Đánh giá đa hình di truyền của một số giống cam bằng kỹ thuật RAPD và ISSR

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRẦN THỊ THU THỦY Tên đề tài: ĐÁNH GIÁ ĐA HÌNH DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG CAM BẰNG KỸ THUẬT RAPD VÀ ISSR KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành/ngành: Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2012 - 2016 Thái Nguyên – năm 2016 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRẦN THỊ THU THỦY Tên đề tài: ĐÁNH GIÁ ĐA HÌNH DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG CAM BẰNG KỸ THUẬT RAPD VÀ ISSR KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Lớp : K 44 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2012 - 2016 Giảng viên hƣớng dẫn 1: TS Dƣơng Văn Cƣờng Giảng viên hƣớng dẫn 2: PGS TS Đào Thanh Vân Thái Nguyên – năm 2016 i LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập nghiên cứu để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp nỗ lực, cố gắng thân, nhân đƣợc giúp đỡ, hƣớng dẫn, bảo động viên thầy cô, bạn bè gia đình Nhân dịp hoàn thành khóa luận: Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS Dƣơng Văn Cƣờng , giảng viên Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên tạo điều kiện, tận tình hƣớng dẫn giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài hoàn thành khoá luận Tôi xin gửi lời cảm ơn đến PGS TS Đào Thanh Vân, Phó trƣởng phòng Đào tạo sau đại học, Giám đốc Trung tâm nghiên cứu trồng ôn đới, Trƣờng Đại học Nông lâm Thái Nguyên tận tình giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài hoàn thành khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn tới ThS Ma Thị Trang, KS Vũ Hoài Nam, cán phòng thí nghiệm Sinh học phân tử Công nghệ gene, Viện Khoa học Sự Sống, Đại học Thái Nguyên, trực tiếp bảo kĩ làm việc, tạo điều kiện tốt để học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên, thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên tận tình bảo, giúp đỡ, tạo điều kiện để học tập hoàn thành khoá luận Cuối xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, ngƣời bên cạnh động viên giúp đỡ suốt thời gian thực khoá luận Tôi xin chân thành cảm ơn! Thái nguyên, ngày tháng Sinh viên Trần Thị Thu Thủy năm 2016 ii DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1 Thành phần dinh dƣỡng cam tƣơi (tính 100g) Bảng 2.2: Diện tích, suất, sản lƣợng cam, quýt giới 2005 – 2010 Bảng 2.3: Tình hình sản xuất cam số nƣớc vùng châu Á năm 2010 Bảng 2.4: Tình hình sản xuất cam quýt giai đoạn 2006 - 2010 Bảng 2.5 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền cam, quýt giới 19 Bảng 2.6 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền Cam, quýt Việt Nam 30 Bảng 3.1 Danh sách 19 mẫu cam nghiên cứu 32 Bảng 3.2 Trình tự mồi RAPD mồi ISSR sử dụng 33 Bảng 3.3 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 33 Bảng 3.4 Danh mục loại hóa chất sử dụng đề tài 34 Bảng 3.5 Thành phần phản ứng RAPD ISSR 36 Bảng 4.1 Những thông số thay đổi qua quy trình 39 Bảng 4.2 Kết đo độ tinh nồng độ DNA 42 Bảng 4.3 Số phân đoạn DNA xuất mẫu tƣơng ứng với mồi 52 Bảng 4.4 Tỷ lệ phân đoạn đa hình 53 Bảng 4.5 Hệ số tƣơng đồng di truyền 20 mẫu cam, quýt 54 iii DANH MỤC HÌNH Trang Hình 3.1 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 37 Hình 3.2 Minh họa phân đoạn đồng hình, phân đoạn đa hình PCR-RAPD 37 Hình 4.1 Kết điện di DNA tổng số mẫu 10, 20 40 Hình 4.2 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR hai mẫu 10, 20 tách từ quy trình với mồi OPM-13 40 Hình 4.3 Kết điện di kiểm tra DNA tổng số từ 20 mẫu cam, quýt đƣợc tách theo quy trình 42 Hình 4.4 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD 20 mẫu cam, quýt với mồi OPA-08 43 Hình 4.5 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD 20 mẫu cam, quýt với mồi OPB-18 44 Hình 4.6 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD 20 mẫu cam, quýt với mồi OPC-08 45 Hình 4.7 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD 20 mẫu cam, quýt với mồi OPG-16 46 Hình 4.8 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD 20 mẫu cam, quýt với mồi OPG-17 46 Hình 4.9 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD 20 mẫu cam, quýt với mồi OPM-13 47 Hình 4.10 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD 20 mẫu cam, quýt với mồi OPA-04 48 Hình 4.11 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD 20 mẫu cam, quýt với mồi OPQ-18 49 Hình 4.12 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD 20 mẫu cam, quýt với mồi OPT-01 49 Hình 4.13 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD 20 mẫu cam, quýt với mồi OP0-04 50 iv Hình 4.14 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-ISSR 20 mẫu cam, quýt với mồi T1 50 Hình 4.15 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-ISSR 20 mẫu cam, quýt với mồi T2 51 Hình 4.16 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-ISSR 20 mẫu cam, quýt với mồi T3 51 Hình 4.17 Sơ đồ mô tả quan hệ di truyền 20 mẫu cam, quýt nghiên cứu 56 v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism Bp : Base pair – Cặp bazơ nitơ Cs : Cộng CTAB : Cetyl trimetyl ammonium bromide DNA : Deoxyribonucleic acid EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid FAO : Food and Agriculture Organization FHB : Fusarium hesd blight ISSR : Inter – simple sequence repeat PCR : Polymerase Chain Reaction RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA RFLP : Restriction fragment length polymorphism SSR : Simple sequence repeat TAE : Tris-acetate - EDTA TE : Tris - EDTA vi MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC BẢNG ii DANH MỤC HÌNH iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v MỤC LỤC .vi Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích đề tài 1.3 Yêu cầu đề tài 1.4 Ý nghĩa đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan cam, quýt 2.1.1 Nguồn gốc phân loại 2.1.2 Giá trị cam, quýt 2.2 Tình hình sản xuất cam, quýt giới Việt Nam 2.2.1 Tình hình sản xuất cam, quýt giới 2.2.2 Tình hình sản xuất cam, quýt Việt Nam 2.3 Các kỹ thuật sinh học phân tử đánh giá đa dạng di truyền 2.3.1 Kỹ thuật RAPD 2.3.2 Kỹ thuật ISSR 10 2.3.3 Một số kỹ thuật khác 11 2.4 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền cam, quýt giới nƣớc 12 2.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 12 2.4.2 Tình hình nghiên cứu nƣớc 28 vii Phần 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 3.1 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu 32 3.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 32 3.1.2 Vật liệu nghiên cứu 32 3.2 Thiết bị, hóa chất nghiên cứu 33 3.2.1 Thiết bị nghiên cứu 33 3.2.2 Hóa chất 34 3.3 Nội dung nghiên cứu 34 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 34 3.4.1 Phƣơng pháp tách chiết DNA 34 3.4.2 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng độ tinh DNA tổng số 35 3.4.3 Phƣơng pháp PCR-RAPD 36 3.4.4 Phƣơng pháp phân tích đa hình 37 3.4.5 Phƣơng pháp phân tích xử lí số liệu 37 Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 4.1 Tối ƣu hóa quy trình tách chiết DNA tổng số từ cam quýt 38 4.2 Phân tích phân đoạn DNA đa hình di truyền RAPD ISSR 43 4.2.1 Phân tích phân đoạn DNA đa hình di truyền RAPD với mồi 43 4.2.2 Phân tích phân đoạn DNA đa hình di truyền ISSR với mồi 50 4.3 Phân tích mối quan hệ di truyền giống cam nghiên cứu dựa giản đồ phả hệ DNA 54 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 59 5.1 Kết luận 59 5.2 Đề nghị 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cây cam (citrus sinensis (L) Osbeck) thuộc họ Rutaceae ăn lâu năm có hƣơng vị thơm ngon, giá trị dinh dƣỡng cao đƣợc nhiều ngƣời ƣa chuộng Trong thành phần cam chứa nhiều vitamin nhƣ: vitamin A, B1, C, B9; chất xơ; chất khoáng vi lƣợng; chứa nhiều chất chống oxy hóa có tác dụng lớn phòng ngừa tim mạch, chống khối u, chống viêm [1] Ngoài vỏ cam chứa lƣợng lớn tinh dầu mang mùi thơm đặc trƣng đƣợc sử dụng công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm dƣợc phẩm Ở Việt Nam nay, cam đƣợc trồng nhiều vùng miền hình thành vùng trồng cam tiếng nhƣ cam Xã Đoài (Nghệ An), cam sành Bố Hạ (Bắc Giang), cam sành Hàm Yên (Tuyên Quang), cam canh (Hà Nội)… mang lại lợi ích kinh tế cao Theo thống kê Bộ NN & PTNN năm 2011, diện tích có múi đƣợc trồng nƣớc ta đạt 124,057 ha, diện tích trồng cam chiếm 70,300 (xấp xỉ 56%) Tuy nhiên vùng địa lý khác phát triển giống cam khác ảnh hƣởng điều kiện tự nhiên, khí hậu, thổ nhƣỡng trình chọn lọc tự nhiên tạo nên đa dạng mặt di truyền cho giống cam Việc đánh giá đa hình di truyền loài cam, quýt cần thiết nhằm cung cấp thông tin cần ứng dụng công tác nghiên cứu chọn giống, sử dụng hợp lý bảo tồn nguồn gene quý tự nhiên sản xuất [8] Để đánh giá độ tƣơng đồng di truyền giống cam, quýt thị hình thái, cần có đánh giá sâu mặt di truyền đặc điểm hình thái đƣợc hình thành từ kết tƣơng tác kiểu gene môi trƣờng Trong năm gần việc sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử đƣợc ứng dụng rộng rãi phân tích đa dạng di truyền, xác định quan hệ họ hàng loài với Các thị phân tử có độ xác cao, nhanh chóng không bị phụ thuộc vào đặc điểm hình thái 50  Mồi OPO 04 Hình 4.13 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD 20 mẫu cam, quýt với mồi OP0-04 (L: Ladder kb, -20: Các mẫu nghiên cứu theo thứ tự nhƣ bảng 3.1) Hình ảnh điện di mồi OPO-04 cho kết phân đoạn DNA đƣợc khuếch đại với kích thƣớc nằm khoảng 600 – 2750 bp Có phân đoạn đồng hình (chiếm 12,5%), lại phân đoạn đa hình (chiếm 87,5%) thể tính đa hình cao với 20 mẫu nghiên cứu 4.2.2 Phân tích phân đoạn DNA đa hình di truyền ISSR với mồi  Mồi T1 Hình 4.14 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-ISSR 20 mẫu cam, quýt với mồi T1 (L: ladder kb, -20: Các mẫu nghiên cứu theo thứ tự nhƣ bảng 3.1) Từ ảnh điện di ta thấy mồi ISSR-T1 có phân đoạn đƣợc khuếch đại có kích thƣớc dao động khoảng 1100 – 2000 bp Tất phân đoạn đồng hình cho thấy với mồi ISSR-T1 20 mẫu nghiên cứu sai khác mặt di truyền 51  Mồi T2 Hình 4.15 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-ISSR 20 mẫu cam, quýt với mồi T2 (L: Ladder kb, -20: Các mẫu nghiên cứu theo thứ tự nhƣ bảng 3.1) Từ hình ảnh điện di cho thấy với mồi ISSR-T2 có phân đoạn DNA đƣợc khuếch đại, với kích thƣớc nằm khoảng 950 – 2500 bp Tất phân đoạn đa hình (chiếm 100%), thể tính đa hình cao với mẫu nghiên cứu  Mồi T3 Hình 4.16 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-ISSR 20 mẫu cam, quýt với mồi T3 (L: Ladder kb, -20: Các mẫu nghiên cứu theo thứ tự nhƣ bảng 3.1) Hình ảnh điện di cho thấy, mồi ISSR-T3 có phân đoạn DNA đƣợc khuếch đại với kích thƣớc dao động khoảng 1100 – 2400 bp Ở kích thƣớc 1100bp 1600 bp xuất phân đoạn đồng hình (chiếm 40%) đƣợc khuếch đại Còn lại phân đoạn đa hình (chiếm 60%) Tổng số băng xuất ứng với mồi mẫu cam, quýt đƣợc thống kê thể nhƣ bảng 4.3 bảng 4.4 52 Bảng 4.3 Số phân đoạn DNA xuất mẫu tƣơng ứng với mồi Mồi Mẫu S_PL S_KH/M1 S_KH/M2 S_KH/V1 S_KH/V2 M_KH/M1 M_KH/M2 M_KH/V1 M_KH/V2 S_HY1 S_HY2 V2-1 V2-2 NV1 NV2 XD1 XD2 TH32-1 TH32-2 Q_KH Tổng OPA -08 OPB -18 OPC -08 OPG -16 OPG -17 OPM -13 OPO -04 OPQ -18 OPT -01 OPA -04 T1 T2 T3 Tổng 3 3 3 3 3 5 5 5 72 5 5 5 5 6 6 7 7 108 5 5 5 6 5 5 4 94 2 2 3 3 3 2 3 3 3 55 6 5 6 6 5 6 6 112 6 6 4 5 6 4 93 6 4 5 6 6 4 97 6 5 6 5 4 4 5 87 7 8 8 8 10 10 9 9 6 156 4 4 5 4 4 4 4 3 84 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 80 1 2 2 2 2 2 2 2 34 4 4 4 3 4 4 4 4 4 76 55 57 55 60 52 61 59 57 57 61 61 64 63 57 61 61 52 41 59 54 1148 53 Kết cho thấy, với 13 mồi nghiên cứu tổng số phân đoạn thu đƣợc tất mẫu với tất mồi 1148 phân đoạn, trung bình 4,42 phân đoạn/mẫu Số phân đoạn DNA mẫu có biến động lớn mồi: Nhóm mồi OPT-01, OPG-17, OPB-18, OPO-04 cho số phân đoạn trung bình cao, tƣơng ứng đạt 7,8; 5,6; 5,4; 4,85 băng; mồi T2 cho số phân đoạn mồi thấp 1,7 băng/mồi, nhóm mồi lại cho số phân đoạn mẫu dao động 2,75 – 4,65 băng Bảng 4.4 Tỷ lệ phân đoạn đa hình STT Tên mồi OPA-08 OPB-18 57,14 OPC-08 7 100 OPG-16 66 OPG-17 11 11 100 OPM-13 7 100 OPA-04 10 80 OPO-04 87,5 OPQ-18 7 100 10 OPT-01 11 72,7 11 T1 0 12 T2 3 100 13 T3 5 100 91 75 82,42 Tổng Tổng số phân đoạn đƣợc khuếch đại Số phân đoạn đa hình Tỷ lệ (%) phân đoạn đa hình 80 Từ bảng 4.4 cho thấy tổng số phân đoạn DNA 20 mẫu cam, quýt phân tích 13 mồi 91 phân đoạn, có 75 phân đoạn đa hình (chiếm 54 82,42%) số phân đoạn đồng hình 16 phân đoạn (chiếm 17,58%) Kích thƣớc phân đoạn DNA nằm khoảng từ 200 – 3500 bp Số lƣợng phân đoạn tƣơng ứng với mồi nằm khoảng từ đến 11 phân đoạn, mồi nhân đƣợc phân đoạn DNA mồi ISSR-T2 (3 phân đoạn) mồi nhân đƣợc nhiều phân đoạn mồi OPG-17 (11 phân đoạn) Bảng 4.4 cho thấy, có 12 mồi sử dụng biểu tính đa hình với 20 mẫu nghiên cứu, mồi T1 không cho phân đoạn đa hình với 20 mẫu nghiên cứu 4.3 Phân tích mối quan hệ di truyền giống cam nghiên cứu dựa giản đồ phả hệ DNA Dựa xuất hay không xuất phân đoạn DNA giống điện di sản phẩm PCR RAPD ISSR xác định số đa dạng di truyền giống cam, quýt mức độ phân tử Các số liệu đƣợc tính toán phân tích theo chƣơng trình NTSYSpc phiên 2.1, theo quy ƣớc: có xuất băng sáng = 1; không xuất = Kết nhận đƣợc hệ số tƣơng đồng di truyền cá thể đƣợc thể nhƣ bảng 4.5 Hệ số tƣơng đồng di truyền phản ánh quan hệ di truyền giống cam với Hai giống gần mặt di truyền hệ số tƣơng đồng chúng lớn ngƣợc lại, hai giống có hệ số tƣơng đồng di truyền thấp mối quan hệ di truyền chúng xa Từ kết nhƣ bảng 4.5 cho thấy, hệ số di truyền 20 mẫu cam quýt dao động khoảng 0,57 đến 0,96 Trong đó, cặp mẫu kí hiệu M_KH/M1 M_KH/M2, mẫu M_KH/M2 M_KH/V1, mẫu M_KH/V1 M_KH/V2, mẫu V2-1 V2-2 có hệ số đồng dạng lớn 0,96; mẫu V2-1, TH32-1 Q_KH có hệ số tƣơng đồng nhỏ 0,57 Giống quýt (Q_KH) cho thấy có khác biệt di truyền lớn so với mẫu lại 55 Bảng 4.5 Hệ số tƣơng đồng di truyền 20 mẫu cam, quýt Giống (Kí hiệu) S_PL S_PL 1,00 S_KH/M S_KH/M S_KH/V S_KH/V M_KH/ M1 M_KH/ M2 M_KH/ V1 M_KH/ V2 S_KH/ M1 S_KH/ M2 S_KH/ V1 S_KH/ V2 M_KH/ M1 M_KH/ M2 M_KH /V1 M_KH /V2 S_HY1 S_H Y2 V2-1 V2-2 NV1 NV2 XD1 XD2 TH32-1 TH32-2 0,89 1,00 0,87 0,91 1,00 0,90 0,90 0,90 1,00 0,82 0,82 0,82 0,90 1,00 0,89 0,91 0,89 0,92 0,87 1,00 0,89 0,89 0,87 0,90 0,85 0,96 1,00 0,87 0,85 0,82 0,90 0,85 0,91 0,96 1,00 0,85 0,85 0,85 0,90 0,87 0,89 0,91 0,96 1,00 S_HY1 0,82 0,87 0,85 0,86 0,78 0,87 0,87 0,85 0,85 1,00 S_HY2 0,85 0,85 0,82 0.84 0,78 0,82 0,80 0,76 0,76 0,91 1,00 V2-1 0,76 0,78 0,74 0,77 0,71 0,76 0,74 0,71 0,71 0,74 0,76 1,00 V2-2 0,78 0,80 0,76 0,77 0,71 0,78 0,76 0,71 0,71 0,76 0.78 0.96 1,00 NV1 0,80 0,76 0,71 0.77 0,76 0,76 0,80 0,78 0,76 0,71 0,71 0,87 0,91 1,00 NV2 0,74 0,74 0,71 0,70 0,64 0,71 0,74 0,71 0,69 0,73 0,73 0,89 0,93 0,89 1,00 XD1 0,74 0,76 0,71 0,73 0,67 0,76 0,76 0,74 0,71 0,71 0,74 0,89 0,93 0,89 0,93 1,00 XD2 0,74 0,69 0,65 0,66 0,63 0,65 0,69 0,69 0,69 0,65 0,63 0,76 0,80 0,82 0,87 0,82 1,00 TH32-1 0,71 0,69 0,65 0,64 0,65 0,63 0,65 0,63 0,63 0,63 0,69 0,69 0,74 0,71 0,76 0,76 0,71 1,00 TH32-2 0,71 0,67 0,60 0,66 0,63 0,67 0,71 0,71 0,69 0,63 0,63 0,76 0,80 0,87 0,85 0,87 0,82 0,71 1,00 Q_KH 0,68 0,64 0,62 0,63 0,62 0,64 0,68 0,68 0,66 0,59 0,62 0,57 0,59 0,66 0,62 0,64 0,64 0,57 0,66 Q_KH 1,00 56 Sau phân tích hệ số đồng dạng di truyền 20 mẫu nghiên cứu, tiến hành xây dựng sơ đồ hình thể hình 4.17 để sai khác di truyền 20 mẫu cam, quýt nghiên cứu Mức độ khác đƣợc thể hệ số sai khác di truyền mẫu nghiên cứu Các mẫu nghiên cứu có hệ số di truyền tƣơng đƣơng đƣợc xếp vào nhóm nhóm có liên kết với Hình 4.17 Sơ đồ mô tả quan hệ di truyền 20 mẫu cam, quýt nghiên cứu Coefficient: Hệ số tƣơng đồng di truyền giống cam, hệ số lớn giống có mối quan hệ gần gũi 57 Cây phân loại hình 4.17 đƣợc tạo phân tích 20 mẫu nghiên cứu với 10 mồi RAPD mồi ISSR cho thấy hệ số tƣơng đồng di truyền mẫu cam, quýt nghiên cứu dao động khoảng từ 0,63 – 0,96; chứng tỏ mẫu cam, quýt có đa hình cao mặt di truyền Từ sơ đồ thấy đƣợc 20 mẫu cam, quýt đƣợc chia làm nhóm chính: Nhóm I: Là mẫu đối chứng quýt không hạt (Q_KH) Mẫu quýt nằm riêng biệt so với mẫu cam lại Khoảng cách di truyền so với mẫu cam lại nhóm II 0,37 Nhóm II: Bao gồm 19 mẫu cam Trong nhóm tiếp tục đƣợc chia thành nhóm phụ, bao gồm: Nhóm phụ I: chủ yếu giống cam nhập nội nhóm phụ II giống cam không hạt, với sai khác di truyền 0,30 (hệ số tƣơng đồng di truyền hai nhóm phụ 0,70) + Nhóm phụ I: Bao gồm mẫu, chủ yếu giống cam nhập nội, đƣợc chia tiếp thành cụm (cụm cụm 2) có sai khác di truyền 0,28 (tức hệ số tƣơng đồng di truyền 0,72)  Cụm 1: bao gồm mẫu: hai mẫu cam Valencica (V2-1, V2-2), mẫu cam Navel (NV2, NV1), hai mẫu cam xã Đoài (XD1, XD2) mẫu cam TH32-2 Trong đó, hai mẫu cam Valencica (V2-1 V2-2) có hệ số tƣơng đồng di truyền cao 0,96; hai mẫu NV2 XD1 với hệ số tƣơng đồng di truyền 0,93 Trong cụm có mẫu XD2 nằm tách biệt nhánh với tƣơng đồng di truyền với mẫu lại 0,81 (sự sai khác di truyền 0,19)  Cụm 2: Chỉ bao gồm mẫu TH32-1 Trong nhóm có giống cam TH32 giống cam chƣa biết rõ nguồn gốc, đƣợc lấy mẫu nông trƣờng 32 tỉnh Tuyên Quang Từ sơ đồ hình cho thấy, hai mẫu có sai khác lớn di truyền Hệ số tƣơng đồng di truyền với giống cam Valencica, Navel, xã Đoài giống TH32-2 có hệ số tƣơng đồng di truyền lớn (đạt 0.83) so với giống TH32-1 (đạt 0,72) Giống cam Xã Đoài (XD1) giống cam có nguồn gốc từ Nghệ An, nhiên trình sinh trƣởng phát triển Tuyên Quang điều kiện tự nhiên làm biến đổi kiển gene làm 58 cho giống cam có quan hệ gần gũi với giống cam Navel với hệ số tƣơng đồng di truyền 0,93 + Nhóm phụ II: Bao gồm 11 mẫu, chủ yếu giống cam địa phƣơng: cam sành Hàm Yên, cam sành Phù Lƣu (S_PL, S_HY) giống cam ghép Đƣợc chia làm cụm (cụm 1’ cụm 2’) với sai khác di truyền 0,18 (hệ số tƣơng đồng di truyền cụm 0,82)  Cụm 1’: Bao gồm mẫu: cam sành Phù lƣu, cam sành không hạt ghép gốc cam mật, cam sành không hạt ghép gốc cam Volka, cam mật không hạt ghép gốc cam mật cam mật không hạt ghép gốc cam volka (S_PL, S_KH/M1, S_KH/M2, S_KH/V1, S_KH/V2, M_KH/M1, M_KH/M2, M_KH/V1, M_KH/V2) Trong cụm có cặp nhóm: M_KH/M1 M_KH/M2, M_KH/V1 M_KH/V2 có hệ số tƣơng đồng di truyền cao 0,96 Tiếp theo cặp mẫu S_KH/M1 S_KH/M2 có hệ số tƣơng đồng 0,91 Bên cạnh cụm có mẫu cam sành không hạt ghép gốc cam Volka (S_KH/V2) nằm tách biệt thành nhánh cho thấy khác biệt với giống cam sành khác, với sai khác di truyền 0,15; sai khác ảnh hƣởng trình chọn lọc tự nhiên dẫn tới thay đổi kiểu gene  Cụm 2’: Bao gồm mẫu cam sành Hàm Yên (SHY1 SHY2) với hệ số tƣơng đồng di truyền cao đạt 0,91 Trong nhóm cho thấy có tƣơng đồng di truyền cao giống cam: giống cam mật đƣợc xếp thành cụm với hệ số tƣơng đồng di truyền đạt 0,92 Điều cho thấy chúng có mối quan hệ gần gũi mặt di truyền Từ kết phân nhóm sơ đồ quan hệ di truyền có sai khác rõ hai nhóm: Nhóm phụ I: bao gồm chủ yếu giống cam nhập nội Nhóm phụ II giống cam địa phƣơng Sự sai khác nguồn gốc giống cam hay điều kiện tự nhiên làm ảnh hƣởng tới kiểu gene chúng 59 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận  Đã tối ƣu hóa đƣợc quy trình tách chiết DNA tổng số từ cam, quýt cho độ tinh cao đứt gãy  Qua trình nghiên cứu với việc sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên RAPD mồi ISSR để khuếch đại DNA tổng số từ 20 mẫu cam, quýt thu đƣợc: - Tổng số 1148 phân đoạn DNA đƣợc khuếch đại từ hệ gene 20 mẫu cam, quýt Trung bình 4,42 phân đoạn/mẫu - Số phân đoạn DNA phân tích 13 mồi 91 phân đoạn, có có 75 phân đoạn đa hình (chiếm 82,42%) số phân đoạn đồng hình 16 phân đoạn (chiếm 17,58%) Trong 13 mồi sử dụng có 12 mồi thể tính đa hình với 20 mẫu cam, quýt; mồi T1 không cho phân đoạn đa hình phân tích với 20 mẫu cam, quýt - Hệ số tƣơng đồng di truyền mẫu cam, quýt dao động khoảng từ 0,57 – 0,96 - Từ sơ đồ phân loại nhận thấy 20 mẫu cam, quýt đƣợc chia thành nhóm với hệ số sai khác di truyền 0,37 (độ tƣơng đồng di truyền 0,63) - Cây sơ đồ chia 19 mẫu cam thành nhóm chính: + Nhóm phụ I: gồm mẫu chủ yếu bao gồm giống cam nhập nội cam Valencica, cam navel, cam TH32 cam Xã Đoài + Nhóm phụ II: bao gồm 11 mẫu cam hầu hết mẫu cam có nguồn gốc địa phƣơng: cam sành phù lƣu, cam sành không hạt, cam mật không hạt, cam sành Hàm Yên 5.2 Kiến nghị Kết hợp số kỹ thuật phân tích quan hệ di truyền khác nhƣ SSR, RFLP, để xác định mối quan hệ di truyền giống cam quýt để kết tin cậy cao TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng việt Đƣờng Hồng Dật (2003), Cam, chanh, quýt, bưởi kỹ thuật trồng, NXB Lao động-xã hội Nguyễn Văn Giang, Vũ Ngọc Lan, Tống Văn Hải (2013), Nghiên cứu đa dạng di truyền khoai Môn - Sọ thị phân tử DNA, Tạp chí Khoa học Phát triển, 11(1), - Nguyễn Hữu Hiệp, Trần Nhân Dũng, Đặng Thanh Sơn, Nguyễn Văn Đƣợc (2004), Đa dạng sinh học giống có múi huyện Gò Quao, tỉnh Kiên Giang, Tạp chí Khoa học, 1, 111 - 121 Vũ Văn Hiếu, Nông Thị Huệ, Nguyễn Thị Oanh, Ninh Thị Thảo, Vũ Quang Sáng, Nguyễn Thị Phƣơng Thảo (2015), Phân tích đa dạng di truyền mẫu giống cam sành Hà Giang thị RAPD ISSR, Tạp chí Khoa học Phát triển, 13(6), 867-875 Nguyễn Thanh Nhàn, Nguyễn Minh Châu, Tokurou Shimizu, Mitsuo Omura (2004), Ứng dụng RAPD marker phân biệt giống phân tích nhóm giống/loài thuộc chi Citrus Việt Nam, 48 - 56 pp., Nxb Nông Nghiệp Nguyễn Bá Phú, Nguyễn Bảo Vệ, Trần Nhân Dũng, Bùi Thị Cẩm Hƣờng (2011), Nhận diện xác định mối quan hệ di truyền hai cá thể quýt Đƣờng không hột đƣợc phát Đồng Bằng Sông Cửu Long dấu phân tử DNA, Tạp chí Khoa học, 20a, 108 - 118 Nguyễn Quang Thạch Tách chiết ADN, Viện sinh học Nông nghiệp Nguyễn Đức Thành (2014), Các kỹ thuật thị DNA nghiên cứu chọn lọc thực vật, Tạp chí sinh học, 36(3), 265-294 Trần Thị Oanh Yến, Nguyễn Ngọc Thi, Luro Francois (2004), Phân biệt tính đa dạng di truyền nguồn gen ăn có múi Việt Nam microsatellite marker, 57 - 66 pp., Nxb Nông Nghiệp II Tài liệu tiếng anh 10 Adam Healey, Agnelo Furtado, Tal Cooper, and Robert J Herny (2014), Protocol: a simple method for extracting next-generation sequencing quality genomic DNA from recalcitrant plant species, Plant Methods 11 Asadi Abkenar, and Isshiki S (2003), Molecular characterization and genetic diversity among Japanese acid citrus (Citrus spp.) based on RAPD markers, The Journal of Horticultural Science and Biotechnology, 78(1), 108-112 12 Baig M N R, Sapna GREWAL, and Santosh DHILLON (2008), Molecular characterization and genetic diversity analysis of citrus cultivars by RAPD markers, Turk J Agric For 33(2009), 375 - 384 13 Beedanagari SR, Dove SK, Wood BW, and Conner PJ (2005), A first linkage map of pecan cultivars based on RAPD and AFLP markers, Theor Appl Genet, 110(6), 1127 - 1137 14 Bhattacharya S, Dey T, Bandopadhyay T K, and Ghosh P D (2008), Genetic polymorphism analysis of somatic embryo-derived plantlets of Cymbopogon flexuosus through RAPD assay, Plant Biotechnology Reports, 2(4), 245-252 15 Davies, and F S (1986), The navel orange Rep., J Janick (ed.) AVI Press, Westport, Conn., In: Hort Reviews 16 De Pasquale F, Siracuga M, Abbate L, Tusa N, De Pasquale C, and Alonzo G (2006), Characterization of five sour orange clones through molecular markers and leaf essential oils analysis, Scisentia Horticulturae, 109(1), 54 - 59 17 Dehesdtani A, Kazemitabar S K, and Rahimian H (2007), Assessment of Genetic Diversity of Navel Sweet Orange Cultivars Grown in Mazandaran Province Using RAPD Markers, Asian Journal of Plant Sciences, 6(7), 1119 - 1124 18 Doyle and Doyle, Doyle and Dickson, and Cullings (1987), CTAB/ChloroformIsoamyl Alcohol DNA Extraction Protocol 19 Ebtsam M Hamza (2013), Genetic Diversity of Some Citrus Varieties Based on Microsatellite and RAPD Molecular Markers in Egypt, World Journal of Agricultural Sciences, 9(4), 316 - 324 20 Fang G, Hammar, and Grumet R (1992), A quick and inexpensive method for removing polysaccharides from plant genomic DNA, BioTechniques, 13(1), 52 - 56 21 Gupta V S, and Ranjekar P K (1994), Use of RFLP/RAPD approach in genetic diversity analysis, bacterial blight resistance gene tagging and DNA fingerprinting in rice 22 Helvécio Della Coletta Filho, Marcos Antonio Machado, M Luiza P.N Targon, and Jorgino Pompeu Jr (2000), The use of random amplified polymorphic DNA to evaluate the genetic variability of Ponkan mandarin (Citrus reticulata Blanco) accessions, Genetics and Molecular Biology, 23(1), 169 - 172 23 Machado M A, Coletta Filho H D, Targon m N P L, and PompeuJr J (1996), Genetic relationship of Mediterranean mandarins (Citrus deliciosa Tenore) using RAPD markers, Euphytica, 92(3), 321 - 326 24 Malik S K, Rohini M R, Susheel Kumar, Ravish Choudhary, Digvender Pal, and Rekha Chaudhury (2012), Assessment of Genetic Diversity in Sweet Orange [Citrus sinensis (L.) Osbeck] Cultivars of India Using Morphological and RAPD Markers, Agric Res 1(4), 317 - 324 25 Marinês Bastianel, Sérgio F Schwarz, Helvécio Della Coleta Filho, Linda Lee Lin, Marcos Machado, and Otto C Koller (1998), Identification of zygotic and nucellar tangerine seedlings (Citrus spp.) using RAPD, Genet Mol Biol., 21(1), 123 - 127 26 Marinês Bastianel, Ana Lúcia Cunha Dornelles, Marcos Antonio Machado Ester Wickert, Simone de Farias Maraschin, Helvécio Della Coletta Filho, and Gilmar Schäfer (2001), Characterization of citrus genotypes (Citrus spp.) using RAPDs markers, Ciência Rural, 31(5), 763 - 768 27 Mariniello L, Sommella M G, Cozzolino A, Di Pierro P, Ercolini D, and Porta R (2005), Identification of Campania Citrus Limon L by Random Amplified Polymorphic DNA Markers, Food Biotechnology, 18(3), 289 - 297 28 Murray M G, and Thompson W F (1980), Rapid isolation of high molecular weight plant DNA, Nucleic Acids Research, 8, 4321-4325 29 Nagai, and Tanigawa K O (1928), On Citrus pollination, Procthird, Pan pacific.Sci.Cong.2(2023 - 2029) 30 Naz S, Shahzadi K, Rashid S, Saleem F, Zafarullah A, and Shabbir Ahmad (2014), Molecular characterization and phylogentic relationship of different Citrus varieties of Pakistan, The Journal of Animal & Plant Sciences, 24(1), 315 - 320 31 Orozco C C, Chalmers K J, Waugh R, and Powell W (1994), Detection of diversity and selective gene introgression in coffee using RAPD markers, Theor Appl Genet., 87, 934 - 940 32 Patrícia Koehler-SantosI, Ana Lúcia Cunha DornellesII, and Loreta Brandão de FreitasI (2003), Characterization of mandarin citrus germplasm from Southern Brazil by morphological and molecular analyses, Pesq agropec bras., 38(7), 797 - 806 33 Rima El-Mouei, Wafaa Choumane, and Fayssal Dway (2011a), Characterization and Estimation of Genetic Diversity in Citrus Rootstocks, International Juornal of Agriculture & Biology, 13(4), 571 - 575 34 Rima El-Mouei, Wafaa Choumane, and Fayssal Dway (2011b), Molecular Characterization and Genetic Diversity in Genus Citrus from Syria, Int J Agric Biol., 13(2), 351 - 356 35 Saghai - maroof MA, Soliman KM, Jorgensen RA, and Allard RW (1984), Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics, Proc Natl Acad Sci USA, 81(24), 8014 - 8018 36 Shahzadi, Ahmed R, Hassan A, and Shah M M (2010), Optimization of DNA extraction from seeds and fresh leaf tissues of wild marigold (Tagetes minuta) for polymerase chain reaction analysis, Genet Mol Res., 9(1), 386 - 393 37 Shashi Ranjan, Garima Kishore, Vikash S Jadon, JP Bhatt, and Sanjay Gupta (2010), Standardization of extraction of genomic DNA and PCR-RFLP conditions of Allium stracheyi: A high altitude plant, Academia Arena, 2(7), 11 - 14 38 Sonia Chadha, and Gopalakrishna T (2005), Genetic diversity of Indian isolates of rice blast pathogen (Magnaporthe grisea) using molecular markers, Current Science, 88(9), 1466 - 1469 39 Sun G, bond M, Martin R, and Dong Z (2003), RAPD polymorphism in spring wheat cultivars and line with different level of Fusarium resistance, Theor Appl Genet., 106, 1059 - 1067 40 Yun-Jiang Cheng, Wen-Wu Guo, Hua-Lin Yi, Xiao-Min Pang, and Xiuxin Deng (2003), An Efficient Protocol for Genomic DNA Extraction From Citrus Species, Plant Molecular Biology Reporter, 21, 177a–177g ... rãi đánh giá đa dạng di truyền cam, quýt [3, 4, 17, 21, 22] Chính vậy, để đánh giá đƣợc đa dạng di truyền giống cam địa bàn tỉnh Tuyên Quang tiến hành thực đề tài: Đánh giá đa hình di truyền số. .. Tình hình sản xuất cam, quýt Việt Nam 2.3 Các kỹ thuật sinh học phân tử đánh giá đa dạng di truyền 2.3.1 Kỹ thuật RAPD 2.3.2 Kỹ thuật ISSR 10 2.3.3 Một số kỹ thuật. .. TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRẦN THỊ THU THỦY Tên đề tài: ĐÁNH GIÁ ĐA HÌNH DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG CAM BẰNG KỸ THUẬT RAPD VÀ ISSR KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên