NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG BƯỞI BẰNG KĨ THUẬT RAPD

1 MỞ ĐẦU Bưởi (Citrus grandis L.) ăn có tác dụng bổ dưỡng có nhiều giá trị mặt y học Bưởi trồng rộng rãi Việt Nam, nhiên, vùng có số giống bưởi khác kết trình chọn lọc ảnh hưởng điều kiện khí hậu thổ nhưỡng Trên đất nước ta từ lâu hình thành vùng trồng bưởi giống bưởi tiếng bưởi Đoan Hùng (Phú Thọ), bưởi Đường Hương Sơn (Hương Sơn, Hà Tĩnh), bưởi Phúc Trạch (Hương Khê, Hà Tĩnh), bưởi Thanh trà (Huế), bưởi Biên Hòa (Đồng Nai), bưởi Năm roi, bưởi Da xanh (Vĩnh Long)… [1] Các giống bưởi mặt hình thái khác không đáng kể, từ lá, hoa hình dạng trái Sự khác thể màu sắc cùi quả, cách xếp múi, màu sắc mùi vị tép Hiện nay, nước ta bưởi trồng phổ biến đem lại thu nhập cao cho bà nông dân Bưởi có nhiều giống trồng từ lâu có nhiều giống du nhập từ miền Bắc miền Nam Để đánh giá mức độ di truyền việc dựa vào thị hình thái chưa đủ mà cần có đánh giá sâu cấu trúc di truyền, cụ thể hệ gen Các kỹ thuật sinh học phân tử công cụ hữu hiệu, ứng dụng rộng rãi để phân tích tính đa dạng di truyền xác định mối quan hệ họ hàng loài với Trong năm gần đây, việc sử dụng thị phân tử giúp phát biến dị giống bưởi hay có múi trở nên phổ biến Việt Nam giới Các thị phân tử cho kết có độ xác cao, tiết kiệm thời gian đặc điểm phân tử thường độc lập với đặc điểm hình thái Kỹ thuật RAPD (Random amplified polymorphic DNA) kỹ thuật sinh học phân tử dựa kỹ thuật PCR, cách sử dụng primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trước, bắt cặp nhân ngẫu nhiên đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự primer Theo nguyên tắc, cá thể hoàn toàn giống nhau, sau thực phản ứng PCR-RAPD điều kiện tạo số lượng đoạn chiều dài đoạn tương ứng Khi có đột biến làm xuất hay vị trí bắt cặp ngẫu nhiên tạo số lượng chiều dài đoạn DNA khác cá thể, kỹ thuật RAPD phát đột biến Kỹ thuật RAPD giúp nhận diện thị phân tử trội Việc ứng dụng kỹ thuật RAPD để nghiên cứu đa dạng di truyền nhiều tác giả quan tâm thực nhiều đối tượng vi sinh vật, thực vật động vật [63] Để phân biệt giống bưởi dựa đặc điểm di truyền, chọn đề tài “Nghiên cứu đa đạng di truyền số giống bưởi kỹ thuật RAPD” nhằm khảo sát sai khác band điện di thu Mục tiêu đề tài Sử dụng thị RAPD để nghiên cứu đa dạng di truyền số giống bưởi thu thập vùng khác Nội dung nghiên cứu - Thu thập mẫu giống bưởi tách chiết, tinh DNA tổng số - Phân tích đa dạng di truyền giống bưởi nghiên cứu kỹ thuật RAPD - Phân tích mối quan hệ di truyền giống bưởi nghiên cứu dựa giản đồ phả hệ DNA Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU I GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BƯỞI VÀ GIÁ TRỊ CỦA BƯỞI Giới thiệu chung bưởi Những ghi nhận lịch sử phân tích di truyền kết luận có loài thực chi Citrus (thanh yên, quýt bưởi) nhiều dạng sinh học loài Cam, chanh, chanh cốm, bưởi chùm thừa nhận rộng rãi chúng giống mặt di truyền, tạo chọn lọc, nhân giống chiết ghép hay hạt Sự khác dạng có nguồn gốc từ đột biến soma Hơn nữa, nhiều hệ lai tạo người chọn lọc từ dạng ăn hay theo tiêu chí công nghiệp tạo nên đa dạng chi Citrus [52] Bưởi thuộc họ cam chanh (Rutaceae), họ Aurantioidae, tộc Citreaea, tộc Citrinae (Webber, 1967) Họ Rutaceae gồm tộc 33 chi Mỗi tộc Clauseneae Citreae tạo thành từ tộc: Clauseneae bao gồm Micromelinae, Clauseninae Merillinae; Citrinae gồm có Triphasiinae, Citrinae Balsamocitrinae Citrinae gồm nhóm Citrus nguyên thủy, gần giống Citrus Citrus thật Citrus thật gồm chi: Clymenia, Eremocitrus, Microcitrus, Poncitrus, Fortunella Citrus (Swingle and Reece, 1967) Hai hệ thống phân loại chi Citrus dùng phổ biến Swingle Tanaka Swingle (1967) cho chi Citrus có 16 loài, Tanaka (1977) lại cho có đến 162 loài Tuy nhiên, Scora (1975) cho có loài yên (C medica), quýt (C reticulata), bưởi (C grandis C maxima) Papeda nhóm chi Citrus [62], [39] Bưởi thuộc đại mộc, cao khoảng 10 m Lá có phiến to, dày, gân phụ 56 cặp, cuống có cánh rộng có đốt vào phiến Hoa có chùm ngắn, trục có lông, cánh hoa trắng, dài 3,5 cm, tiểu nhụy nhiều, dính Trái to, gần tròn, to 25-30 cm, bì dày, nạc quanh hột trong, ngà hay hường Bộ nhiễm sắc thể 2n=18 [8] Bưởi loài ăn thân gỗ, sống lâu năm, thường xanh quanh năm, thân cao, tán có dạng hình tròn tự nhiên, hình dẹt nón Cành thường to cam, quýt, cành phát triển mạnh Các phận lá, cành, non thường phủ lớp lông tơ mỏng Nhìn chung, có múi có rễ ăn cạn, rễ lông mọc yếu nên khả hấp thụ chất dinh dưỡng thấp [4], [16] Bưởi sinh sản hữu tính hạt hay nhân giống giâm, chiết cành Thông thường bưởi nhân giống hạt thường ý chăm sóc, chọn lọc nên có xu hướng ngày đa dạng so với loài kinh tế khác chi Citrus Bưởi xem trồng có khả thích nghi rộng với khí hậu điều kiện sống tự nhiên chúng vùng nhiệt đới ẩm [55] Bưởi trồng khắp giới, vùng nhiệt đới cận nhiệt đới, nơi mà mùa đông có nhiệt độ ôn hòa, sống sót có đủ nước để sinh trưởng, phát triển (Gmitter cs, 1992) Chất lượng bưởi tốt vùng cận nhiệt đới Các vùng trồng Citrus phổ biến châu Mỹ (Brazil, Mỹ, Argentina Mexico), lưu vực Địa Trung Hải (Nam Âu, Tây Nam Á, Bắc Phi), châu Á (Trung Quốc, Ấn Độ Nhật Bản) Nam Phi Theo FAO (2006), sản lượng bưởi bưởi chùm giới triệu tấn, trồng 74 quốc gia với diện tích 264.000 Mỹ nước có sản lượng bưởi bưởi chùm lớn giới Vùng Đông Nam Á, đặc biệt Đông Ấn Độ, Bắc Burma Tây Nam Trung Quốc xem trung tâm phát sinh đa dạng chi Citrus chi có quan hệ gần gũi với Tổng sản lượng chi Citrus toàn cầu thời gian 2004-2005 105,4 triệu [36] Giá trị bưởi Bưởi có nhiều giá trị mặt y học đồng thời thực phẩm ăn kiêng tốt cho nhiều loại bệnh Bưởi sử dụng trực tiếp hay chế biến thành nhiều ăn khác loại mứt, bánh kẹo, gỏi nước uống [22] Theo Bộ nông nghiệp Hoa Kỳ, thành phần dinh dưỡng bưởi xác định bảng 1.1 Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng bưởi Thành phần Hàm lượng (100 g phần ăn được) Nước 89,10 g Năng lượng 38 kcal Protein 0,76 g Lipid tổng số 0,04 g Tro 0,48 g Carbohydrate 9,62 g Chất xơ 1,0 g Chất khoáng Calcium mg Sắt 0,11 mg Magnesium mg Phosphorus 17 mg Potassium 216 mg Sodium mg Kẽm 0,08 mg Đồng 0,048 mg Mangan 0,017 mg Vitamin Vitamin C 61,0 mg Thiamin 0,034 mg Riboflavin 0,027 mg Niacin 0,220 mg Vitamin B-6 0,036 mg Vitamin A, IU IU Cholesterol mg Thành phần khác β-Carotene µg α-Carotene µg β-Cryptoxanthin 10 µg Nguồn: United States Department of Agriculture (USDA), 2004 Trong dung dịch nước ép múi bưởi có khoảng 9% citric acid, 14% đường Ngoài có lycopin, enzyme amylase, peroxidase, vitamin C (50 mg 100 g dịch ép), vitamin A B [11] Phần vỏ bưởi sử dụng để làm mứt dùng làm nguyên liệu hộp thùng chứa Hoa, hạt bưởi ứng dụng mục đích y tế Hoa bưởi sử dụng để tách chiết chất trình chế tạo nước hoa pectin tách từ vỏ [55] Bưởi xem nguồn vitamin C hợp chất giúp tăng cường sức khỏe carotenoids, flavonoids, linonoids chất xơ (Yu cs, 2005) Các chất có khả chống chất sinh ung thư kháng đột biến, giúp người chống lại bệnh tật Ngoài ra, hoạt tính chống oxy hóa bưởi liên quan đến diện nhiều loại polyphenols acid ascorbic [56] Bưởi chứa nhiều loại flavonoid có cấu trúc khác nhau, bao gồm flavanone flavone O- C-glycosides, có methoxylated flavone Mỗi nhóm hợp chất biểu hoạt tính cao chống viêm trị ung thư Có chứng cho tác dụng sinh học flavonoid bưởi có liên quan đến tương tác chúng với enzyme điều hòa chủ chốt tác động đến kích hoạt tế bào gắn kết thụ thể Các flavonoid bưởi biểu hoạt tính thấp tế bào khỏe mạnh, bình thường, biểu đặc tính gây độc thấp rõ rệt loài động vật Những chất mở rộng ảnh hưởng chúng thể thông qua cảm ứng enzyme gan I II, thông qua hoạt động sinh học chất chuyển hóa chúng Như vậy, có chứng rõ ràng đặc tính tiềm hợp chất việc tăng cường sức khỏe người [50] Carotenoid xem tiền chất vitamin A – chất quan trọng chế độ ăn người động vật; đóng vai trò chất chống oxy hóa, giúp giảm nguy mắc bệnh ung thư (Olson, 1989) Bưởi nguồn phức hệ carotenoid với số lượng carotenoid lớn tìm thấy loại trái Nồng độ thành phần carotenoid thay đổi lớn loài bưởi phụ thuộc vào điều kiện phát triển (Gross, 1987) [46] Ngày nay, khoa học khám phá thêm đặc tính trị liệu bưởi Trong bưởi chứa nhiều pectin, chất sợi hòa tan chứa polysaccharide giúp hấp thu cholesterol thức ăn muối mật nên làm giảm cholesterol máu [11] II ỨNG DỤNG CỦA CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở CHI CITRUS Trong xu hướng nay, để chọn giống trồng hay xác định nguồn gốc loài trồng người ta thường sử dụng thị phân tử (marker) Việc sử dụng thị phân tử cho kết có độ xác cao, tiết kiệm thời gian đặc điểm phân tử thường độc lập với đặc điểm hình thái, không chịu tác động môi trường chủ động nghiên cứu Việc sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử công cụ đắc lực để phân tích tính đa dạng di truyền nhiều loài Gần đây, phân tích phân tử phân tích trình tự đoạn nucleotide lặp lại đơn giản (SSR-Simple sequence repeat), hay microsatellite đoạn hai SSR (ISSR-Inter-simple sequence repeat), đa hình chiều dài đoạn cắt hạn chế (RFLP-Restriction fragment length polymorphism), đa hình đoạn khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD-Random amplified polymorphic DNA), đa hình đoạn khuếch đại với primer đặc hiệu (SCAR-Sequence characterized amplified region), phản ứng RAPD cho gen ctv (CAPS)… sử dụng để kiểm tra mối quan hệ họ hàng số nhóm phân loại chi Citrus [52] So sánh với phương pháp truyền thống phân loại nghiên cứu đa hình thị phân tử cho kết có độ tin cậy cao [3] Trong số thị RAPD sử dụng phổ biến để phân biệt loài khác hay để xác định đồ gen loài thực vật Kỹ thuật sử dụng thành công việc xác định đa hình cà chua, mâm xôi, táo mơ (Bogani cs, 1994; Davis cs, 1995; Dubouzet cs, 1997; Mariniello cs, 2002; Tartarini, 1996; Warburton cs, 1996) [51] Ứng dụng kỹ thuật RAPD phân tích đa dạng di truyền Kỹ thuật RAPD dựa nguyên tắc PCR, sử dụng primer ngắn không đặc hiệu để nhân đoạn DNA genome cách ngẫu nhiên [9] Sự đa hình RAPD tạo thành từ thay đổi nucleotide, ví dụ chèn đoạn hay đoạn dẫn đến thay đổi vị trí kết hợp primer (Williams cs, 1993) Những sản phẩm khuếch đại đa hình sử dụng thị di truyền (Tingey and del Tufo, 1993) [65] RAPD kỹ thuật dễ thực có giá thành rẻ, với ưu điểm bật cần lượng nhỏ DNA khuôn mẫu, không tạo thành phóng xạ cho kết phân tích nhanh mà không đòi hỏi thông tin tình tự DNA loài (Williams et al., 1990; Martin et al., 1997) Mặc dù số trường hợp, kỹ thuật RAPD có khả lặp lại thấp vấn đề khắc phục cách tối ưu hóa điều kiện phản ứng (Weising et al., 1995) Nhìn chung, RAPD cung cấp liệu có giá trị đa dạng di truyền bên quần thể loài (Lynch and Milligan, 1994; Collignon et al., 2002) [47] Trong kỹ thuật RAPD primer ngẫu nhiên chứa 10 nucleotide cho kết khuếch đại tốt (Coletta Filho cs, 1998; Elisiario cs, 1999) Trong chi Citrus, RAPD sử dụng để xác định đột biến loài chanh (Deng cs, 1995), xây dựng đồ gen (Cai cs, 1994), xác định thị liên quan với đặc điểm nông học (Cheng Roose, 1995; Gmitter cs, 1996) cho nghiên cứu phân loại học (Luro cs, 1992) [33] Tính đa dạng sinh học loài có múi Gò Quao (Kiên Giang) Nguyễn Hữu Hiệp cs (2004) nghiên cứu dựa vào đặc điểm hình thái phân tử Các đặc điểm hình thái học cho thấy có múi Gò Quao, Kiên Giang chia làm nhóm bao gồm: bưởi, cam, quýt, chanh hạnh Sử dụng primer OPA02, OPA04, OPA11 OPA13 (Operon Technologies, CA) phân tích đa dạng di truyền kỹ thuật RAPD cho kết 49 thị phân tử ghi nhận Giản đồ phả hệ cho thấy có múi Gò Quao, Kiên Giang chia thành nhóm: bưởi, cam-quýt, chanh hạnh Kết phân tích cho thấy khoảng cách di truyền nhóm biến động từ 0-43% Trong 49 thị có 11 thị xuất 100% số cá thể, 26 thị 90%, thị 80%, thị 70%, thị 70% có thị 45% [7] Kỹ thuật RAPD sử dụng để phân biệt có nguồn gốc từ phôi tâm hợp tử tạo thành từ phép lai giống quýt Montenegrina (Citrus deliciosa Tenore) King (C nobilis Loureiro) Phôi tách từ hạt giống, nhân giống in vitro thích nghi điều kiện nhà kính Bốn primer ngẫu nhiên sử dụng để nhận biết 54 có nguồn gốc hữu tính từ tổng số 202 cá thể Mức độ đa hình primer phản ánh qua số lượng có nguồn gốc hợp tử thu primer Thuật toán phân tích nhóm bố mẹ xếp cá thể vào nhóm riêng biệt với khoảng cách di truyền lớn 20% [23] Abkenar cs (2003) sử dụng kỹ thuật RAPD nghiên cứu đặc điểm phân tử khoảng cách di truyền loài Citrus Nhật Đối tượng nghiên cứu gồm 31 loài Citrus khác nhau, có loài cam chua, loài ‘Yuzu’ 21 loài họ hàng Trong số 60 primer sử dụng có 27 primer lựa chọn với 108 thị tạo thành, 76 thị số đa hình, trung bình 2,8 thị primer Số lượng thị đa hình primer nằm khoảng từ đến kích thước thị từ 400 bp (OPA18) đến 3.200 bp (OPA01) Trong nghiên cứu này, số thị RAPD giúp phân biệt loài trồng gần gũi: OPA17 (1.100) OPE20 (675) có ‘Kabosu’ mà ‘Aka kabosu’; tương tự OPA20 (1.400), OPB05 (990) OPE16 (1.000) có ‘Aka kabosu’ mà ‘Kabosu’ Cây phát sinh loài tạo thành dựa khoảng cách di truyền cho thấy loài cam chua khác với loài ‘Yuzu’ họ hàng chúng Các loài ‘Yuzu’ có mối quan hệ gần gũi với nhau, nhiên đa hình di truyền loài nghiên cứu khác xác định dễ dàng kỹ thuật RAPD đa dạng di truyền loài cao, biểu lộ nguồn gốc khác chúng [18] Trong nghiên cứu nhằm xác định 10 giống chanh vùng Campania, miền Nam nước Ý, Mariniello cs (2004) sử dụng kỹ thuật RAPD với 44 primer 10 ngẫu nhiên có độ dài 10 nucleotide Tất primer sử dụng phản ứng RAPD với DNA khuôn mẫu giống chanh nghiên cứu nhằm xác định đa hình Mọi primer tạo sản phẩm khuếch đại có primer tạo band dùng để xác định giống trồng Sản phẩm khuếch đại giống Sorrento thực phản ứng với primer OPL02 cho thấy diện band (1.000-1.200bp) mà giống khác Giống chanh tạo sản phẩm khuếch đại khuếch đại với primer OPL16 Ngoài ra, primer OPL14 hữu ích xác định giống Amalfi với hình ảnh điện di biểu thị vắng mặt band có khối lượng phân tử cao thấp Giống Procida nhận dạng primer OPL19 với band khuếch đại đặc biệt có khối lượng phân tử thấp Cuối cùng, với việc sử dụng primer OPL31, giống Gloria d’Amalfi cho kết điện di band khối lượng phân tử cao Kết cho thấy mức độ tương đồng giống chanh nghiên cứu cao, lớn 80%, xếp chúng vào nhóm Nhóm thứ bao gồm giống Napoli S Agnello; nhóm thứ hai gồm Gloria d’Amalfi, Sorrento, Procida, Sfusato d’Amalfi, Variegato, and Cannellino; nhóm thứ ba nhóm thứ tư chứa giống Massa Lubrense Amalfi [51] Bastianel cs (2001) sử dụng thị RAPD để phân tích tương đồng mặt di truyền 15 giống thuộc chi Citrus (Citrus spp.) Brazil, bao gồm giống cam (C sinensis Osbeck), giống quýt (C reticulata Blanco, C nobilis Loureiro, C sunki Loureiro C deliciosa Tenore), cam chua (C aurantium L.), bưởi chùm (C paradisi Marcf.), bưởi (C grandis Osbeck), yên (C medica L.), chanh cốm (C latifolia) dạng lai [C clementina T × (C tangerina T × C paradisi Macf.)] Sự tương đồng di truyền 15 giống quan sát từ 12 primer ngẫu nhiên, độ tương đồng di truyền giống quýt thấp 81% Độ tương đồng thấp thấy loài quan hệ C medica, C grandis C latifolia Bốn giống cam (C sinensis Osbeck) khác dựa vào thị RAPD, chúng có độ tương đồng cao [22] 33 M 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Hình 3.4 Hình ảnh điện di PCR-RAPD với primer A18 Như vậy, tổng số 25 primer sử dụng để nghiên cứu có primer cho sản phẩm khuếch đại tất 18 giống bưởi A02, A18, B10, C02, C08, AD10, AT14 N06 Primer có số giống bưởi khuếch đại A01 (14 giống) Primer có số band DNA khuếch đại nhiều L17 (22 band), hai primer có số band DNA khuếch đại B05 AD10 (4 band) So với số nghiên cứu khác loài thuộc chi Citrus, kết nghiên cứu có khác biệt, chẳng hạn Elisiario cs (1999) thu 12 band DNA từ quýt Carvalhais với primer AD10 [35], Cevik cs (2007) xây dựng đồ di truyền liên kết cho loài thuộc chi Citrus thu 10 band với primer B05 [28] Đối với phản ứng PCR-RAPD, việc sàng lọc primer ngẫu nhiên để chọn primer phù hợp cho đối tượng cụ thể cần thiết Nguyen Thanh Nhan cs (2003) nghiên cứu đa dạng di truyền loài thuộc chi Citrus Việt Nam sàng lọc 15 primer thích hợp số 150 primer [53]; Cai cs 34 (1994) chọn lọc 69 primer 140 primer để xây dựng giản đồ phả hệ chi Citrus [26] Qua kết nghiên cứu, xác định primer vừa có khả khuếch đại DNA 18 giống bưởi vừa tạo thành nhiều band A02 (20 band), C02 (18 band), AT14 (12 band), C08 N06 (10 band) Các primer phù hợp cho mục đích nghiên cứu đa hình giống bưởi xác định khoảng cách di truyền chúng 35 Bảng 3.4 Số band khuếch đại với primer Primer Số band primer 10 11 12 13 14 15 16 17 18 A02 7 7 6 A04 8 11 5 1 A18 1 4 4 3 2 1 1 A15 10 12 12 11 11 11 11 11 11 C09 1 7 4 B05 2 3 3 2 2 2 0 1 B10 3 2 2 1 2 2 2 B17 1 4 2 3 1 1 C02 9 10 10 10 10 10 8 8 8 C04 3 4 4 4 B04 0 7 6 3 C05 11 11 11 10 13 13 11 10 10 11 10 C08 2 1 1 2 3 2 AA10 4 3 4 4 3 AD10 3 3 3 3 2 2 1 A11 10 10 10 10 11 10 10 10 7 10 A09 3 5 6 A01 0 5 4 3 1 0 1 AT14 4 8 9 4 N09 3 3 3 4 4 4 L17 15 16 17 14 11 15 17 17 12 11 M20 10 10 10 8 7 K16 6 6 5 3 6 N06 3 3 4 4 4 4 4 N02 7 7 7 4 Tổng cộng 48 78 94 154 163 159 137 134 159 165 150 118 127 111 14 97 89 97 Theo bảng 3.4, giống có nhiều band DNA khuếch đại với primer sử dụng bưởi Đỏ (165 band), chiếm tỷ lệ 55,37% tổng số band DNA tạo thành, 36 tiếp đến bưởi Bành (163 band), bưởi Láng bưởi Thanh du (cùng 159 band) Số band DNA lớn mà giống bưởi tạo thành với primer 17 band, bưởi Đỏ bưởi Hồng da xanh tạo thành 17 band với primer L17 (hình 3.5) 23130 bp 4361 bp 2547 bp 2027 bp 1344 bp 960 bp 602 bp 564 bp 381 bp M 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Hình 3.5 Hình ảnh điện di PCR-RAPD với primer L17 Trong 18 giống bưởi nghiên cứu, hầu hết cho kết khuếch đại tốt với 25 primer sử dụng, có bưởi Thanh trà bưởi Trụ lông cho hiệu khuếch đại với 48 14 band tạo thành Bưởi Trụ lông tạo thành sản phẩm khuếch đại phản ứng PCR-RAPD 9/25 primer (A02, A04, A18, B10, C02, C08, AD10, AT14 N06), primer có sản phẩm tạo thành gồm band, primer tạo thành band primer tạo thành band Nếu so sánh với sản phẩm PCR-RAPD giống bưởi lại giống bưởi có khác biệt lớn Kết điện di sản phẩm PCR-RAPD 18 giống bưởi primer AT14 trình bày hình 3.6 Primer tạo thành 12 band thực phản ứng PCR-RAPD với 18 giống bưởi nghiên cứu, có giống tạo thành band (bưởi Bành, bưởi Thanh du bưởi Hồng da xanh) Giống bưởi Trụ lông tạo thành band AT14-782 37 23130 bp 4361 bp 2027 bp 1621 bp 782 bp 564 bp 523 bp 366 bp 335 bp M 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Hình 3.6 Hình ảnh điện di PCR-RAPD với primer AT14 III MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA CÁC GIỐNG BƯỞI NGHIÊN CỨU Hệ số đồng dạng di truyền giống bưởi nghiên cứu từ 0,04 (giữa bưởi Trụ lông với 11 giống bưởi khác bưởi Phúc Trạch, bưởi Bành, bưởi Láng, bưởi Tàu, bưởi Trẹm, bưởi Thanh du, bưởi Đỏ, bưởi Hồng da xanh, bưởi Cốm,bưởi Trắng bưởi Đường goắn) đến 0,79 (giữa bưởi Bành bưởi Láng) (Bảng phụ lục), chứng tỏ chúng có khác biệt di truyền lớn Giản đồ phả hệ DNA giống bưởi nghiên cứu trình bày hình 3.7 A Bưởi Thanh trà Bưởi Năm roi Bưởi Da xanh B1 Bưởi Hải Phòng 38 Thanh trà Tiên Phước Bưởi Đường goắn Bưởi Phúc Trạch Bưởi Bành B Bưởi Láng Bưởi Thanh du Bưởi Đỏ Bưởi Hồng da xanh Bưởi Tàu B2 Bưởi Trẹm Bưởi Cốm Bưởi Trắng Bưởi Thái Lan C Bưởi Trụ lông Hệ số đồng dạng di truyền Hình 3.7 Giản đồ phả hệ DNA giống bưởi nghiên cứu Các giống bưởi chia thành nhóm có độ tương đồng di truyền thấp (khoảng 0,05), nhóm thứ (nhóm A) gồm giống (bưởi Thanh trà), nhóm thứ hai (nhóm B) gồm 16 giống (bưởi Năm roi, bưởi Da xanh, bưởi Phúc Trạch, bưởi Bành, bưởi Láng, bưởi Tàu, bưởi Trẹm, bưởi Thanh Du, bưởi Đỏ, bưởi Hồng da xanh, bưởi Cốm, bưởi Trắng, bưởi Thái Lan, Thanh trà Tiên Phước, bưởi Đường goắn bưởi Hải Phòng), bưởi Trụ lông nằm tách biệt nhóm thứ (nhóm C) giản đồ di truyền Nhóm A gồm giống bưởi Thanh trà với 48 band DNA khuếch đại 18 primer, giống bưởi có số band tạo thành tương đối thấp 39 Nhóm B bao gồm giống có số band DNA khuếch đại lớn với số band tạo thành từ 78 band (bưởi Năm roi) đến 165 band (bưởi Đỏ) Nhóm B chia thành nhóm nhỏ với độ tương đồng di truyền xấp xỉ 0,38; nhóm B1 gồm giống có độ tương đồng 0,42 (số band DNA tạo thành từ 78-97 band), bưởi Đường goắn nằm tách biệt nhánh, nhánh lại bao gồm bưởi Năm roi, bưởi Da xanh, bưởi Hải Phòng Thanh trà Tiên Phước, bưởi Năm roi bưởi Da xanh có độ tương đồng lớn (0,57) Nhóm B2 gồm 11 giống với độ tương đồng di truyền khoảng 0,48 giống bưởi Cốm, bưởi Trắng bưởi Thái Lan nằm nhánh, nhánh lại bao gồm giống (bưởi Phúc Trạch, bưởi Bành, bưởi Láng, bưởi Thanh du, bưởi Đỏ, bưởi Hồng da xanh, bưởi Tàu, bưởi Trẹm) với độ tương đồng lớn giống bưởi Bành bưởi Láng (0,79) Đây nhóm gồm giống có số band DNA tạo thành lớn (111-165 band) Tương tự nhóm A, nhóm C gồm giống bưởi Trụ lông Kết phù hợp với nhận định ban đầu khác biệt sản phẩm PCR-RAPD bưởi Trụ lông so với giống khác Bưởi Trụ lông giống nghiên cứu có số band khuếch đại 25 primer (14 band) tạo thành sản phẩm 9/25 primer Qua phân tích giản đồ phả hệ nhận thấy có khác biệt rõ rệt di truyền giống bưởi Thanh trà bưởi Trụ lông giống lại với hệ số tương đồng di truyền thấp nhất, từ 0,04 đến , Vũ Thị Nhuận cs (2005) nghiên cứu đa dạng di truyền 146 bưởi Năm Roi xã Mỹ Hòa, huyện Bình Minh, tỉnh Vĩnh Long phương pháp RAPD Kết cho thấy tập đoàn bưởi chia làm nhóm, có nhóm giống nhiều nhóm khác hẳn [13] 40 Theo Nei cs (1978), số lượng band DNA khuếch đại nhiều khả phân biệt chúng phả hệ lớn, số band đa dạng tối thiểu 50 xây dựng phả hệ xác Với 295 band DNA đa hình 18 giống bưởi sử dụng 25 primer, kết xây dựng phả hệ đáng tin cậy Các thuộc chi Citrus nói chung bưởi nói riêng dễ xảy biến dị (đặc biệt biến dị soma) [52], dẫn đến khác đặc điểm di truyền giống mà trước chúng xuất phát từ nguồn gốc Kết nghiên cứu gần tương tự với kết nghiên cứu Nguyễn Xuân Thụ cs (2004) xây dựng giản đồ phả hệ 13 giống bưởi trồng Việt Nam nhờ vào thị RAPD Tác giả sử dụng 17 mồi (Operon Technologies) để khuếch đại tạo 153 band DNA, có 124 band đa hình (81,05%), 29 band đơn hình (18,95%) band có kích thước từ 150 bp đến 2.450 bp Tỷ lệ band đa hình cao chứng tỏ giống bưởi Việt Nam có quan hệ di truyền xa [17] 41 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I KẾT LUẬN Qua trình nghiên cứu, sơ rút kết luận sau: Tổng cộng có 298 thị RAPD tạo từ 18 giống bưởi phân tích với 25 primer ngẫu nhiên, có 295 band đa hình (98,99%), tỷ lệ band đa hình primer 11,8 Trong số 295 band đa hình có 55 band DNA (18,46%), đặc trưng cho 14 giống bưởi nghiên cứu Trong số 25 primer sử dụng có primer vừa có khả khuếch đại DNA 18 giống bưởi vừa tạo thành nhiều band A02 (20 band), C02 (18 band), AT14 (12 band), C08 N06 (10 band) Hệ số đồng dạng di truyền giống bưởi nghiên cứu từ 0,04 đến 0,79; Các giống bưởi chia thành nhóm có độ tương đồng di truyền khoảng 0,05, nhóm thứ (nhóm A) gồm giống bưởi Trụ lông nằm tách biệt giản đồ di truyền, nhóm thứ hai (nhóm B) gồm 17 giống lại Nhóm B bao gồm giống có số band DNA khuếch đại lớn với số band tạo thành từ 48 band (bưởi Thanh trà) đến 165 band (bưởi Đỏ) Nhóm B chia thành nhóm nhỏ C D với độ tương đồng di truyền 0,25; nhóm C gồm giống bưởi bưởi Thanh trà (tương ứng với giống có số band tạo thành nhất); nhóm D bao gồm 16 giống bưởi lại với độ tương đồng di truyền xấp xỉ 0,38 II ĐỀ NGHỊ Sử dụng kết hợp với thị phân tử khác nghiên cứu nhằm xác định thị đặc hiệu cho giống bưởi 42 Tiếp tục nghiên cứu đặc điểm hình thái chất lượng 18 giống bưởi nghiên cứu nhằm phục vụ cho công tác chọn giống dựa vào thị RAPD thu 36 16 giống (bưởi Năm roi, bưởi Da xanh, bưởi Phúc Trạch, bưởi Bành, bưởi Láng, bưởi Tàu, bưởi Trẹm, bưởi Thanh Du, bưởi Đỏ, bưởi Hồng da xanh, bưởi Cốm, bưởi Trắng, bưởi Thái Lan, Thanh trà Tiên Phước, bưởi Đường goắn bưởi Hải Phòng) - nghiên cứu sâu tính chất sinh lý  chọn giống - thị đặc trưng cho giống - dùng thêm marker khác để tăng tin cậy 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 0Ai2007 Đoàn Nhân Ái, Nguyễn Thị Dung, Nguyễn Thị Hà (2007) Tuyển chọn đầu dòng số ăn có giá trị cao Thừa Thiên Huế Báo cáo kết nghiên cứu khoa học, Sở Nông nghiệp Phát triển Nông thôn Thừa Thiên Huế 0Binh Lê Trần Bình, Đinh Kim Xuyến (2004) Đánh giá mức độ đồng di truyền dòng vải thiều (Litchi chinensis Sonn.) Thanh Hà, Hải Dương kỹ thuật RAPD TC Công nghệ sinh học 2(3): 345-358 0Binh Nguyễn Thị Thanh Bình, Hoàng Thị Hằng, Nông Văn Hải (2004) Nghiên cứu đa hình số giống tằm dâu kỹ thuật RAPD TC Di truyền học Ứng dụng 1: 30-35 0Cau Lý Gia Cầu (1993) Kỹ thuật trồng bưởi suất cao tếng Trung Quốc: Nxb Khoa học Kỹ thuật Quảng Tây, Trung Quốc (Nguyễn Văn Tôn dịch) 0Hang Nguyễn Trịnh Nhất Hằng, Yau Shiang Yang (2005) Xác định mối quan hệ di truyền số giống đu đủ phương pháp RAPD markers - đánh giá khả chịu liên quan giống TC Nông nghiệp Phát triển Nông thôn 22: 51-54 0Hanh Hồ Sỹ Hạnh, Võ Hành, Đặng Diễm Hồng (2006) Sử dụng kỹ thuật RAPD-PCR để xác định mối quan hệ di truyền số loài thuộc chi Calothrix (Cyanobacteria) phân lập từ đất trồng tỉnh Đắc Lắc TC Sinh học 28(1): 68-74 0Hiep Nguyễn Hữu Hiệp, Trần Nhân Dũng, Đặng Thanh Sơn, Nguyễn Văn Được (2004) Đa dạng sinh học giống có múi huyện Gò Quao, tỉnh Kiên Giang TC Khoa học-Trường Đại học Cần Thơ 1: 111-121 0Ho Phạm Hoàng Hộ (2003) Cây cỏ Việt Nam: Nxb Trẻ, Hà Nội 0Hoa Điêu Thị Mai Hoa, Lê Trần Bình (2005) Nghiên cứu tính đa hình di truyền 57 giống đậu xanh (Vigna radiata L.) kỹ thuật RAPD TC Công nghệ sinh học 3(1): 57-66 10 0Lang Nguyễn Thị Lang, Hồ Phú Yên, Trần Khắc Thi, Bùi Chí Bửu (2007) Đánh giá đa dạng di truyền dưa leo phương pháp RAPD marker TC Nông nghiệp Phát triển Nông thôn 1: 28-31 11 0Loi Đỗ Tất Lợi (2003) Những thuốc vị thuốc Việt Nam: Nxb Y học, Hà Nội 12 0mau Chu Hoàng Mậu, Vũ Thị Thu Thuỷ, Lê Phương Dung, Ngô Thị Liêm (2007) Sự đa dạng di truyền phân tử số giống lạc (Arachis hypogaea L.) có khả chịu hạn khác TC Nông nghiệp Phát triển Nông thôn 6: 30-33 13 0Nhuan Vũ Thị Nhuận, Trần Nhân Dũng, Nguyễn Hữu Hiệp, Trần Phước Đường (2005) Đa dạng di truyền bưởi Năm Roi (Citrus grandis L.) xã Mỹ Hòa, huyện Bình Minh, tỉnh Vĩnh Long Hội thảo quốc gia “Cây có múi, xoài khóm”, Cần Thơ, Việt Nam: 92-101 14 0tam Nguyễn Thị Tâm, Lê Văn Sơn, Lê Trần Bình (2003) Ứng dụng kỹ thuật phân tích đa hình phân đoạn ADN nhân ngẫu nhiên (RAPD) vào việc đánh giá dòng lúa chọn lọc từ mô sẹo chịu nhiệt độ cao Những vấn đề nghiên cứu Khoa học Sự sống: Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc lần thứ hai, nghiên cứu sinh học, nông nghiệp, y học NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội: 1003-1007 15 0Tam Nguyễn Thị Tâm, Nguyễn Thị Thu Hoài, Chu Hoàng Mậu (2005) Nghiên cứu tính đa dạng số giống lúa cạn địa phương kỹ thuật PCR-RAPD TC Nông nghiệp Phát triển Nông thôn 19: 18-22 16 0Tho Trần Đăng Thổ, Lý Gia Cầu (1996) Kỹ thuật trồng bưởi Sa Điền: Nxb Quảng Tây, Trung Quốc (Trần Thế Tục dịch) 38 17 0Thu Nguyễn Xuân Thụ, Nguyễn Hoàng Tỉnh, Lê Trần Vinh (2004) Xây dựng phát sinh số giống bưởi trồng Việt Nam thị RAPDs Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống, Nxb Khoa học Kỹ Thuật, Hà Nội: 253-256 18 Abkenar AA, Isshiki S (2003) Molecular characterizaton and genetc diversity among Japanese acid citrus (Citrus spp.) based on RAPD markers Journal of Horticultural Science & Biotechnology 78(1): 108-112 19 Abkenar AA, Isshiki S, Tashiro Y (2004) Phylogenetc relatonships in the “true citrus fruit trees” revealed by PCR-RFLP analysis of cpDNA Scientia Horticulturae 102: 233-242 20 Ahmed I, Islam M, Arshad W, Mannan A, Ahmad W, Mirza B (2009) High-quality plant DNA extracton for PCR: an easy approach J Appl Genet 50(2): 105-107 21 Andrade-Rodriguez M, Villegas-Monter A, Carrillo-Castaneda G (2004) Polyembryony and identficaton of Volkamerian lemon zygotc and nucellar seedlings using RAPD Pesq Agropec Bras 39: 551-559 22 Bastanel M, Dornelles ALC, Machado MA, Wickert E, Maraschin SF, Coletta Filho HD, Schäfer G (2001) Characterizaton of Citrus genotypes (Citrus spp.) using RAPDs markers Brasil Ciência Rural 31(5): 763-768 23 Bastanel M, Schwarz SF, Colleta Filho HD, Lin LL, Machado MA, Koller OC (1998) Identficaton of zygotc and nucellar tangerine seedlings (Citrus spp.) using RAPD Genet Mol Biol 21: 123-127 24 Beedanagari SR, Sue KD, Bruce WW, Patrick JC (2005) A first linkage map of pecan cultvars based on RAPD and AFLP markers Theor Appl Genet 110: 1127-1137 25 Bhattacharya S, Dey T, Bandopadhyay TK, Ghosh PD (2008) Genetc polymorphism analysis of somatc embryo-derived plantlets of Cymbopogon flexuosus through RAPD assay Plant Biotechnol Rep 2: 245-252 26 Cai Q, Guy L, Moore GA (1994) Extension of the linkage map in Citrus using random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers and RFLP mapping of cold-acclimaton-responsive loci Theor Appl Genet 89: 606- 614 27 Capparelli R, Viscardi M, Amoroso MG, Blaiotta G, Bianco M (2004) Inter-simple sequence repeat markers and flow cytometry for the characterizaton of closely related Citrus limon germplasms Biotechnology Letters 26: 1295-1299 28 Cevík MF, Moore GA (2007) Constructon of a genetc linkage map of Citrus with Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) markers using a progeny populaton from a complex intergeneric cross Turkey J Bot 31: 79-86 29 Chadha S, Gopalakrishna T (2005) Genetc diversity of Indian isolates ofrice blast pathogen (Magnaporthe grisea) using molecular markers Current Science: 1466-1469 30 Cheng L, Gao QK, Chen DM, Xu CJ (2005) The use of RAPD markers for detectng genetc diversity, relatonship and molecular identficaton of Chinese elite tea genetc resources [(Camellia sinensis (L.) O Kuntze] preserved in a tea germplasm repository Biodivers Conserv 14: 1433-1444 31 Coletta Filho HD, Machado MA, Targon MLPN, Moreira MCPQDG, Pompeu JJ (1998) Analysis of the genetc diversity among mandarins (Citrus spp.) using RAPD Markers Euphytica 102: 133-139 32 Corazza-Nunes MJ, Machado MA, Nunes WMC, Cristofani M, Targon MLPN (2002) Assessment of genetc variability in grapefruits (Citrus paradisi Macf.) and pummelos (C maxima (Burm.) Merr.) using RAPD and SSR markers Euphytica 126(2): 169-176 33 De Pasquale F, Siragusa M, Abbate L, Tusa N, De Pasquale C, Alonzo G (2006) Characterizaton of five sour orange clones through molecular markers and leaf essental oils analysis Scientia Horticulturae 109: 54–59 39 34 Dehesdtani A, Kazemitabar SK, Rahimian H (2007) Assessment of genetc diversity of navel sweet orange cultvars grown in Mazandaran province using RAPD markers Asian Journal of Plant Sciences 6(7): 1119-1124 35 Elisiario PJ, Justo EM, Leitão JM (1999) Identficaton of mandarin hybrids by isozyme and RAPD analysis Sci Horti 81: 287-299 36 Gmitter J, Fred G, Soneji JR, Rao MN (2009) Citrus breeding Breeding Plantation Tree Crops: Temperate Species: 105-134 37 Golein B, Koltunow AM, Talaie A, Zamani Z, Ebadi A (2005) Isolaton and characterizaton of microsatellites loci in the lemon (Citrus limon) Molecular Ecology Notes 5: 253-255 38 Golein B, Talaie A, Zamani Z, Ebadi A, Behjatnia A (2005) Assessment of genetc variability in some Iranian sweet oranges (Citrus sinensis [L.] Osbeck) and mandarins (Citrus reticulata Blanco) using SSR markers Int J Agri Biol 2: 167-170 39 Handa T, Ishizawa Y, Oogaki C (1986) Phylogenetc study of fracton I protein in the genus Citrus and its close related genera Jpn J Genet 61: 15-24 40 Hvarleva T, Kapari-Isaia T, Papayiannis L, Atanassov A, Hadjinicoli A, Kyriakou A (2008) Characterizaton of Citrus cultvars and clones in Cyprus through Microsatellite and RAPD Analysis Biotechnol Biotechnol Eq 22(3): 787-794 41 Inoue E, Kasumi M, Sakuma F, Anzai H, Amano K, Hara H (2006) Identficaton of RAPD marker linked to fruit skin color in Japanese pear (Pyrus pyrifolia Nakai) Scientia Horticulturae 107: 254-258 42 Jaccard A (1908) Nouvelles recherches sur la distributon florale Bulletin de la Société Vaudoise de Sciences Naturelles 44: 223-270 43 Jain PK, Saini ML, Pathak H, Gupta VK (2007) Analysis of genetc variaton in different banana (Musa pecies) variety using random amplified polymorphic DNAs (RAPDs) African Journal of Biotechnology 6(17): 1987-1989 44 Jannat M, Fotouhi R, Abad AP, Salehi Z (2009) Genetc diversity analysis of Iranian Citrus varietes using micro satellite (SSR) based markers Journal of Horticulture and Forestry 1(7): 120-125 45 JinPing X, LiGeng C, Ming X, HaiLin L, WeiQi Y (2009) Identficaton of AFLP fragments linked to seedlessness in Ponkan mandarin (Citrus reticulata Blanco) and conversion to SCAR markers Sci Hortic: 135-139 46 Kato M, Ikoma Y, Matsumoto H, Sugiura M, Hyodo H, Yano M (2004) Accumulaton of carotenoids and expression of carotenoid biosynthetc genes during maturaton in Citrus fruit Plant Physiol 134: 824-837 47 Li F, Gan S, Weng Q, Zhao X, Huang S, Li M, Chen S, Wang Q, Shi F (2008) RAPD and morphological diversity among four populatons of the tropical tree species Paramichelia baillonii (Pierre) Hu in China Forest Ecology and Management 255: 1793-1801 48 Liu Y, Liu DC, Wu B, Sun ZH (2006) Genetc diversity of pummelo (Citrus grandis Osbeck) and its relatves based on simple sequence repeat markers Chinese J Agri Biotechnol 3(2): 119-126 49 Machado MA, Coletta Filho HD, Targon MLPN, Pompeu JJ (1996) Genetc relatonship of Mediterranean mandarins (Citrus deliciosa Tenore) using RAPD markers Euphytica 92(3): 321326 50 Manthey JA, Guthrie N, Grohmann K (2001) Biological propertes of Citrus flavonoids pertaining to cancer and inflammaton Current medicinal chemistry 8: 135-153 51 Mariniello L, Sommella MG, Cozzolino A, Pierro PD, Ercolini D, Porta R (2004) Identficaton of campania Citrus Limon L by random amplified polymorphic DNA markers Food Biotechnol 18(3): 289-297 40 52 Moore GA (2001) Oranges and lemons: clues to the taxonomy of Citrus from molecular markers Trends Genet 17(9): 536-540 53 Nhan NT, Shimizu T, Hirohisa N, Omura M, Chau NM (2003) RAPD markers: Applicaton to varietal identficaton and analysis of genetc relatonships among Citrus varietes/species in Vietnam The 2003 Annual Workshop of JIRCAS (Secton B: Fruits Producton), Can Tho, Viet Nam 54 Orbović V, Calović M, Viloria Z, Nielsen B, Gmitter FGJ, Castle WS, Grosser JW (2008) Analysis of genetc variability in various tssue culture-derived lemon plant populatons using RAPD and flow cytometry Euphytica 161: 329-335 55 Paudyal KP, Haq N (2007) Variaton of pomelo (Citrus grandis (L.) Osbeck) in Nepal and partcipatory selecton of strains for further improvement Agroforestry system 72(3): 195-204 56 Pichaiyongvongdee S, Haruenkit R (2009) Investgaton of limonoids, flavanones, total polyphenol content and antoxidant actvity in seven Thai pummel cultvars Kasetsart J (Nat sci) 43: 458-466 57 Rao MN, Soneji JR, Chen C, Huang S, Gmitter FGJ (2008) Characterizaton of zygotc and nucellar seedlings from sour orange-like Citrus rootstock candidates using RAPD and EST-SSR markers Tree Genet Genom 4: 113-124 58 Roose ML, Close TM (2008) Genomics of Citrus, a major fruit crop of tropical and subtropical regions Pages 187-201 Genomics of Tropical Crop Plants, Springer 59 Santos JRP, Teixeira MA, Cares JE, Faleiro FG, Costa DC (2010) Contrastant banana accessions for resistance to the burrowing nematode, based on molecular markers RAPD Euphytica 172: 13-20 60 Shaaban EA, Abd-EL-Aal SKH, Zaied NS, Rizkalla AA (2006) Assessment of genetc variability on some orange accessions using RAPD-DNA markers Res J Agri Biol Sci 2(6): 564-570 61 Shahsavar AR, Izadpanah K, Tafazoli E, Sayed Tabatabaei BE (2007) Characterizaton of citrus germplasm including unknown variants by inter-simple sequence repeat (ISSR) markers Scientia Horticulturae 112: 310-314 62 Uzun A, Yesiloglu T, Aka-Kacar Y, Tuzcu O, Gulsen O (2009) Genetc diversity and relatonships within Citrus and related genera based on sequence related amplified polymorphism markers (SRAPs) Scientia Horticulturae 121: 306-312 63 Williams JGK, Kubelik AR, Livak KJ, Rafalski JA, Tingey SV (1990) DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetc markers Nucleic Acids Res 18: 6531-6535 64 Yi HL, Deng XX (2006) RAPD-based genetc analysis of offsprings from the sexual cross using allotetraploid Citrus somatc hybrid as pollen parent Science in China Series C: Life Sciences 50(3): 367-378 65 Zambrano AY, Demey JR, Gonzalez V (2003) In vitro selecton of a glyphosate-tolerant sugarcane cellular line Plant Mol Biol Rep 21: 365-373 [...]... DNA của các mẫu đáp ứng yêu cầu cho các phản ứng PCR -RAPD Kết quả được trình bày ở hình 3.1 và bảng 3.1 26 Hình 3.1 DNA tổng số của các giống bưởi nghiên cứu M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Hình 3.1 DNA tổng số của các giống bưởi nghiên cứu M: marker Lambda/HindIII, 1: Bưởi Thanh trà, 2: Bưởi Năm roi, 3: Bưởi Da xanh, 4: Bưởi Phúc Trạch, 5: Bưởi bành, 6: Bưởi láng, 7: Bưởi Tàu, 8: Bưởi. .. 9: Bưởi Thanh du, 10: Bưởi đỏ, 11: Bưởi Hồng da xanh,12: Bưởi cốm, 13: Bưởi trắng, 14: Bưởi Thái Lan, 15: Bưởi Trụ lông, 16: Thanh trà Tiên Phước, 17: Bưởi Đường lá goắn, 18: Bưởi Hải Phòng Bảng 3.1 Tỷ lệ hấp thụ ở bước sóng 260/280 nm và nồng độ và của các mẫu DNA từ lá Mẫu A260/280 ng/µL Bưởi Thanh trà Bưởi Năm roi Bưởi Da xanh Bưởi Phúc Trạch Bưởi bành Bưởi láng Bưởi Tàu Bưởi trẹm Bưởi Thanh du Bưởi. .. nghiên cứu có quan hệ di truyền xa nhau Trong số 295 band đa hình có đến 55 band DNA duy nhất, chiếm 18,46% Các band DNA này chỉ xuất hiện ở một giống bưởi mà không xuất hiện ở các giống bưởi còn lại, do đó chúng rất có ý nghĩa trong nghiên cứu nhằm phân biệt các giống bưởi khác nhau Trong 18 giống bưởi nghiên cứu có 14 giống được đặc trưng bởi ít nhất 1 band DNA duy nhất khi thực hiện phản ứng PCR -RAPD. .. band, một primer tạo thành 2 band và 2 primer tạo thành 3 band Nếu so sánh với sản phẩm PCR -RAPD của các giống bưởi còn lại thì đây là giống bưởi có sự khác biệt lớn nhất Kết quả điện di sản phẩm PCR -RAPD của 18 giống bưởi bởi primer AT14 được trình bày ở hình 3.6 Primer này tạo thành 12 band khi thực hiện phản ứng PCR -RAPD với 18 giống bưởi nghiên cứu, trong đó có 3 giống tạo thành 9 band (bưởi Bành, bưởi. .. các chỉ thị RAPD đặc hiệu cho 14 trong 29 số 18 giống bưởi nghiên cứu 30 Bảng 3.3 Các chỉ thị RAPD đặc trưng cho các giống bưởi nghiên cứu Giống Chỉ thị RAPD đặc trưng Bưởi Thanh trà C09-1.289, AT14-589, AT14-335, N06-443 Bưởi Năm roi AA10-740, B10-360, N09-880, N09-540 Bưởi Phúc Trạch A09-1.667, AD10-500, M20-542 Bưởi Láng A04-287, A18-726, N02-836, N06-655 Bưởi Trẹm A11-674, A18-1.811 Bưởi Thanh... (66%) đã thể hiện mức độ thay đổi di truyền lớn nhất với sự có mặt của 2 band RAPD mà không có ở cây mẹ [25] Năm 2005, Chadha và Gopalakrishna đã nghiên cứu tính đa dạng di truyền của nấm đạo ôn gây bệnh trên lúa ở Ấn Độ bằng phương pháp RADP Nghiên cứu nhằm xác định mối quan hệ di truyền và khả năng biến đổi di truyền trong những chủng nấm đạo ôn Tổng cộng có171 band đa hình được tạo ra khi khuếch đại... thu mẫu của 18 giống bưởi STT Giống bưởi Địa điểm thu mẫu 1 Bưởi Thanh Trà Thủy Biều, Huế 2 Bưởi Năm roi Ấp An Thiên, huyện Mỏ Cày Nam, Bến Tre 3 Bưởi Da xanh Bến Tre 4 Bưởi Phúc Trạch Quảng Bình 5 Bưởi Bành Thủy Biều, Huế 6 Bưởi Láng Thủy Biều, Huế 7 Bưởi Tàu Thủy Biều, Huế 8 Bưởi Trẹm Thủy Biều, Huế 9 Bưởi Thanh du Thủy Biều, Huế 10 Bưởi Đỏ Thủy Biều, Huế 11 Bưởi Hồng da xanh Trung tâm nghiên cứu và... thấp cho thấy 18 giống bưởi nghiên cứu rất khác biệt về mặt di truyền Hình ảnh điện di của các giống nghiên cứu bởi primer A18 được trình bày ở hình 3.2 Trong số 6 band DNA được tạo thành có 5 band đa hình (2 band duy nhất) và 1 band đơn hình (A18-359) Mặc dù số band DNA tạo thành không nhiều nhưng tính đa hình giữa các mẫu nghiên cứu được thể hiện khá rõ Kết quả này tương tự với kết quả của Shaanban và... mỗi giống tiến hành thu 3 mẫu ở 3 cây Các giống bưởi này về mặt hình thái khác nhau không đáng kể, từ lá, hoa cho đến hình dạng trái Sau khi tách chiết, điện di kiểm tra DNA tổng số và chạy PCR -RAPD thử nghiệm với một số primer, chúng tôi đã lựa chọn mỗi giống một mẫu DNA tổng số có khả năng khuếch đại tốt để làm khuôn mẫu cho các phản ứng PCR -RAPD tiếp theo Địa điểm thu mẫu của 18 giống bưởi nghiên cứu. .. và các dòng của chúng), sự đa dạng của tất cả các giống nghiên cứu (giống địa phương Polyphori, Lapithou và giống thương mại Lisbon) đã được phân biệt bởi 1 primer SSR và 2 primer RAPD Giống quýt địa phương Arakapas và Willowleaf thể hiện sự tương đồng di truyền hoàn toàn khi sử dụng cả chỉ thị microsatellite và RAPD Kết quả này cho thấy rằng giống địa phương Arakapas có thể là một dòng của Willowleaf,