyền cho thấy khoảng cách di truyền Giang lớn với Nứa Daknông với Mặt mày, 0,40 0,32, lớn so với khoảng cách di truyền 0,19 Nứa Daknông với Mặt mày Kết cho thấy hai chi Neohouzeaua Pseudostachyum có mối quan hệ gần gũi với lồi thuộc phân tông Bambusinae chi Schizostachyum với lồi thuộc phân tơng Bambusinae Ngồi ra, lồi Nứa Daknơng nhóm với lồi Luồng Thanh Hóa thuộc chi Dendrocalamus thành phân nhóm với hệ số tương đồng cao 0,85 lồi Mặt mày nhóm với lồi Mét thuộc chi Dendrocalamus thành nhóm nhỏ với hệ số tương đồng cao 0,93 cho thấy mối quan hệ di truyền gần gũi loài Hai loài tre mọc rải nghiên cứu Lành anh Phyllostachys sp Trúc tăm thuộc chi Sasa phân biệt với độ sai khác di truyền 41% Theo giản đồ hình cây, chúng khơng rơi vào phân nhóm mà lại nhóm với hai lồi tre khác thuộc chi Bambusa loài mọc cụm Nghiên cứu Barkley ctv (2005), sử dụng hai mươi lăm thị SSR có nguồn gốc từ lồi họ hàng với tre bắp, lúa mì, lúa miến lúa nước, rút kết luận có khác biệt di truyền lớn hai nhóm tre: tre mọc rải tre mọc cụm khác biệt dễ dàng phát thị phân tử Trong nghiên cứu 43 tác giả này, khoảng cách di truyền trung bình lồi thuộc chi Phyllostachys loài thuộc chi Bambusa phân tích 0,79 Tuy nhiên đề tài này, việc sử dụng chín SSR chọn lọc Sharma ctv (2008) lại không cho thấy khác biệt loài Lành anh Phyllostachys sp với chi Bambusa Khoảng cách di truyền trung bình Lành anh với bảy loài thuộc chi Bambusa đạt mức 0,31 Hơn nữa, phân nhóm di truyền xếp Lành anh với lồi Hóp nước chi Bambusa thành nhóm nhỏ với độ tương đồng di truyền lớn 96% Kết chứng tỏ hạn chế chín mồi SSR chọn lọc Sharma ctv (2008) việc đánh giá đa dạng di truyền chi Phyllostachys với chi Bambusa Kết cho thấy loài Trúc tăm thuộc chi Sasa loài mọc rải lại có mối quan hệ di truyền gần gũi với lồi Tre anh Phong Bambusa sp loài mọc cụm Chúng nhóm thành nhóm riêng 4.1 với khoảng cách di truyền tương đối gần 0,25 44 Bảng 4.4 Hệ số tương đồng 22 mẫu tre nghiên cứu 15 17 18 19 28 31 34 43 45 51 55 62 71 83 85 88 89 90 101 tvr 1,00 0,74 0,62 0,69 0,54 0,56 0,68 0,74 0,69 0,76 0,84 0,76 0,49 0,85 0,60 0,46 0,87 0,50 0,84 0,90 0,51 0,74 15 17 18 19 28 31 34 43 45 51 55 62 71 83 85 88 1,00 0,59 0,66 0,57 0,59 0,62 0,62 0,75 0,71 0,72 0,68 0,57 0,76 0,66 0,60 0,69 0,62 0,75 0,72 0,60 0,65 1,00 0,54 0,69 0,71 0,68 0,50 0,60 0,53 0,60 0,62 0,54 0,59 0,54 0,63 0,57 0,65 0,60 0,60 0,57 0,62 1,00 0,59 0,60 0,69 0,69 0,65 0,72 0,68 0,69 0,59 0,72 0,62 0,59 0,74 0,51 0,74 0,71 0,65 0,66 1,00 0,96 0,69 0,51 0,62 0,54 0,62 0,60 0,53 0,60 0,65 0,74 0,56 0,69 0,62 0,62 0,62 0,60 1,00 0,74 0,47 0,60 0,53 0,60 0,56 0,51 0,59 0,66 0,72 0,57 0,68 0,60 0,60 0,63 0,59 1,00 0,53 0,60 0,56 0,60 0,56 0,63 0,59 0,54 0,66 0,57 0,59 0,63 0,63 0,72 0,59 1,00 0,63 0,79 0,81 0,82 0,60 0,82 0,60 0,49 0,78 0,53 0,78 0,78 0,57 0,71 1,00 0,69 0,65 0,69 0,62 0,66 0,68 0,62 0,65 0,69 0,71 0,68 0,59 0,69 1,00 0,81 0,85 0,57 0,85 0,60 0,46 0,81 0,50 0,81 0,81 0,54 0,71 1,00 0,84 0,50 0,87 0,65 0,53 0,82 0,51 0,88 0,88 0,47 0,69 1,00 0,63 0,88 0,69 0,51 0,84 0,59 0,84 0,81 0,54 0,76 1,00 0,54 0,62 0,65 0,53 0,69 0,56 0,44 0,79 0,63 1,00 0,63 0,49 0,90 0,50 0,93 0,87 0,51 0,71 1,00 0,65 0,65 0,69 0,68 0,62 0,59 0,63 1,00 0,47 0,78 0,53 0,47 0,65 0,60 1,00 0,51 0,85 0,88 0,53 0,72 1,00 0,54 0,51 0,63 0,68 45 89 90 101 tvr 1,00 0,88 1,00 0,53 0,47 1,00 0,66 0,69 0,60 1,00 Hình 4.5 Giản đồ hình mơ tả quan hệ di truyền 22 mẫu tre dựa mồi SSR 46 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Nghiên cứu thực nhằm đánh giá đa dạng di truyền mối quan hệ hai mươi hai lồi tre Việt Nam chín cặp mồi SSR Đây bước khởi đầu quan trọng nhằm phục vụ công tác bảo tồn nguồn gene cần thiết cho việc khai thác, sử dụng có hiệu bền vững Kết phân nhóm di truyền cho thấy hai mươi hai loài tre chia làm bốn nhóm di truyền với khoảng cách di truyền bốn nhóm 0,35 Độ tương đồng di truyền trung bình mẫu tương đối cao 0,65 Ngoại trừ hai mẫu kí hiệu 18 19 khơng có phân biệt có hệ số tương đồng xác định 0,96 mẫu lại cho thấy tính đa hình phân biệt chín thị SSR dùng nghiên cứu Phân tông Bambusinae với ba chi Bambusa, Dendrocalamus, Gigantochloa chiếm số lượng mẫu lớn nghiên cứu Kết phân tích bảy lồi tre thuộc chi Bambusa đề tài có tính đa hình phân biệt chín thị SSR sử dụng Năm lồi thuộc chi Dendrocalamus có biến dị lớn chi chi Gigantochloa khơng có biến đổi lớn mặt di truyền Kết chứng tỏ mối quan hệ gần gũi hai chi Bambusa Gigantochloa Trong phân tơng Melocanninae, hai lồi Nứa Daknơng chi Neohouzeaua Mặt mày chi Pseudostachyum có mối quan hệ gần gũi với với loài Giang lớn chi Schizostachyum Hai loài tre mọc rải nghiên cứu Lành anh Phyllostachys sp Trúc tăm thuộc chi Sasa phân biệt với chín thị SSR nghiên cứu Tuy nhiên thị lại cho thấy hạn chế việc đánh giá đa dạng di truyền tre mọc rải tre mọc cụm, đặc biệt chi Phyllostachys với chi Bambusa Phân tích đa dạng di truyền thị SSR kỹ thuật đơn giản, dễ thực có khả áp dụng việc phân tích kiểu gene độ xác cao với số lượng mẫu lớn Nghiên cứu cho thấy thị SSR hữu ích việc xác định đa hình di truyền lồi khác Nhìn chung, chín thị SSR sử dụng sử dụng nhằm xác định đa hình quần thể tre việc hình thành lượng lớn phân đoạn 100% phân đoạn đa hình 47 5.2 Đề nghị Quá trình ly trích đề tài chưa tối ưu mong đợi (hiệu suất ly trích chưa cao, đạt 70% mẫu DNA chọn lọc tạp) Đề nghị nghiên cứu sau cần tối ưu hóa quy trình ly trích DNA tre nhằm đạt hiệu suất ly trích cao tinh Trong phạm vi đề tài, số lượng thị SSR sử dụng so với khối lượng gene khổng lồ loài tre, đề nghị cần tiếp tục sử dụng kỹ thuật SSR nhiều vị trí locus nữa, sử dụng cặp mồi có khả cao việc phân biệt tính đa hình lồi để xác định mối quan hệ di truyền loài tre với độ tin cậy cao Đặc biệt, cần phát triển ứng dụng thị SSR giúp phân biệt đa dạng di truyền hai nhóm tre: tre mọc cụm tre mọc rải Bên cạnh đó, số lượng mẫu tre sử dụng nghiên cứu chiếm phần nhỏ so với số lượng lớn lồi tre có Việt Nam Thế giới Vì cần thiết phải tiến hành thu thập có nhiều nghiên cứu rộng nhằm cung cấp nhìn đầy đủ mối quan hệ di truyền tất quần thể tre, tạo sở cho việc bảo tồn sử dụng có hiệu nguồn gene có 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Nguyễn Ngọc Bình Phạm Đức Tuấn 2007 Kỹ thuật tạo rừng tre trúc Việt Nam Nhà xuất Nông Nghiệp, trang – Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang 2003 Di truyền học số lượng Trường Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh, trang 20 – 30 Tài liệu tiếng nước ngoài: N.A Barkley, M.L Newman, M.L Wang, M.W Hotchkiss, and G.A Pederson 2005 Assessment of the genetic diversity and phylogenetic relationships of a temperate bamboo collection by using transferred EST-SSR markers Jeffrey L Bennetzen 2000 Transposable element contributions to plant gene and genome evolution Plant molecular biology 42: 251 – 269 Collard, Jahufer, Brouwer and Pang 2005 An introduction to markers, Quantitative Trait Loci (QTL) mapping and marker – assisted selection for crop improvement: The Basis Concepts Euphytica 142: 169 – 196 E Friar, G Kochert 1994 A study of genetic variation and evolution of Phyllostachys (Bambusoideae: Poaceae) using nuclear restriction fragment length polymorphisms Gianfranceschi et al 1998 Simple Sequence Repeat for the genetic analysis of apple P K Gupta, R K Varshney, P C Sharma and B Ramesh 1999 Molecular markers and their applications in wheat breeding Plant breeding 118: 369 – 390 Y Isagi, K Shimada, H Kushima, N Tanaka, A Nagao, T Ishikawa, H Onodera, S Watanabe 2004 Clonal structure and flowering traits of a bamboo [Phyllostachys pubescens (MAZEL) OHWI] stand grown from a simultaneous flowering as revealed by AFLP analysis 10 P Jarne and P J L Lagoda 1996 Microsatellites, from molecules to populations and back Trends in Ecology and Evolution 11: 424 – 429 11 R K Kalia, M K Rai, S Kalia, R Singh and A K Dhawan 2010 Microsatellite markers: an overview of the recent progress in plants 12 A Karp and K J Edwards 1995 Molecular techniques in the analysis of the extent and distribution of genetic diversity IPGRI workshop on molecular genetic tools in plant genetic resources, Rome, IPGRI 13 Keiko Kitamura and Takayuki Kawahara 2009 Clonal identification by microsatellite loci in sporadic flowering of a dwarf bamboo species, Sasa cernua 14 Li DZ 1997 The Flora of China Bambusoideae Project – problems and current understanding of bamboo taxonomy in China In: Chapman G P (editor) The bamboos, Linnean Society of London, pp 61 – 81 15 Jin Phang Loh, Ruth Kiew, Ohn Set, Leong Huat Gan and Yik-Yuen Gan 2000 A study of genetic variation and relationships within the bamboo subtribe Bambusinae using amplified fragment length polymorphism 49 16 Marta Leonor Marulanda, Ana Maria López, and Jose Luis Claroz 2006 Analyzing the genetic diversity of Guadua spp in Colombia using rice and sugarcane microsatellites 17 A H Paterson 1996 Making genetic maps In: A.H Paterson (ed.), Genome Mapping in Plants, R G Landes Company, San Diego, California, Academic Press, Austin, Texas, pp 23 – 39 18 S M S D Ramanayake, V N Meemaduma, T E Weerawardene 2007 Genetic diversity and relationships between nine species of bamboo in Sri Lanka, using Random Amplified Polymorphic DNA 19 K S Rao and P S Ramakrishnan 1989 Role of bamboos in nutrient conservation during secondary succession following slash and burn agriculture (jhum) in north-east India Journal of Applied Ecology 26: 625 – 633 20 V Ramanatha Rao & Toby Hodgkin 2001 Genetic diversity and conservation and utilization of plant genetic resources 21 Vikas Sharma, Pankaj Bhardwa, Rahul Kumar, Ram Kumar Sharma, Anil Sood, Paramvir Singh Ahuja 2008 Identification and cross-species amplification of EST derived SSR markers in different bamboo species 22 V Shiva 1994 Agriculture and food production UNESCO/Environmental Education Dossiers 9: – 23 C M A Stapleton 1994 The bamboos of Nepal and Bhutan Part I: Bambusa, Dendrocalamus, Melocanna, Cephalostachyum, Teinostachyum, and Pseudostachyum (Gramineae: Poaceae, Bambusoideae) 24 C M A Stapleton 1996 Himalayan bamboo diversity and its conservation: a case study In: G.S Gujral & V Sharma (eds.) Changing perspectives of biodiversity status in the Himalayas, British Council, New Delhi, pp 39 – 42 25 C M A Stapleton and V Ramanatha Rao 1995 Progress and prospects in genectic diversity studies on bamboo and its conservation Biodiversity and Genetic Conservation 2: 23 – 44 26 Y Suyama, K Obayashi, I Hayashi 2000 Clonal structure in a dwarf bamboo (Sasa senanensis) population inferred from amplified fragment length polymorphism (AFLP) fingerprints 27 M L Wang, N A Barkley, T M Jenkins 2009 Microsatellite markers in plants and insects Part I Applications of biotechnology Genes, Genomes and Genomics 3: 54 – 67 28 J L Weber 1990 Informativeness of human (dC-dA)n.(dG-dT)n polymorphisms Genomics 7: 524 – 530 29 J L Weber and P E May 1989 Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction Internet: 30 www.bambootech.org/subsubTOP.asp?subsubid=78&subid=23&sname=BA MBOO 31 www.completebamboo.com/bamboo_anatomy.html 32 http://en.wikipedia.org/wiki/PCR **********§********** 50 ... ii Summary iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt vi Danh sách bảng vii Danh sách hình viii Chương Mở đầu 1.1... (microsatellite) STS: Sequence-Tagged Sites Ta: Annealing Temperature Tm: Melting Temperature UV: Ultraviolet vi DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Một số loại thị phân tử 16 Bảng 2.2... phân loại kết định danh thực vật khác Việc đời sinh học phân tử có ý nghĩa quan trọng nghiên cứu đa dạng di truyền phục vụ công tác bảo tồn chọn giống cung cấp cơng cụ mạnh, nhanh chóng xác để phân