Đánh giá đa hình di truyền của một số giống cam bằng kỹ thuật RAPD và ISSR

Trong những năm gần đây việc sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử được ứng dụng rộng rãi trong phân tích đa dạng di truyền, xác định quan hệ họ hàng giữa các loài với nhau.. Phân tích đ

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành/ngành: Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2012 - 2016

Thái Nguyên – năm 2016

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Lớp : K 44 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP

Khóa học : 2012 - 2016

Giảng viên hướng dẫn 1: TS Dương Văn Cường

Giảng viên hướng dẫn 2: PGS TS Đào Thanh Vân

Thái Nguyên – năm 2016

i

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp ngoài sự nỗ lực, cố gắng của bản thân, tôi đã nhân được sự giúp đỡ, hướng dẫn, chỉ bảo và động viên của thầy cô, bạn bè và gia đình Nhân dịp hoàn thành khóa luận:

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS Dương Văn Cường và ,

giảng viên Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo điều kiện, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài và hoàn thành khoá luận này

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến PGS TS Đào Thanh Vân, Phó trưởng phòng Đào

tạo sau đại học, Giám đốc Trung tâm nghiên cứu cây trồng ôn đới, Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

và hoàn thành khóa luận này

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới ThS Ma Thị Trang, KS Vũ Hoài Nam, cán bộ

phòng thí nghiệm Sinh học phân tử và Công nghệ gene, Viện Khoa học Sự Sống, Đại học Thái Nguyên, đã trực tiếp chỉ bảo kĩ năng làm việc, tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên, các thầy cô trong Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ, tạo điều kiện để tôi học tập và hoàn thành khoá luận này

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, những người đã luôn ở bên cạnh động viên giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khoá luận

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Thái nguyên, ngày tháng năm 2016

Sinh viên

Trần Thị Thu Thủy

ii

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng của cam tươi (tính trên 100g) 5

Bảng 2.2: Diện tích, năng suất, sản lượng cam, quýt trên thế giới 2005 – 2010 7

Bảng 2.3: Tình hình sản xuất cam ở một số nước vùng châu Á năm 2010 7

Bảng 2.4: Tình hình sản xuất cam quýt giai đoạn 2006 - 2010 8

Bảng 2.5 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền ở cam, quýt trên thế giới 19

Bảng 2.6 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền trên Cam, quýt ở Việt Nam 30

Bảng 3.1 Danh sách 19 mẫu cam nghiên cứu 32

Bảng 3.2 Trình tự các mồi RAPD và mồi ISSR sử dụng 33

Bảng 3.3 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 33

Bảng 3.4 Danh mục các loại hóa chất sử dụng trong đề tài 34

Bảng 3.5 Thành phần phản ứng RAPD và ISSR 36

Bảng 4.1 Những thông số thay đổi qua các quy trình 39

Bảng 4.2 Kết quả đo độ tinh sạch và nồng độ DNA 42

Bảng 4.3 Số phân đoạn DNA xuất hiện ở từng mẫu tương ứng với từng mồi 52

Bảng 4.4 Tỷ lệ sự phân đoạn đa hình 53

Bảng 4.5 Hệ số tương đồng di truyền của 20 mẫu cam, quýt 54

iii

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 3.1 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 37Hình 3.2 Minh họa phân đoạn đồng hình, phân đoạn đa hình trong PCR-RAPD 37Hình 4.1 Kết quả điện di DNA tổng số mẫu 10, 20 40Hình 4.2 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR của hai mẫu 10, 20 tách từ quy

trình 2 và 3 với mồi OPM-13 40Hình 4.3 Kết quả điện di kiểm tra DNA tổng số từ 20 mẫu cam, quýt đƣợc tách

theo quy trình 3 42Hình 4.4 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 20 mẫu cam, quýt với mồi

OPA-08 43Hình 4.5 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 20 mẫu cam, quýt với mồi

OPB-18 44Hình 4.6 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 20 mẫu cam, quýt với mồi

OPC-08 45Hình 4.7 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 20 mẫu cam, quýt với mồi

OPG-16 46Hình 4.8 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 20 mẫu cam, quýt với mồi

OPG-17 46Hình 4.9 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 20 mẫu cam, quýt với mồi

OPM-13 47Hình 4.10 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 20 mẫu cam, quýt với mồi

OPA-04 48Hình 4.11 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 20 mẫu cam, quýt với mồi

OPQ-18 49Hình 4.12 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 20 mẫu cam, quýt với mồi

OPT-01 49Hình 4.13 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 20 mẫu cam, quýt với mồi

OP0-04 50

iv

Hình 4.14 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-ISSR của 20 mẫu cam, quýt với mồi T1 50Hình 4.15 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-ISSR của 20 mẫu cam, quýt với mồi T2 51Hình 4.16 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-ISSR của 20 mẫu cam, quýt với mồi T3 51Hình 4.17 Sơ đồ mô tả quan hệ di truyền của 20 mẫu cam, quýt nghiên cứu 56

v

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism

Bp : Base pair – Cặp bazơ nitơ

CTAB : Cetyl trimetyl ammonium bromide

DNA : Deoxyribonucleic acid

EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid

FAO : Food and Agriculture Organization

FHB : Fusarium hesd blight

ISSR : Inter – simple sequence repeat

PCR : Polymerase Chain Reaction

RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA RFLP : Restriction fragment length polymorphism SSR : Simple sequence repeat

TAE : Tris-acetate - EDTA

vi

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC BẢNG ii

DANH MỤC HÌNH iii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v

MỤC LỤC vi

Phần 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích đề tài 2

1.3 Yêu cầu đề tài 2

1.4 Ý nghĩa của đề tài 2

1.4.1 Ý nghĩa khoa học 2

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về cây cam, quýt 3

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại 3

2.1.2 Giá trị của cây cam, quýt 4

2.2 Tình hình sản xuất cam, quýt trên thế giới và Việt Nam 6

2.2.1 Tình hình sản xuất cây cam, quýt trên thế giới 6

2.2.2 Tình hình sản xuất cây cam, quýt ở Việt Nam 8

2.3 Các kỹ thuật sinh học phân tử trong đánh giá đa dạng di truyền 8

2.3.1 Kỹ thuật RAPD 8

2.3.2 Kỹ thuật ISSR 10

2.3.3 Một số kỹ thuật khác 11

2.4 Tình hình nghiên cứu về đa dạng di truyền ở cam, quýt trên thế giới và trong nước 12

2.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 12

2.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 28

vii

Phần 3 : ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 32

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 32

3.1.2 Vật liệu nghiên cứu 32

3.2 Thiết bị, hóa chất nghiên cứu 33

3.2.1 Thiết bị nghiên cứu 33

3.2.2 Hóa chất 34

3.3 Nội dung nghiên cứu 34

3.4 Phương pháp nghiên cứu 34

3.4.1 Phương pháp tách chiết DNA 34

3.4.2 Phương pháp xác định hàm lượng và độ tinh sạch DNA tổng số 35

3.4.3 Phương pháp PCR-RAPD 36

3.4.4 Phương pháp phân tích đa hình 37

3.4.5 Phương pháp phân tích và xử lí số liệu 37

Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

4.1 Tối ưu hóa quy trình tách chiết DNA tổng số từ lá cam quýt 38

4.2 Phân tích các phân đoạn DNA đa hình di truyền bằng RAPD và ISSR 43

4.2.1 Phân tích các phân đoạn DNA đa hình di truyền bằng RAPD với từng mồi 43

4.2.2 Phân tích các phân đoạn DNA đa hình di truyền bằng ISSR với từng mồi 50 4.3 Phân tích mối quan hệ di truyền giữa các giống cam nghiên cứu dựa trên giản đồ phả hệ DNA 54

Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 59

5.1 Kết luận 59

5.2 Đề nghị 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1

Phần 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cây cam (citrus sinensis (L) Osbeck) thuộc họ Rutaceae là một trong những

cây ăn quả lâu năm có hương vị thơm ngon, giá trị dinh dưỡng cao được nhiều người ưa chuộng Trong thành phần quả cam chứa nhiều vitamin như: vitamin A, B1, C, B9; chất xơ; các chất khoáng vi lượng; chứa nhiều chất chống oxy hóa có tác dụng lớn trong phòng ngừa tim mạch, chống khối u, chống viêm [1] Ngoài ra vỏ cam còn chứa một lượng lớn tinh dầu mang mùi thơm đặc trưng được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm

Ở Việt Nam hiện nay, cây cam được trồng ở nhiều vùng miền hình thành các vùng trồng cam nổi tiếng như cam Xã Đoài (Nghệ An), cam sành Bố Hạ (Bắc Giang), cam sành Hàm Yên (Tuyên Quang), cam canh (Hà Nội)… mang lại lợi ích kinh tế cao Theo thống kê của Bộ NN & PTNN năm 2011, diện tích cây có múi được trồng ở nước ta đạt 124,057 ha, trong đó diện tích trồng cam chiếm 70,300 ha (xấp xỉ 56%) Tuy nhiên ở mỗi vùng địa lý khác nhau sẽ phát triển những giống cam khác nhau do ảnh hưởng của điều kiện tự nhiên, khí hậu, thổ nhưỡng và quá trình chọn lọc tự nhiên tạo nên sự đa dạng về mặt di truyền cho các giống cam Việc đánh giá đa hình di truyền của các loài cam, quýt là cần thiết nhằm cung cấp các thông tin cần ứng dụng trong công tác nghiên cứu chọn giống, sử dụng hợp

lý và bảo tồn các nguồn gene quý trong tự nhiên và trong sản xuất [8]

Để có thể đánh giá độ tương đồng di truyền của các giống cam, quýt ngoài các chỉ thị về hình thái, cần có những đánh giá sâu hơn về mặt di truyền do các đặc điểm hình thái được hình thành từ kết quả tương tác giữa kiểu gene và môi trường Trong những năm gần đây việc sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử được ứng dụng rộng rãi trong phân tích đa dạng di truyền, xác định quan hệ họ hàng giữa các loài với nhau Các chỉ thị phân tử có độ chính xác cao, nhanh chóng và không bị phụ thuộc vào các đặc điểm hình thái

2

Hiện nay có một số phương pháp được sử dụng trong đánh giá đa dạng di truyền trên cây cam, quýt như ISSR, SSR, RAPD…Trong số đó RAPD (Random amplified polymorphic DNA) và ISSR (Inter – simple sequence repeat) là các kỹ thuật được sử dụng rộng rãi trong đánh giá đa dạng di truyền ở cam, quýt [3, 4,

17, 21, 22]

Chính vì vậy, để có thể đánh giá được sự đa dạng di truyền của các giống cam

trên địa bàn tỉnh Tuyên Quang chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Đánh giá đa

hình di truyền của một số giống cam bằng kỹ thuật RAPD và ISSR”

1.2 Mục đích đề tài

Phân tích mối quan hệ di truyền giữa các giống cam nghiên cứu bằng phương pháp RAPD và ISSR

1.3 Yêu cầu đề tài

- Tách chiết được DNA tổng số từ lá cam, quýt đủ điều kiện để thực hiện phản ứng RAPD và ISSR

- Phân tích được các phân đoạn DNA của các giống cam nghiên cứu bằng kỹ thuật RAPD và ISSR

- Phân tích được mối quan hệ di truyền giữa các giống cam nghiên cứu dựa trên sơ đồ phả hệ DNA

1.4 Ý nghĩa của đề tài

1.4.1 Ý nghĩa khoa học

Phân tích đa dạng di truyền của các giống cam bằng phương pháp RAPD và ISSR sẽ cung cấp thêm số liệu, thông tin và khả năng ứng dụng chỉ thị phân tử trong công tác chọn, tạo các giống, bảo tồn nguồn gene

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Phân tích đa dạng di truyền ở các giống cam giúp ứng dụng trong công tác chọn giống, lai tạo những giống có năng suất, chất lượng cao

3

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về cây cam, quýt

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại

2.1.1.1 Nguồn gốc

Cây cam là một loại cây ăn quả thuộc họ cây có múi, cho đến nay chưa có tài liệu nào nói chính xác về nguồn gốc của cây ăn quả có múi Tuy nhiên nhiều kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng cam, quýt có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Đông Nam châu Á, sự lan trải của cam quýt trên thế giới gắn liền với lịch

sử buôn bán đường biển và các cuộc chiến tranh trước đây Cam, quýt được di chuyển từ ấn Độ đến Châu Phi bởi các thuyền buôn, di chuyển đến Châu Mỹ bởi các nhà thám hiểm và thuyền buôn người Tây Ban Nha và Bồ đào Nha, sau đó chúng được trồng rộng rãi và phổ biến

Giống Cam ngọt (Citrus sinensis Osbeck) được xác định có nguồn gốc ở miền

Nam Trung Quốc, Ấn Độ và miền Nam Indonexia Sau đó được mang đến trồng ở Châu âu, Địa Trung Hải và Châu Phi vào thế kỷ 13 đến thế kỷ 17 [15]

Giống cam Washington Navel trên thế giới hay có tên gọi cam Navel ở Việt

Nam được cho là dạng đột biến tự nhiên từ một giống cam ngọt, giống này được phát hiện ở Bhia Brazil, lần đầu tiên được trồng ở úc năm 1928, ở Florida (Mỹ) năm

1835, ở California năm 1970 và nó nổi tiếng ở Washington D.C Sau đó được trồng khắp các vùng trồng cam, quýt trên thế giới [29]

Tóm lại cam, quýt có nguồn gốc ở miền Nam Châu Á và được lan trải khắp trên thế giới qua buôn bán đường biển, các cuộc chiến tranh trước đây

2.1.1.2 Phân loại

Cam, quýt thuộc: Giới Plantae

Bộ Rutales

Họ Rutaceae Chi Citrus

4

Hiện nay, tồn tại hai hệ thống phân loại cam quýt được nhiều người áp dụng Cách phân loại thứ nhất, theo Tanaka (Nhật Bản) cam quýt gồm 160 – 162 loài

(Specias) Tanaka đã quan sát, ghi chép tỉ mỉ đặc điểm hình thái của các giống đã

biến dị này và phân chúng thành một loài mới hoặc giống mới có tên khoa học được bắt đầu bằng tên giống hay tên loài đã phát sinh ra chúng và kết thúc bằng chữ “Horticulturre’’ Cách phân loại thứ hai của Swingle đã chia cam quýt ra làm

16 loài Tuy nhiên, các nhà khoa học vẫn thường sử dụng hệ thống phân loại của Tanaka để gọi tên các giống cam quýt vì bảng phân loại này chi tiết tới từng giống [1]

2.1.2 Giá trị của cây cam, quýt

Cam, quýt là một trong những sản phẩm có giá trị và được nhiều người ưa chuộng, nó mang lại nguồn dinh dưỡng quý cho con người Không chỉ có ý nghĩa về kinh tế, nguồn dinh dưỡng mà cam quýt còn có giá trị cao về dược liệu Hiện nay, sản phẩm của cây cam, quýt ngoài cung cấp cho thị trường trong nước còn là nguồn xuất khẩu sang các nước trong khu vực góp phần vào tăng trưởng nền kinh tế

- Giá trị dinh dưỡng: Quả cây có múi có nhiều chất dinh dưỡng nên giá trị

sử dụng rất cao Trong 100g thịt quả có chứa 6 - 12% đường, chủ yếu là đường sacaroza Hàm lượng vitamin C trong quả khoảng 40 - 90 mg/100g tươi, 0,4 - 1,2% các acid hữu cơ, trong đó có nhiều loại acid có hoạt tính sinh học cao Trong quả còn có chứa các chất khoáng và dầu thơm, ngoài ra còn một số dưỡng chất thiết yếu khác [1]

thế giới, người ta đã dùng các loại quả thuộc chi Citrus làm thuốc chữa bệnh Ở

thế kỷ XVI, ở Trung Quốc và Ấn Độ đã dùng quả cam quýt để phòng ngừa bệnh dịch hạch, chữa trị bệnh phổi và bệnh chảy máu dưới da Ở Mỹ vào những năm 30 của thế kỷ XX, các thầy thuốc đã dùng các quả cam quýt kết hợp với insulin để chữa trị bệnh đái tháo đường Ở Nga, bắt đầu từ thế kỷ XI, quả cây có múi đã được sử dụng để phòng ngừa và chữa trị trong y học dân gian Ở nước ta, nhân dân đã dùng cây ăn quả có múi để phòng và chữa trị một số bệnh từ lâu [1]

6

- Giá trị kinh tế: Cây ăn quả có múi là một trong những loại cây lâu năm, nhanh cho thu hoạch Một số loài có thể cho thu hoạch quả ở năm thứ 2 sau khi trồng Ở nước ta, năng xuất trung bình của cam quýt ở thời kỳ 8 tuổi có thể đạt tới

16 tấn/ha Cây cam quýt có thể sống và cho thu hoạch quả trong vòng 15 - 30 năm Trong trường hợp đất tốt, được chăm sóc đầy đủ và áp dụng các biện pháp kỹ thuật thâm canh cao, trong các điều kiện khí hậu thích hợp và không bị sâu bệnh gây hại nặng, tuổi thọ của cam quýt có thể kéo dài trên 50 năm [1]

- Giá trị sinh thái, môi trường: Cây có múi là cây ăn quả lâu năm được trồng trong các vườn cây của gia đình hộ nông dân hoặc trồng trên đồi tại các trang trại Trong quá trình sinh sống, các loại cam, quýt, bưởi tiết ra oxy trong không khí làm không khí trở nên trong lành Trong những chừng mực nhất định các chất bay hơi từ cây cam quýt có tác dụng diệt một số loài vi khuẩn làm cho không khí trở nên sạch hơn, môi trường sống của con người tốt hơn Cam quýt trồng trên các đồi đất, bên cạnh việc cho quả còn có tác dụng phủ xanh đất, giữ nước ngăn cản dòng chảy mạnh trên mặt đất sau các trận mưa lớn, do đó có ý nghĩa lớn trong việc làm giảm quá trình xói mòn, rửa trôi đất Ở vùng trung du và miền núi, cam quýt được trồng trong các vườn rừng, vườn đồi trong các hệ thống VAC và VACR là phương thức canh tác được áp dụng rộng rãi tại các trang trại nông nghiệp và đã thể hiện nhiều

ưu điểm trong việc thực hiện nền nông nghiệp bền vững [1]

2.2 Tình hình sản xuất cam, quýt trên thế giới và Việt Nam

2.2.1 Tình hình sản xuất cây cam, quýt trên thế giới

Mặc dù cam, quýt có nguồn gốc từ vùng Đông Nam Á nhưng hiện nay cam, quýt được trồng phổ biến ở nhiều vùng trên thế giới, với hơn 100 quốc gia

Theo thống kê của FAO năm 2011 tình hình xuất nhập khẩu cam, quýt trên thế giới như sau: Nhập khẩu 37,13 nghìn tấn có giá trị 31.272,38 nghìn USD; xuất khẩu 63,71 nghìn tấn có giá trị 38.112,3 nghìn USD Sản phẩm cam, quýt có giá trị thương mại rất lớn trong nền kinh tế thế giới

Sản lượng (tấn)

(Nguồn: FASTAT/FAO Statistics - năm 2012)

Từ năm 2005 đến năm 2010 diện tích trồng cam trên thế giới tăng từ 7920811

ha lên 8645339 ha Bên cạnh đó, năng suất và sản lượng cam cũng tăng liên tục theo các năm

Theo số liệu thống kê chưa đầy đủ của FAO về tình hình sản xuất cam ở một

số nước châu Á năm 2010 như sau:

Bảng 2.3: Tình hình sản xuất cam ở một số nước vùng châu Á năm 2010

STT Vùng, lãnh thổ

Năm 2010 Diện tích

(ha)

Năng suất (tạ/ha)

Sản lượng (tấn)

(Nguồn: FASTAT/FAO Statistics - năm 2012)

Diện tích trồng cam lớn nhất ở khu vưc Châu Á là Trung Quốc với trên 3 triệu

ha, năng suất đạt 133,141 tạ/ha và sản lượng 5.003.289 tấn Đứng thứ 2 là Ấn Độ với diện tích 617.200 ha, năng suất đạt 101,557 tạ/ha, Inđônexia là nước có năng suất cao nhất 350,460 tạ/ha

8

2.2.2 Tình hình sản xuất cây cam, quýt ở Việt Nam

Nước ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, thích hợp với nhiều loại cây trồng trong đó có các loài cây ăn quả, đặc biệt là cam, quýt Cam, quýt được trồng phổ biến ở nhiều vùng trên khắp cả nước Có nhiều vùng trồng cam quýt cho năng suất cao, phẩm chất tốt có tiếng trong nước phải kể đến vùng trồng cam như: Đồng Bằng Sông Cửu Long, vùng cam Trung du miền núi phía Bắc với nhiều giống cam đặc sản, chất lượng như: Cam Vinh, cam Yên Bái, cam Bắc Quang, quýt Bắc Sơn, cam sành Hàm Yên

Theo Bộ NN & PTNT về tình hình sản xuất cam, quýt trong giai đoạn 2006 –

(Nguồn: Cơ sở dữ liệu bộ NN & PTNT 2012)

Nhìn vào bảng thống kê ta thấy diện tích sản xuất cam, quýt tăng từ năm 2006 với 62.2 nghìn ha lên 65.1 nghìn ha năm 2007 sau đó giảm dần đến năm 2010 xuống còn 60.9 nghìn ha Năng suất trung bình năm 2006 rất thấp chỉ đạt 98.1 tạ/ha

và chúng tăng dần đến năm 2010 đạt năng suất 118.6 tạ/ha Tổng sản lượng cam, quýt trong năm 2010 đạt cao nhất là 720.1 nghìn tấn

2.3 Các kỹ thuật sinh học phân tử trong đánh giá đa dạng di truyền

2.3.1 Kỹ thuật RAPD

2.3.1.1 Giới thiệu về kỹ thuật RAPD

Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) được định nghĩa là

sự đa hình các đoạn DNA được khuếch đại ngẫu nhiên Chỉ thị phân tử RAPD dựa trên kỹ thuật PCR với sự bắt cặp ngẫu nhiên của các đoạn mồi ngắn (10 nucleotide)

có trình tự biết trước với mạch khuôn, nhân những đoạn có trình tự bổ sung với

9

trình tự mồi Mồi sử dụng cho phản ứng RAPD là các mồi ngẫu nhiên có nhiệt độ kéo dài mồi thấp từ 34 – 370C Mặc dù là mồi ngẫu nhiên nhưng vẫn phải đủ 2 tiêu chí là tỷ lệ GC tối thiểu là 40% và không có trình tự các bazơ đầu xuôi và ngược giống nhau [8]

Về cơ bản kỹ thuật RAPD được thực hiện theo 3 bước:

Sản phẩm PCR – RAPD thường được điện di trên gel agarose 1.5 - 2% hay điện di trên gel polyacrylamide

2.3.1.2 Những ưu điểm và nhược điểm của kỹ thuật RAPD so với các kỹ thuật sinh học phân tử khác

Bên cạnh đó, RAPD còn là một kỹ thuật lấy dấu DNA có độ nhạy cao, có hiệu quả trong việc xác định kiểu gene, lập bản đồ di truyền, lập bản đồ gene liên kết và phân tích con lai F1

Mỗi mồi có thể nhân bản nhiều vị trí trong hệ gene, cho phép phát hiện ra những đột biến hiếm giữa các mẫu có quan hệ gần gũi, xác định tính đa dạng sinh

và chỉ tạo ra được các chỉ thị trội do đó không phân biệt được các cá thể đồng hợp với các cá thể dị hợp [8]

2.3.1.3 Một số ứng dụng của kỹ thuật RAPD

Các nghiên cứu cho thấy kỹ thuật RAPD là một phương pháp rất hiệu quả trong việc phân tích quần thể và nguồn gốc loài, nghiên cứu di truyền loài, lập bản

đồ di truyền Kỹ thuật RAPD cũng được sử dụng để nhận biết và phân loại các giống cây khác nhau, xác định sự đa hình di truyền của các cây tái sinh có nguồn gốc từ mô sẹo

Kỹ thuật RAPD được sử dụng để phân tích và xác định mối quan hệ thân thuộc giữa các loài hay giữa các cá thể để phục vụ cho công tác lai tạo hoặc phân loại

Chỉ thị RAPD còn là công cụ hiệu quả trong việc tìm ra các chỉ thị phân tử để phân biệt các giống hay loài khác nhau Sun và cs (2003) đã sử dụng 160 mồi RAPD để phân tích tính đa hình DNA của 35 giống lúa mì xuân kháng bệnh FHB

(Fusarium hesd blight) và phát hiện ra 3 chỉ thị RAPD liên quan đến tính kháng

bệnh FHB [39]

Orozco và cs (1994) đã ứng dụng kỹ thuật RAPD để khảo sát mối quan hệ di truyền và tiến hóa của các giống cà phê được lai tạo từ các loài bố, mẹ ở các vùng sinh thái khác nhau làm cơ sở cho việc ghép cặp lai với mục đích tạo con lai có đặc tính quý [31]

2.3.2 Kỹ thuật ISSR

Kỹ thuật ISSR (Inter – simple sequence repeat) được định nghĩa là kỹ thuật dựa trên PCR dùng để nhân đoạn gene nằm giữa 2 vùng lặp lại giống hệt nhau và ngược chiều nhau Kỹ thuật này sử dụng các tiểu vệ tinh như các mồi trong phản

11

ứng PCR với một mồi cho nhiều locus đích để nhân bản chủ yếu các chuỗi lặp lại đơn giản với độ dài khác nhau Các tiểu vệ tinh sử dụng như mồi trong kỹ thuật ISSR có thể là 2, 3, 4, hoặc 5 nucleotide Các mồi sử dụng có thể không phải mồi neo hoặc là mồi neo ở đầu 3’ hoặc 5’ với 1 đến 4 nucleotide thoái hóa kéo đến các chuỗi bên cạnh Kỹ thuật ISSR sử dụng mồi dài (15 đến 30 nucleotide) vì vậy nhiệt

độ bắt mồi cao dẫn đến độ ổn định cao của phản ứng Sản phẩm có độ dài 200-2000

bp nên có thể phân tách trên cả gel agarose và polyacrylamide Kỹ thuật ISSR được

sử dụng rất rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền, nghiên cứu đặc điểm di truyền trong quần thể, lấy dấu di truyền, đánh dấu gen, xác định cây trồng, phân tích nguồn gốc, xác định sự thay đổi genome và đánh giá con lai [8]

Kỹ thuật ISSR có một số lợi thế so với các kỹ thuật khác là có thể phân biệt được các kiểu gen gần và không cần thông tin về trình tự gen của cây nghiên cứu Giống như RAPD, ISSR là kỹ thuật nhanh, dễ tiến hành Nó ưu việt hơn RAPD là cho nhiều thông tin và có thể lặp lại ở các thí nghiệm do mồi dài hơn Nhược điểm chủ yếu của ISSR là tạo ra các chỉ thị trội và sự dị đồng nhất của các sản phẩn nhân bản do sự di chuyển đồng thời

2.3.3 Một số kỹ thuật khác

Chỉ thị RFLP (Restriction Fragmennt Length Polymorphism)

Được định nghĩa là tính đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn, biểu thị sự khác nhau về kích thước các phân đoạn được tạo ra khi cắt đồng thời DNA bằng các enzyme cắt giới hạn khi có sự thay đổi trình tự trên DNA Đa hình DNA được xác định bằng cách lai đoạn dò DNA đánh dấu với DNA sau khi cắt bằng enzyme cắt giới hạn và được thấm truyền lên màng lai bằng phương pháp Southern Blot Kết quả tạo ra các phân đoạn DNA khác nhau [8]

RFLP là chỉ thị đồng trội do đó có thể phát hiện được các alen khác nhau của một locus trong hệ gen nhân, hệ gene ti thể hay hệ gene lục lạp bằng một mẫu dò đặc hiệu Chỉ thị RFLP có mức đa hình cao và khả năng lặp lại cao, cho phép phân tích đồng thời nhiều mẫu, tuy nhiên không được sử dụng rộng rãi do: cần DNA có chất lượng cao, cần có các đoạn DNA dò Kỹ thuật RFLP được sử dụng trong nghiên cứu lai tạo hay chuyển gene vào cá thể khác, đánh giá đa dạng di truyền [8]

12

Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism):

Kỹ thuật AFLP được sử dụng để phát hiện đa hình DNA Phân tích AFLP được kết hợp cả RFLP và PCR bằng việc gắn các chuỗi nhận biết vào mồi hay còn gọi là chuỗi tiếp hợp (adapter) để nhân chọn lọc các phân đoạn DNA được cắt hạn chế Các cặp mồi thường tạo được từ 50 đến 100 băng trong một phân tích Số lượng băng phụ thuộc vào số nucleotide chọn lọc trong tổ hợp mồi Kỹ thuật AFLP cho phép lấy dấu DNA từ bất kỳ nguồn gốc nào Kỹ thuật này có một số ưu điểm như: có độ tin cậy và lặp lại cao; không cần thông tin về trình tự DNA của cơ thể nghiên cứu; cho nhiều thông tin do có khả năng phân tích số lượng lớn locus đa hình với một tổ hợp mồi trên một gel và có thể cho thấy các locus đặc thù; các số liệu có thể lưu giữ trong cơ sở dữ liệu để so sánh.Có thể dùng phân biệt các cá thể rất gần nhau, lập bản đồ genome [13]

Kỹ thuật SSR (Simple sequence Repeats)

Chỉ thị SSR là sự khuếch đại các đoạn lặp đơn giản (những đoạn DNA lặp lại một cách có trật tự, phân bố nhiều trong khắp hệ gene của sinh vật nhân chuẩn) Chỉ thị phân tử SSR là những đoạn DNA ngắn gồm một số nucleotide lặp lại liên tiếp, mỗi đơn vị có chiều dài từ 4 đến 6 cặp bazơ số lượng đơn vị lặp lại thay đổi từ 1 đến

40 đơn vị

Kỹ thuật SSR dựa trên nguyên lý PCR dùng các cặp mồi đặc hiệu để nhân các đoạn trình tự SSR Sự khác nhau trong cấu trúc đơn vị lặp lại dẫn đến sự thay đổi độ dài đoạn lặp lại được nhân lên và xác định khi chạy điện di tren gel agarose hay gel polyacrylamide

SSR là các marker đồng trội, có tính đa hình cao và đáng tin cậy nên được sử dụng nhiều trong nghiên cứu đa dạng di truyền trên nhiều đối tượng cây trồng, nó còn được sử dụng trong lập bản đồ gene, chọn giống phân tử

2.4 Tình hình nghiên cứu về đa dạng di truyền ở cam, quýt trên thế giới và trong nước

2.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu tính đa dạng di truyền của

chi Citrus bằng các chỉ thị sinh học phân tử

13

Abkenar và cs (2003) sử dụng kỹ thuật RAPD nghiên cứu đặc điểm phân tử và

khoảng cách di truyền giữa các loài Citrus ở Nhật Đối tƣợng nghiên cứu gồm 31 loài Citrus khác nhau, trong đó có 6 loài cam chua, 4 loài “Yuzu” và 21 loài họ

hàng Sử dụng 27 mồi kết quả có 108 chỉ thị đƣợc tạo thành, 76 chỉ thị là đa hình, trung bình là 2,8 chỉ thị trên một mồi Cây phân loại cho thấy các loài cam chua rất khác với các tloài “Yuzu” và họ hàng của chúng Các loài “Yuzu” có mối quan hệ gần gũi nhau, tuy nhiên sự đa dạng di truyền ở các loài khá cao, biểu lộ các nguồn gốc khác nhau của chúng Trong nghiên cứu này, một số mồi RAPD có thể giúp phân biệt giữa các loại cây trồng gần gũi nhƣ OPA-17 và OPE-20 chỉ có ở

“Kabosu” mà không có ở “Aka kabosu”; mồi OPA-20, OPB-05 và OPE-16 phân biệt các cây chỉ có ở “Aka kabosu” mà không có ở “Kabosu” [11]

Kỹ huật RAPD đã đƣợc sử dụng để phân biệt các cây con có nguồn gốc từ

phôi tâm đƣợc tạo thành từ phép lai giữa các giống quýt Montenegrina (Citrus deliciosa Tenore) và King (Citrus nobilis Loureiro) Phôi tách ra từ hạt giống, sau

đó đƣợc nhân giống invitro và đƣợc trồng ở điều kiện nhà kính 4 mồi ngẫu nhiên đƣợc sử dụng với 54 mẫu cây có nguồn gốc hữu tính từ tổng 202 cá thể Phân tích

di truyền đã sắp xếp các cá thể vào các nhóm riêng biệt với khoảng cách di truyền lớn nhất là 20% [25]

Machado và cs (1996) đã dùng chỉ thị RAPD đánh giá đa hình di truyền của

39 loài quýt Địa Trung Hải Sử dụng 21 mồi ngẫu nhiên, kết quả thu đƣợc 111 băng, trung bình mỗi mồi có 2,2 chỉ thị RAPD Thuật toán UPGMA đƣợc sử dụng

để phân tích các nhóm cho thấy sự khác biệt di truyền thấp giữa các loài quýt Địa

Trung Hải, trong khi các dạng lai của chúng với các loài Citrus khác lại có sự khác

biệt lớn hơn về di truyền Bằng kỹ thuật RAPD cho thấy giữa các mẫu có sự khác nhau về di truyền khá thấp, có thể chúng là một dòng đơn Với sự đa hình thấp và số lƣợng dạng lai lớn có thể đƣa ra giả thuyết tất cả các loài quýt Địa Trung Hải là

dạng lai của loài quýt Citrus reticulate Blanco [22]

Dehesdtani và cs (2007) đánh giá đa dạng di truyền của các cây cam ngọt

(Citrus sinensis Navel) trồng ở Mazandaran (Iran) bằng chỉ thị RAPD với 21 mồi

14

ngẫu nhiên và 52 mẫu lá của các cây có ba hình thái quả khác nhau là: vỏ nhẵn, vỏ nhám và nửa nhám Bốn mồi đã tạo ra các băng đa hình có tính lặp lại Trong số các băng tạo ra từ 4 mồi có 70,13% là băng đa hình, sự đa hình di truyền cao nhất là ở nhóm vỏ nhẵn và vỏ nhám [17]

Malik và cs (2012) đã đánh giá đa dạng di truyền cam (Citrus sinensis (L.)

Osbeck) giống cây của Ấn Độ bằng chỉ thị RAPD Sử dụng 20 mồi ngẫu nhiên và

22 giống C sinensis để phân tích về hình thái và di truyền Tổng cộng có 99 băng

được tạo ra, trong đó có 51 băng đa hình (chiếm 51,83%) Mức độ đồng dạng di truyền đồng dạng di truyền dao động trong khoảng 0,48-1,00 (trung bình 0,77) cho thấy giữa các giống có mức độ đa dạng di truyền thấp mặc dù có sự biến đổi về hình thái cao Cây phân loại tách các giống thành 2 nhóm chính, trong đó 2 giống Delta Valencia và Sweet Orange cho thấy sự khác biệt với các giống còn lại Một số mồi tạo ra các băng đặc biệt có thể sử dụng để nhận biết các giống Nghiên cứu này chỉ

ra sự đa dạng di truyền thấp trong các giống C sinensis, và có thể giải thích bởi

thực tế có nhiều sự thay đổi kiểu hình do một số đột biến soma [23]

Naz và cs (2014) đã tiến hành nghiên cứu tính chất phân tử và mối quan hệ di

truyền giữa các giống Citrus khác nhau ở Pakistan Mối quan hệ di truyền giữa 17

giống cam, quýt thương mại quan trọng, bao gồm những giống địa phương và một

số giống lai đã được đánh giá bằng kỹ thuật RAPD với 15 mồi được lựa chọn trong

số 25 mồi Tổng số 188 băng với 153 băng đa hình, trung bình 13 băng mỗi mồi Hệ

số Jaccard đã được sử dụng để phân tích sự tương đồng di truyền hoặc không giống nhau giữa các giống Cây phân loại đã tách 17 giống cam quýt thành 4 cụm chính, giá trị tương đồng di truyền quan sát thấy là 0,66 với hai giống Kinnow và kinnow không hạt (Mandarin), và hai giống Meiwa và Marumi (quất) cho thấy giá trị khác biệt tối đa (0,85) Sự khác biệt về di truyền giữa các giống cam quýt cao nghiên cứu này cho thấy rằng chúng không có nguồn gốc tương tự nhau [30]

Rima El-Mouei và cs (2011) đã nghiên cứu về đặc điểm và ước lượng về tính

đa dạng di truyền trong các giống Citrus gốc ghép bằng sử dụng 10 microsatellite

và 17 mồi RAPD Các phân tích DNA cho biết các đặc tính của tất cả các mẫu và

15

phát hiện các mức độ khác nhau về tính đa hình di truyền Chỉ thị cụ thể, phân biệt gốc ghép, đã đƣợc các định và có thể sử dụng nhƣ là điểm đánh dấu hỗ trợ trong việc nhân giống Sự đa dạng di truyền và mối quan hệ giữa các gốc ghép có giá trị cao nhất trong cam chua và thấp nhất ở quýt Cleopatra

Dữ liệu dựa trên chỉ thị SSR và RAPD đã đƣợc sử dụng để ƣớc tính sự khác nhau về di truền và thiết lập cây di truyền phản ánh mối quan hệ giữa các gốc ghép khác nhau Kết quả phân tích RAPD: sử dụng 17 mồi để phân tích 31 mẫu, thu đƣợc

143 băng; trong đó có 119 băng đa hình và 24 băng đơn hình Số lƣợng các băng dao động từ 4 ( mồi OPS-04) đến 12 (mồi OPB-20) với mức trung bình 8,4 băng mỗi mồi Mức độ đa hình cao với các cặp mồi khác nhau, nó dao động từ 40% (OPB-04, OPE-13) đến 100% (OPM-08, OPK-03 và OPG-14) Phân tích Microsatellite: 10 mồi SSR đƣợc dùng trong nghiên cứu này đã thành công ở tất cả các kiểu gene và phát hiện đa hình giữa các gốc ghép Citrus Syria; tổng số alen đƣợc tạo ra bởi 10 mồi là 48 alen, khoảng từ 2 alen (Org-8, Org-29 và Org-31) đến

9 alen (Org-23) mỗi locus, với trung bình 4,8 alen/locus; số lƣợng cao nhất của các alen (22) đã đƣợc phát hiện ở ba lá trong một cuống trong khi số thấp nhất (16) đucợ phát hiện ở quýt Cleopatra; giá trị đa hình cao nhất ở cặp mồi Org-20 (0,77)

và tối thiểu (0,39) ở cặp mồi Org-8

Chỉ thị cụ thể và đa dạng di truyền: mồi cụ thể đã đƣợc xác định trong nghiên cứu này, nó tạo ra các đoạn đặc biệt và cụ thể hoặc alen trong một kiểu gene rõ ràng; sự đa dạng di truyền đƣợc đánh giá cho mỗi gốc ghép, giá trị thấp nhất phát hiện ở Sanki trong khi cao nhất ở cam chua Phân tích phát sinh loài: các thông tin dựa vào dữ liệu RAPD và SSR đã sử dụng để tính toán sự giống nhau và khoảng cách di truyền giữa các gốc ghép khác nhau, các giá trị thu đƣợc đƣợc sử dụng để thiết lập cây di truyền tạo ra bởi UPGMA cho thấy rằng tất cả các gốc ghép đƣợc

phân loại thành 2 nhóm chính, đầu tiên là của P trifoliata và các giống lai của nó;

và bao gồm các phần còn lại của gốc ghép, nhánh thứ hai đƣợc chia thành các nhóm

riêng biệt, đầu tiên gồm các kiểu gene của cam quýt chua (M sanki và M cleopatra) và cụm thứ hai là tập hợp phần còn lại của các kiểu gene [33]

16

Baig và cs (2008) đã nghiên cứu về đặc tính phân tử và phân tích tính đa dạng

di truyền của cây có múi bằng kỹ thuật RAPD Trong số 40 mồi, 25 mồi đã được lựa chọn để đánh giá tương đồng di truyền và mối quan hệ của 18 cây có múi, trong

đó có 13 loài và 5 giống lai Tạo ra 250 băng có 231 băng đa hình và một số loài hoặc chỉ thị RAPD cụ thể cho giống đó Hệ số Jaccard được sử dụng để tính toán sự tương đồng di truyền UPGMA sử dụng để tạo ra cây di truyền tách biệt rõ ràng Jatti-Khatti từ tất cả các cụm lớn với hệ số tương đồng 0,61 Giá trị tương đồng di truyền trung bình quan sát trên tất cả các kiểu gene là 0,63; với hai giống cam ngọt Jaffa và Blood red cho thấy sự tương đồng lớn nhất (82%) Các Jatti-Khatti và King Mandarin có di truyền đa dạng nhất Các biến thể di truyền giữa các giống khá cao cho thấy nguồn gốc khác nhau của chúng [12]

Ebtsam M Hamza (2013) đánh giá đa dạng di truyền của một số giống cây Citrus ở Ai Cập dựa vào chỉ thị microsatellite và RAPD Sử dụng 2 chỉ thị này để

phân tích 19 cây Citrus trồng ở Ai Cập Phân tích RAPD với 9 mồi cho tổng số 71

băng, trong đó 49 băng đa hình mặt khác, đánh dấu microsatellite cho kết quả 37 alen từ 8 cặp mồi SSR SSR và RAPD đã đưa ra một số băng và alen cụ thể cho phép phân biệt giữa cây trồng và một số giống Phân tích phát sinh loài đã chứng

minh sự tương đồng di truyền và mối quan hệ giữa 5 giống thuộc Citrus phân tích,

hệ số tương đồng di truyền dao động trong khoảng 0,626 – 0,879 Cam chua, chanh tây Rangpur, chanh Volkamer và macrophylla được xếp cùng 1 nhóm và cụm khác gồm quýt và Citrang Troyer Trong khi đó Citrang C35 và quýt Balady ở nhóm khác kết quả này có thể là do nguồn gốc của các giống cây trồng và chứng minh ý kiến cho rằng quýt là bố mẹ của cam chua và sau đó là bố mẹ của chanh Volkamer

và tất cả các giống quýt có thể được bắt nguồn từ sự lai tạo của nó hoặc lai chéo với

các loài Citrus khác Nếu không, giống quýt có thể được tạo ra từ đột biết của loài

quýt thực Chỉ thị RAPD và SSR có thể được sử dụng hiệu quả trong các định gene trong quá trình nhân giống 18]

Bastianel và cs (2001) đã sử dụng chỉ thị RAPD để đánh giá sự tương đồng về

mặt di truyền của 15 giống Citrus ở Brazil, gồm 4 giống cam ngọt (C sinensis

17

Osbeck), 4 giống quýt (C reticulata Blanco, C nobilis Loureiro, C sunki Loureiro

và C deliciosa Tenore), cam chua (C aurantium L.), bưởi chùm (C paradisi Marcf), bưởi (C grandis Osbeck), thanh yên (C medica L.), chanh cốm (C latifolia) và 2 dạng lai (C clementina T × (C tangerine T × C paradise Macf.))

Sử dụng 12 mồi ngẫu nhiên để đánh giá sự tương đồng di truyền, độ tương đồng di truyền giữa các giống quýt thấp nhất là 81% độ tương đồng di truyền thấp hơn thấy

ở các loài C medica, C grandis và C latifolia Bốn giống cam ngọt không có sự

khác nhau dựa vào chỉ thị RAPD chúng có độ tương đồng cao [24]

Năm 2006, De Pasquale và cs đã đánh giá sự đồng dạng di truyền 5 dòng khác

nhau của loài cam chua (Citrus aurantium L.) có sự khác biệt về đặc điểm hình thái

bằng 11 mồi ISSR và 6 mồi RAPD (OPH04, OPAT14, OPH15, OPM04, OPO14 và OPN14) Dòng AACNR32 cho một kiểu băng đặc trưng với tất cả các mồi, trong mỗi trường hợp đều có từ 1 đến 3 băng đa hình mà có thể phân biệt nó với các dòng khác Các dòng còn lại có các kiểu băng rất giống nhau, trừ các sản phẩm thu được bởi mồi ISSR (CA)8RG, (AC)8YG và mồi RAPD (OPH04) Với mồi (CA)8RG dòng AACNR32 được phân biệt với các dòng khác bởi một băng đơn hình 1800 bp và không có đoạn khuếch đại 800 bp có ở tất cả các dòng còn lại Dòng AACNR9A được phân biệt bởi không có mặt của băng khuếch đại 500 bp Mặt khác, dòng AACNR26A không phân biệt được với các dòng còn lại khi sử dụng các mồi trên [16]

Mariniello và cs (2005) sử dụng kỹ thuật RAPD với 44 mồi để xác định sự đa hình di truyền của 10 giống chanh ở vùng Campania, miền Nam nước Ý Mọi mồi đều tạo ra sản phẩm khuếch đại trong đó 5 mồi tạo ra các băng có thể dùng để xác định các giống cây trồng: mồi OPL02 (cho 2 băng), mồi OPL16 (cho 1 băng) chỉ có

ở giống Sorrento mà không có ở giống khác; mồi OPL14 phân biệt giống Amalfi, mồi OPL19 phân biệt giống Procida, cuối cùng mồi OPL13 phân biệt giống Gloria d’Amalfi Kết quả cho thấy mức độ tương đồng giữa các giống chanh nghiên cứu khá cao (lớn hơn 80%) và có thể xếp chúng vào 4 nhóm Nhóm 1 gồm Nappoli và

S Agnello; nhóm 2 gồm Gloria d’Amalfi, Sorrento, Procida, Sfusato d’Amalfi, Varigato và Cannellino; nhóm 3 là Massa Lubrense và nhóm 4 là Amalfi [26]

18

Rima el-mouei và cs (2011) đã mô tả đặc điểm và tính đa dạng di truyền trong Citrus ở Syria Nhóm tác giả đã sử dụng 10 mồi RAPD và 11 mồi SSR để phân tích

những biến đổi di truyền và mối quan hệ giữa 4 nhóm chính của chi Citrus (Lemon,

Mandarin, Grapefruit & Sweet orange) 31 giống được đại diện bởi 93 mẫu cây đã được sử dụng Giá trị đa dạng di truyền cao nhất là ở nhóm Mandarin (0,513) và thấp nhất ở nhóm bưởi (0,074) Các dữ liệu RAPD và SSR được sử dụng để tạo ra

ba ma trận, một là với dữ liệu RAPD, một với dữ liệu SSR và một là sử dụng cả 2

dữ liệu RAPD và SSR Cây sơ đồ được tạo ra khi kết hợp 2 dữ liệu đã phân các loài nghiên cứu thành 2 nhóm chính: nhóm đầu tiên bao gồm ba giống (Meyer, Monachello và Interdonato) thuộc chi Lemon; nhóm thứ 2 bao gồm hai cụm chính, tất cả các giống liên quan đến Mandarin (trừ mẫu ortanique nằm ở nhóm cùng với các giống thuộc cam ngọt) Ba giống Grapefruit (bưởi) đã được nhóm lại cùng một nhóm [34]

Helvécio Della Coletta Filho và cs (2000) sử dụng RAPD để đánh giá sự biến

đổi di truyền của Ponkan mandarin (Citrus reticulata Blanco) Tác giả sử dụng 25

mồi RAPD để đánh giá 19 mẫu Có 112 band được khuếch đại nhưng chỉ có 32 band đa hình tên 5 mẫu, 14 mẫu còn lại không có sự biến đổi di truyền với hệ số tương đồng di truyền cao nhất là 1 Sự sai khác di truyền chỉ xảy ra ở 5 mẫu (Sylhat, Warnurco, Green Rind, Tangor và Hung Kait) với hệ số tương đồng di truyền là 0,83 Có thể giải thích cho kết quả 14 mẫu không có sự sai khác di truyền do có cùng một nguồn gốc duy nhất và có tên địa phương khác nhau, hoặc do nó bị biến đổi di truyền nhưng không phát hiện ra được, chẳng hạn như đột biến điểm mà không thể phát hiện bởi RAPD [21]

Patrícia Koehler-Santos và cs (2003) nghiên cứu đặc tính của cây cam quýt ở miền Nam Brazil bởi các phân tích hình thái học và phân tử 37 mẫu từ 34 giống quýt khác biệt được đánh giá bởi các đặc điểm hình thái và bằng chỉ thị microsatellite 8 trong số 9 mồi sử dụng thể hiện tính đa hình, đánh dấu cụ thể đã tìm thấy cho một số giống Cây sơ đồ di truyền được xây dựng với kết quả hình thái chia 37 mẫu thành 4 nhóm , trong khi với chỉ thị microsatellite nhóm 37 giống thành chỉ 3 nhóm Sự khác biệt về di truyền không cao [32]

19

Kỹ thuật RAPD cũng được nhiều tác giả sử dụng trong nghiên cứu ở các đối tượng khác nhau Năm 2008, Bhattacharya và cs đánh giá sự di truyền của các phôi

soma có nguồn gốc từ các cây con của Cymbopogon flexuosus bằng kỹ thuật RAPD

Mẫu DNA từ cây mẹ va 18 cây con được tái sinh từ callus chọn ngẫu nhiên để tiến hành phản ứng RAPD với 6 mồi để chọn các dòng thuần Tổng cộng có 64 băng được tạo thành với 19 băng đa hình Hệ số đồng dạng di truyền cho thấy các dòng nghiên cứu là đồng nhất hay giống đến hơn 92% so với cây mẹ, trừ CL2 và CL9 (66%) thể hiện mức độ thay đổi di truyền lớn nhất với sự có mặt 2 băng mà không

có ở cây mẹ [14]

Năm 2005, Chadha và Gopalakrishna nghiên cứu tính đa dạng di truyền của nấm đạo ôn gây bệnh trên lúa ở ấn độ bằng phương pháp RAPD Nghiên cứu nhằm xác định mối quan hệ di truyền và khả năng biến đổi di truyền trong các chủng nấm đạo ôn để có những biện pháp phòng bệnh trên lúa Nghiên cứu sử dụng 33 mồi và

20 chủng nấm đạo ôn (chiếm khoảng 64%), tổng cộng có 171 băng được tạo thành, kích thước sản phẩm khuếch đại thay đổi từ 0.2 đến 3,0 kb số lượng băng khuếch đại thu được nằm trong khoảng 3 (OPF03) đến 14 (OPG10 và OPG17), trung bình

là 8,2 hệ số tương đồng nằm trong khoảng 0,76 đến 0,92 Sự đa hình cao có thể giải thích do kết quả của sự tiến hóa trong tự nhiên, sự chuyển gene…[37]

Bảng tóm tắt tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền ở cam, quýt bằng phương pháp sinh học phân tử được trình bày ở bảng sau:

Bảng 2.5 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền ở cam, quýt trên thế giới Năm Tên bài báo, tác

giả, năm công

bố

Đối tượng, vật liệu nghiên cứu

tham khảo

Những nghiên cứu đa dạng di truyền trên cây cam, quýt bằng phương pháp

- Sử dụng 21 mồi RAPD

- Kết quả thu được 111 băng, trung bình mỗi mồi có 2,2 chỉ thị

- Cây di truyền cho thấy sự khác biệt di truyền thấp giữa các

Machado

và cs [22]

20

RAPD markers” loài quýt Địa Trung

Hải

- Các dạng lai của chúng với các loài

Montenegrina

(Citrus deliciosa

Tenere) và King (Citrus nobilis

Loureiro)

- Sử dụng 4 mồi RAPD

- Phân tích di truyền sắp xếp các cá thể vào

2 nhóm lớn Một nhóm bao gồm các cá thể giống với bố King

(Citrus nobilis

Loureiro) và nhóm còn lại gồm các cá thể

Montenegrina (Citrus deliciosa Tenere) với

khoảng cách di truyền lớn nhất là 20%

Marinês Bastianel

(Citrus reticulata

Blanco)

- 25 mồi RAPD được sử dụng

- Kết quả có 112 băng đucợ khuếch đại nhưng chỉ có 32 băng đa hình được khuếch đại ở 5 mẫu, 14 mẫu còn lại không có sự biến đổi di truyền (hệ số tương đòng di truyền là 1)

- 5 mẫu (Sylhat, Warnurco, Green Rind, Tangor và Hung Kait)

có sự sai khác về di truyền với hệ số tương đồng di truyền là 0,83

- 14 mẫu không sai

Helvécio Della Coletta Filho và cs [21]

21

khác về di truyền có thể

do nó có chung nguồn gốc nhưng có tên địa phương khác nhau hoặc

do biến đổi di truyền nhưng không phát hiện

2 dạng

- 12 mồi RAPD được sử dụng

- Độ tương đồng di truyền thấp nhất là giữa các giống quýt là 81%

- Bốn giống cam ngọt không có sự khác nhau chúng có sự tương đồng di truyền cao

Marinês Bastianel

có 6 loài cam chua, 4 loài

“Yuzu” và 21 loài họ hàng

- Sử dụng 60 mồi, 27 mồi được phân tích

- Tạo ra 108 chỉ thị, có

76 chỉ thị đa hình, trung bình 2,8 chỉ thị trên một mồi

- Cây phát sinh loài cho thấy các loài cam chua rất khác với các loài

“Yuzu” và họ hàng của chúng

- Các loài “Yuzu” có mối quan hệ gần gũi với nhau, tuy nhiên sự

đa dạng di truyền ở các loài khá cao, thể hiện nguồn gốc khác nhau của chúng

- Một số mồi RAPD có thể sử dụng để phân biệt các loài cây trông

Abkenar

và cs [11]

22

gần gũi nhau như:

OPA-17 và OPE-20 chỉ

có ở “Kabosu” mà không có ở “Aka kabosu” mồi OPA-20, OPB-05 và OPE-16 phân biệt cây chỉ có ở

“Aka kabosu” mà không có ở “Kabosu”

- Sử dụng 44 mồi RAPD

- Tất cả các mồi đều tạo ra sản phẩm khuếch đại

- 5 mồi tạo ra các băng

có thể xác định các giống cây trồng: mồi OPL02 (cho 2 băng), OPL16 (cho 1 băng) chỉ có ở giống Sorrento

mà không có ở giống khác; Mồi OPL14 phân biệt giống Amalfi; mồi OPL19 phân biệt giống Procida; mồi OPL13 phân biệt giống Gloria d’Amalfi

- Mức độ tương đồng giữa các giống chanh nghiên cứu khá cao (lớn hơn 80%) và được xếp thành 4 nhóm

Nhóm 1 gồm Nappoli

và S Agnello; nhóm 2 gồm Gloria d’Amalfi, Sorrento, Procida, Sfusato d’Amalfi,

Cannellino; nhóm 3 là Massa Lubrense và nhóm 4 là Amalfi

Mariniello

và cs [26]

Mazandaran

52 mẫu lá của các cây có hình thái quả: vỏ nhẵn (soft rind), vỏ nhám (Rough rind), nửa nhám (nucellar), giống cam Navel chuẩn (Standard navel)và giống cây chưa rõ kiểu gene (Unknown navel)

- Sử dụng 21 mồi RAPD

- 4 mồi tạo ra các băng

có tính đa hình lặp lại

Trong số 864 băng được tạo thành từ 4 mồi

có 70,13% băng đa hình

- Sự đa hình di truyền cao nhất ở nhóm vỏ nhẵn và vỏ nhám (100%) Thấp nhất ở nhóm vỏ nửa nhám (48,28%)

- Giống nucellars và các giống chưa rõ kiểu gene (Unkknown navel) có khoảng cách

di truyền cao nhất(0,5693) chỉ ra sự khác biệt di truyền giữa chúng Trong khi các giống nucellar và giống Navel chuẩn (standard navel) có khoảng cách

di truyền thấp nhất (0,1370)

- Cây sơ đồ nhóm giống nucellar và Standard thành 1 nhóm với hệ số tương đồng cao nhất (0,8720) cho thấy sự gần gũi của chúng

- 25 mồi RAPD được sử dụng

- Kết quả tạo ra 250 băng, có 231 băng đa hình

- Cây phân loại tách biệt rõ ràng Jatti – Khatti từ tất cả các cụm lớn với hệ số tương

Baig và cs [12]

24

đồng 0,63 Hai giống cam ngọt Jaffa và Blood red có sự trương đồng lớn nhất 0,82 Các giống Jatti – Khatti và King Mandarin có sự di truyền đa dạng nhất

- Hệ số đa dạng di truyền khá cao cho thấy nguồn gốc khác nhau của các giống

- 20 mồi RAPD

- Kết quả tạo ra 99 băng, có 51 băng đa hình (chiếm 51,83%)

Mức độ đồng dạng di truyền dao động trong khoảng 0,48-1,00 (trung bình 0,77) Cho thấy giữa các giống có mức độ đa dạng di truyền thấp

- Cây phân loại tách các giống thành 2 nhóm chính, 2 giống Delta Valencia và Sweet orange khác biệt với các giống còn lại

- Nghiên cứu này chỉ ra

sự đa dạng di truyền

thấp trong các giống C

sinensis có thể giải

thích được sự biến đổi kiểu hình do một số đột biến soma

- Kết quả tạo ra 188 băng với 153 băng đa hình, trung bình 13 băng mỗi mồi

Naz và cs [30]

- 15 mồi RAPD được sử dụng

- Cây phân loại tách 17 giống cam, quýt thành

4 cụm chính Giá trị tương đồng di truyền thấp nhất 0,66 giữa 2 giống Kinnow và Kinnow không hạt (Mandarin), cao nhất là 0,85 giữa hai giống Meiwa và Marumi (quất) Sự khác biệt di truyền giữa các giống cao cho thấy chúng không có nguồn gốc tương tự nhau

Những nghiên cứu đa dạng di truyền trên cây cam, quýt sử dụng phương pháp

- Sử dụng phân tích về hình thái và 9 chỉ thị microsatellite

- Với chỉ thị hình thái chia 37 mẫu thành 4 nhóm

- 8 trong số 9 mồi thể hiện tính đa hình, có những chỉ thị cụ thể đã tìm thấy cho một số giống

- Chỉ thị microsatellite chỉ chia 37 mẫu thành 3 nhóm Hệ số sai khác

về di truyền không cao

Patrícia Koehler-SantosI và

chi Citrus và 1

từ Poncirus

- Sử dụng 10 mồi

microsatellite

và 17 mồi RAPD

- Cây di truyền cho thấy tất cả các gốc ghép được phân thành 2 nhóm chính, nhóm thứ

nhất là P trifoliata, các

giống lai của nó; nhóm thứ 2 được chia thành các nhóm riêng biệt, đầu tiên gồm các kiểu gene của cam quýt,

Rima Mouei và

El-cs [34]

26

chua (M sanki và M

cleopatra) và cụm thứ

hai là tập hợp phần còn lại của các kiểu gene

Sweet orange) gồm 31 giống đại diện cho 93 mẫu cây

- Sử dụng 10 mồi RAPD và

11 mồi SSR

- Giá trị đa dạng di truyền cao nhất ở nhóm Mandarin (0,513) và thấp nhất ở nhóm bưởi (0,074)

- Cây phân loại phân các loài thành 2 nhóm chính: nhóm đầu tiên gồm ba giống (Meyer, Monachello và Interdonato) thuộc chi Lemon; nhóm thứ 2 bao gồm hai cụm chính, tất cả các giống liên quan đến Mandarin (trừ mẫu ortanique nằm

ở nhóm cùng với các giống thuộc cam ngọt)

Ba giống thuộc Grapefruit (bưởi) nằm cùng một nhóm

Rima Mouei và

- Sử dụng 9 mồi RAPD, 8 cặp mồi SSR

- Mồi RAPD cho kết quả 71 băng trong đó

có 49 băng đa hình, Mồi SSR cho kết quả

37 alen

- Hệ số tương đồng di truyền dao động trong khoảng 0,626 – 0,879

- Cây phân loại cho kết quả 4 loại Cam chua, chanh tây Rangpur, chanh Volkamer và Macrophylla xếp cùng một nhóm; một nhóm

Ebtsam M Hamza [18]

27

gồm quýt và Citrang Troyer; Citrang C35 và quýt Balady nằm nhóm khác

Những nghiên cứu đa dạng di tryền trên cây cam, quýt bằng phương pháp

(Citrus aurantium L.)

- Sử dụng 6 mồi RAPD và

11 mồi ISSR

- Dòng AACNR32 cho một kiểu băng đặc trưng với tất cả các mồi

- Các dòng còn lại có kiểu băng rất giống nhau, trừ các sản phẩm thu được từ mồi ISSR (CA)8RG, (AC)8YG và mồi RAPD (OPH04)

- Mồi (CA)8RG phân biệt được dòng AACNR32 với các dòng khác bởi một băng đơn hình 1800 bp

và không có đoạn khuếch đại 800 bp có ở tất cả các dòng còn lại

Dòng AACNR9A phân biệt với các dòng còn lại bởi không có mặt băng kích thước 500

bp Dòng AACNR26A không phân biệt được với các dòng còn lại khi sử dụng các mồi trên

De Pasquale

và cs [16]

Từ những nghiên cứu trên cho thấy việc đánh giá đa dạng di truyền bằng các phương pháp chỉ thị phân tử đặc biệt là phương pháp RAPD được sử dụng rộng rãi nhằm xác định sự tương đồng di truyền di truyền giữa các loài cung cấp thông tin cần thiết phục vụ cho công tác chọn giống, lai ghép tạo ra những loài có năng suất, chất lượng tốt ở từng điều kiện cụ thể