Đánh giá đa dạng di truyền của một số mẫu bạch đàn trắng có khả năng kháng bệnh đốm lá khác nhau bằng chỉ thị phân tử RAPD

Tuy nhiên, từ cuối những năm 1980, đầu những năm 1990 đến nay đã có nhiều dịch bệnh do một số loại nấm bệnh như nấm Cryptosporiopsis eucalypti, Cylindrocladium quinqueseptatum – một tron

NGUYỄN VĂN QUỲNH

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ MẪU BẠCH ĐÀN TRẮNG CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH ĐỐM LÁ KHÁC NHAU BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ RAPD

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên – 2013

NGUYỄN VĂN QUỲNH

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ MẪU BẠCH ĐÀN TRẮNG CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH ĐỐM LÁ KHÁC NHAU BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ RAPD

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 60 42 0201

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS CHU HOÀNG HÀ

Thái Nguyên – 2013

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn này hoàn toàn được thực hiện bằng sựnghiên cứu của bản thân dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Chu Hoàng Hà,Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật - Viện Công nghệ Sinh học Các hình ảnh,

số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực, đã thu được trong quá trìnhnghiên cứu của mình và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trìnhnghiên cứu nào khác Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trongkhóa luận đều đã được chỉ rõ nguồn gốc

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn thạc sĩ này, ngoài sự nỗ lực phấn đấu của bản thân, tôi còn nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, hướng dẫn tận tình của các cá nhân, tập thể và đơn vị khác

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Chu Hoàng Hà, Phòng

Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học – người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt, giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và hoàn thành khóa luận này.

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới TS Lê Văn Sơn, KS Hồ Mạnh

Tường cùng với tập thể cán bộ phòng Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Công

nghệ sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian làm luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn phòng đào tạo và các thầy cô giáo tại Cơ sở đào tạo sau Đại học khoa học – Đại học Thái Nguyên đã luôn quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi quá trình học tập.

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người luôn bên cạnh động viên, quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

và thực hiện đề tài này.

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2013

Học viên

Nguyễn Văn Quỳnh

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tổng quan về cây bạch đàn 4

1.1.1 Đặc điểm phân loại 4

1.1.2 Đặc điểm hình thái 5

1.1.3 Đặc điểm phân bố 6

1.1.4 Đặc điểm kinh tế 6

1.2 Những nghiên cứu về chọn tạo giống bạch đàn và cây lâm nghiệp 7

1.2.1 Các nghiên cứu trên thế giới 7

1.2.2 Các nghiên cứu ở Việt Nam 10

1.3 Một số đặc điểm và tình hình nghiên cứu bệnh đốm lá ở bạch đàn 13

1.3.1 Triệu trứng và đặc điểm hình thái của nấm bệnh 13

1.3.2 Tình hình nghiên cứu bệnh đốm lá ở bạch đàn 14

1.4 Các loại chỉ thị phân tử trong chọn giống 16

1.4.1 Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) 16

1.4.2 Chỉ thị AFLP (Amplified fragment length polymorphism) 17

1.4.3 Chỉ thị SSR (Single Sequence Repeat hay Microsatelite) 19

1.4.4 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 19

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 23

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 23

2.1.2 Hóa chất và thiết bị 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 26

2.2.1 Tách chiết DNA tổng số của bạch đàn 26

2.2.2 Phương pháp đo nồng độ DNA bằng quang phổ kế 27

2.2.3 Phương pháp PCR với các mồi RAPD 27

2.2.4 Phương pháp điện di trên gel agarose 28

2.2.5 Phương pháp phân tích số liệu RAPD 30

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 31

3.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số 31

3.2 Kết quả đánh giá sự đa hình của các mồi RAPD với 20 giống bạch đàn trắng 33

3.3 Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền giữa mẫu bạch đàn nghiên cứu 38 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

PHỤ LỤC 56

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Ký hiệu các mẫu bạch đàn sử dụng trong nghiên cứu 23Bảng 2.2 Tên và trình tự 10 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu 25Bảng 2.3 Thành phần phản ứng RAPD – PCR 28Bảng 3.1 Kết quả đo độ hấp thụ bước sóng 260 nm, 280 nm và nồng độ DNA tổng số của 20 mẫu Bạch đàn trắng 32Bảng 3.2 Sự đa hình của 10 mồi RAPD nhận được sau khi chạy PCR với DNA tổng số của 20 mẫu bạch đàn trắng 37

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh cây bạch đàn trắng mọc trong tự nhiên 4

Hình 1.2 Bào tử nấm Cryptosporiopsis eucalypti được soi trên kính hiển vi

13

Hình 1.3 Hình ảnh lá bạch đàn bị bệnh đốm lá do nấm Cryptosporiopsis

eucalypti gây ra 14

Hình 3.1 Kết quả điện di tinh sạch DNA tổng số 20 giống bạch đàn trắng 31Hình 3.2 Điện di sản phẩm PCR-RAPD của các giống bạch đàn trắng với mồi OPG13 (M: Marker 1 kb, giếng 1-20: tương ứng giống BD1-BD20) 33Hình 3.3 Điện di sản phẩm PCR-RAPD của các giống bạch đàn trắng với mồi OPB10 (M: Marker 1 kb, giếng 1-20: tương ứng giống BD1-BD20) 34Hình 3.4 Điện di sản phẩm PCR-RAPD của các giống bạch đàn trắng với mồi OPR08 (M: Marker 1 kb, giếng 1-20: tương ứng giống BD1-BD20) 34Hình 3.5 Sản phẩm PCR-RAPD 20 giống bạch đàn trắng với mồi RA31 (M: Marker 1 kb, giếng 1-20: tương ứng giống BD1-BD20) 35Hình 3.6: Điện di sản phẩm PCR-RAPD của các giống bạch đàn trắng với mồi RA50 (M: Marker 1 kb, giếng 1-20: tương ứng giống BD1-BD20) 36Bảng 3.3 Bảng hệ sống tương đồng di truyền giữa 20 giống bạch đàn trắng 39Hình 3.7 Biểu đồ quan hệ di truyền giữa các giống bạch đàn trắng (gồm 4 nhómchính và 4 phân nhóm phụ) 41

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DNA Deoxyribonucleic acid

RAPD Random Amplified Polymorphic DNA

SSR Simple Sequence Repeat

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism PCR Polymerase chain reaction

PIC Polymorphic Information Content

EtBr Ethidium Bromide

cs Cộng sự

kb kilo base

CTAB Cetyltrimethyl amoniumbromide

EDTA Ethylene Diamin Tetra Acetate

dNTP Deoxynucleosid triphosphat

TAE Tris-acetate-EDTA

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Bạch đàn là một trong số các loài cây rừng được trồng chính ở ViệtNam, nó được trồng ở hầu hết các tỉnh thành trên cả nước Trong đó, bạch đàn

trắng Eucalyptus camaldulensis có phân bố tự nhiên rộng nhất trong số các

loài bạch đàn Theo số liệu kiểm kê rừng Việt Nam tính đến tháng 12 năm

2006 cả nước có 2.333.000 ha rừng trồng các loại trong đó diện tích rừngtrồng các loài bạch đàn chiếm 348.001 ha

Bạch đàn được trồng để phủ xanh đồi trọc ở các vùng núi và trung duhoặc để cải tạo đầm lầy, có thể trồng bạch đàn xen kẽ với cây họ Ðậu như keo

lá tràm, keo tai tượng hoặc keo giậu để bù đắp chất đạm cho đất Gỗ bạch đànđược sử dụng để đóng đồ gia dụng, trong công nghiệp được dùng làm nguyên

liệu giấy Ngoài ra, bạch đàn trắng Eualyptus camaldulensis rất giàu cineol (lá

có tinh dầu: 1,3 - 2,25%) Lá bạch đàn trắng hoặc bạch đàn liễu để thay thế lá

bạch đàn xanh (E globulus) là loại đã được sử dụng rất lâu đời ở các nước châu

Âu Dạng dùng: thuốc hãm, thuốc xông, hoặc pha chế thành các dạng bào chếnhư xiro cồn lá bạch đàn, dùng để chữa ho, sát khuẩn đường hô hấp, chữa cácbệnh nhiễm khuẩn đường hô hấp, ho, hen, v.v Tinh dầu bạch đàn được dùngtrong kỹ nghệ hương liệu để sản xuất nước hoa và các loại chất thơm khác có

mùi thơm tự nhiên của hoa, có thể thay thế tinh dầu sả Java (Cymbopogon

winterianus Jowitt) Do vậy, việc trồng bạch đàn trắng không những giúp phủ

xanh đồi trọc đất trống mà còn mang lại hiệu quả kinh tế rất lớn

Tuy nhiên, từ cuối những năm 1980, đầu những năm 1990 đến nay đã

có nhiều dịch bệnh do một số loại nấm bệnh (như nấm Cryptosporiopsis

eucalypti, Cylindrocladium quinqueseptatum – một trong những loài nấm

nguy hiểm nhất đối với bạch đàn ở Việt Nam) gây ra đối với cây bạch đàn ởcác tỉnh thuộc vùng Đông nam bộ (Đồng Nai, Bình Dương, Bình Phước), các

tỉnh miền trung (Quảng Nam, Đà Nẵng và Thừa Thiên Huế) hay các tỉnhmiền bắc (Phú Thọ, Tuyên Quang) do vậy diện tích rừng trồng bạch đàn đã bịsuy giảm Đã có một số công trình nghiên cứu khảo nghiệm để chọn ra cácgiống/dòng bạch đàn kháng bệnh và đến nay đã đạt được một số kết quả nhấtđịnh như đã xác định được các dòng bạch đàn SM16, SM23, SM7, EF24,EF39, EF55 vừa có sinh trưởng nhanh vừa có tính kháng bệnh và đã đượccông nhận giốn tiến bộ kĩ thuật hoặc giống quốc gia Tuy nhiên, việc khảonghiệm ngoài hiện trường có thời gian dài (từ 5-10 năm) do vậy sẽ tốn kém vềthời gian và kinh phí Ngược lại, chọn giống kháng bệnh bằng chỉ thị phân tử

sẽ tiết kiệm được thời gian và kinh phí rất nhiều

Trong lĩnh vực lâm nghiệp việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiêncứu còn rất hạn chế, cho đến nay chưa có một công trình nghiên cứu nào sửdụng phương pháp chỉ thị phân tử để chọn giống bạch đàn hay bất kỳ một loàicây rừng nào kháng bệnh ở Việt Nam Trên thế giới đã có rất nhiều công trìnhứng dụng chỉ thị phân tử như RAPD, AFLP, SSR để chọn giống cây trồngkháng bệnh ở cả cây nông nghiệp và lâm nghiệp Trong đó kỹ thuật RAPD làmột công cụ hữu hiệu bước đầu để chọn các giống cây trồng mang những tínhtrạng mong muốn, Vì vậy chỉ thị phân tử RAPD thích hợp cho chọn tạo giốngbạch đàn trắng kháng bệnh đốm lá

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Đánh giá đa dạng di truyền của một số mẫu bạch đàn trắng có khả năng kháng bệnh đốm lá khác nhau bằng chỉ thị phân tử RAPD”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

+ Xác định đa dạng và mối quan hệ di truyền của các giống bạch đàn

nghiên cứu

3 Nội dung nghiên cứu

+ Tách chiết DNA tổng số của 20 mẫu bạch đàn khác nhau.

+ Sử dụng kỹ thuật RAPD phân tích các mẫu DNA tổng số thu được

với 10 mồi RAPD

+ Xây dựng biểu đồ biểu diễn mối tương quan di truyền của các xuất

Ý nghĩa thực tiễn

Rút ngắn thời gian đánh giá dòng, giảm bớt khối lượng công việc lai tạotrên vườn ươm, kết hợp các phương pháp đánh giá vườn ươm sẽ nhanh chóngxác định, chọn lọc tổ hợp lai cho năng suất cao

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về cây bạch đàn

1.1.1 Đặc điểm phân loại

Ngày nay bạch đàn là một trong những loài cây gỗ lâm nghiệp rất quantrọng, được trồng phổ biến ở nhiều quốc gia trên thế giới đặc biệt là ở cácvùng nhiệt đới và ôn đới, giữa các vĩ độ 450N và 400B như: Braxin, TrungQuốc, Ấn Độ, … với diện tích canh tác khoảng 12 triệu hecta.[24]

Hình 1.1 Hình ảnh cây bạch đàn trắng mọc trong tự nhiên

Cây bạch đàn không phải là loại cây mọc tự nhiên ở Việt Nam Loàinày xuất xứ từ nước Úc được dẫn giống bằng hạt đem về trồng ở đất nước tavào khoảng thập niên 1950 và cho thấy một số loài rất thích hợp với thổnhưỡng và khí hậu của Việt Nam, nhất là có thể trồng tập trung thành rừngthuần hay trồng phân tán trong đất thổ cư của nhân dân từ vùng đồng bằngcho đến các vùng bình nguyên và cao nguyên

Ở miền Nam, cây Bạch đàn mới du nhập được gọi là cây Khuynh diệp

vì có lá cong cong hình lưỡi liềm Sau đó ngành lâm nghiệp chế độ cũ đặt tên

là cây Bạc hà vì lá có mùi dầu Bạc hà

Năm 1975, cây Khuynh diệp hay còn gọi là cây Bạc hà được Bộ Lâm

Nghiệp đặt tên là cây Bạch đàn, có tên khoa học là Eucalyptus spp thuộc họ

thực vật Sim (Myrtaceae) Tại Úc, bạch đàn chi eucalyptus (tức chi Bạch đàn)

gồm ít nhất hơn 70 loài (species) mọc từ các vùng đồng bằng có độ cao ngangmực nước biển cho đến các vùng bình nguyên cao nguyên, từ các thung lũngđến đèo núi cao

Ở Việt Nam bạch đàn đã được trồng từ những năm 1930 ở cả hai miềnNam, Bắc Hiện nay có 10 loài bạch đàn đang được trồng phổ biến là:

+ Bạch đàn urô Eucalyptus urophylla, thích hợp với vùng đất đồi trung du + Bạch đàn trắng Eucalyptus camaldulensis, thích hợp với vùng đồng bằng + Bạch đàn trắng Eucalyptus alba, thích hợp với vùng gần biển.

+ Bạch đàn lá nhỏ Eucalyptus tereticornis, thích hợp với vùng đồi Thừa

+ Bạch đàn ướt Eucalyptus saligna, thích hợp với vùng cao nguyên Đà Lạt + Bạch đàn Mai đen Eucalyptus maidenii, thích hợp với vùng cao Lâm

Đồng

1.1.2 Đặc điểm hình thái

Cây bạch đàn thuộc loại đại mộc, cao 25 – 50m, có cây cao tới 100m.Đường kính thường đạt 120-180 cm Vỏ ngoài màu xám trắng hoặc nâu, đỏnâu, xám xanh…, bong mảng hoặc nứt dọc, vỏ thân chứa tinh dầu

Eucalyptone thơm mùi dầu tràm Lá đơn, khi cây còn non lá thường mọc đối,

sau đó có dạng lá đơn mọc cách, không có lá kèm; mép lá nguyên, phiến ládày, gân phụ thường nối với nhau ở đầu gân thành một đường song song vớimép lá Hoa lưỡng tính, nụ hình thoi Khi hoa nở nửa trên hình chóp nón rụng

đi, để lộ nhị và nhụy Nhị nhỏ, rời nhau, rất nhiều, màu trắng vàng Nhuỵ có

bầu trung, một phần gắn liền với ống đài, một phần nhô lên Quả khô, khichín nứt ở đỉnh Hạt nhiều, thường có góc cạnh, rất nhỏ.

Cây bạch đàn là loài dễ trồng, ít kén đất tăng trưởng nhanh nhưng hấpthụ nhiều nước và dưỡng chất trong đất Loài bạch đàn nói chung rất mau lớn,tán lá hẹp thưa, trồng trong vòng 5, 6 năm thì có chiều cao trên 7m và đườngkính thân cây khoảng 9-10 cm

1.1.3 Đặc điểm phân bố

Chi Bạch đàn Eucalyptus thuộc họ Sim Myrtaceae có hơn 700 loài,

hiện đã được trồng ở hơn 30 nước trên thế giới từ vĩ độ 580 Bắc đến 460 Nam

Bạch đàn trắng (Eucalyptus camaldulensis Dehnh) có phân bố tự nhiên rộng

nhất trong số các loài bạch đàn, và có mặt ở hầu hết khắp đất nước Úc, trừphần phía Tây Nam của Úc Loài này được xem là cây bản địa của Úc [49]phân bố từ vĩ độ 12.5- 380 Nam và ở độ cao 20- 700 mét so với mực nướcbiển Loài này có mặt trong nhiều điều kiện khí hậu khác nhau: từ ấm tớinóng, từ nửa ấm tới nửa khô hạn Nhiệt độ trung bình tháng nóng nhất trongphạm vi 27-400C và nhiệt độ trung bình tháng lạnh nhất nằm trong phạm vi 3-

150C Lượng mưa bình quân vào khoảng 250-600 mm, nhưng cũng có nơilượng mưa cao tới 1250 mm và thấp đến 150 mm [17] Đấy là loài bạch đànđiển hình mọc ven sông suối song vẫn gặp chúng trên vùng khô

1.1.4 Đặc điểm kinh tế

Bạch đàn trắng có khả năng cung cấp gỗ với năng suất cao trên cácdạng lập địa nghèo và khô, có khả năng chịu hạn và nắng nóng, sinh trưởngmạnh khi đủ nước, chịu được ngập úng theo mùa và chịu mặn, khả năng tạochồi mạnh và gỗ có nhiều công dụng Bạch đàn có công dụng làm cột điện,cột chống lò, ở Úc người ta sử dụng gỗ của loài này làm đồ gia dụng như gỗván sàn, ốp tường, lát cầu thang, đóng tủ ngoài ra gỗ được dùng làm củi vàthan củi Là loài cây có tốc độ phát triển và sinh trưởng nhanh, kích thướclớn, thông thường chiều cao từ 20-30 m, đường kính từ 20-30 cm, nhiều nơi

chiều cao của cây bạch đàn E.camaldulensis có thể tới 40-50 m, cá biệt như ở

Tasmania, nước Úc, có cây có chiều cao tới trên 100 m, đường kính trên 3 m[62] do vậy loài Bạch đàn trắng được gây trồng với qui mô lớn và nhỏ từ khắpcác châu lục, từ Bắc Mỹ đến vùng Đông Á, từ vùng Địa Trung Hải của Nam

Mỹ và Châu Phi…

1.2 Những nghiên cứu về chọn tạo giống bạch đàn và cây lâm nghiệp

1.2.1 Các nghiên cứu trên thế giới

Chọn giống bạch đàn kháng bệnh: trên thế giới các nhà khoa học đãtiến hành khảo nghiệm loài/dòng/gia đình/xuất xứ bạch đàn để chọn giốngkháng bệnh Tại Úc các nhà khoa học đã khảo nghiệm các loài bạch đàn tại

bang Queensland và đã tìm ra loài Eucalyptus pellita có khả năng kháng bệnh cháy lá bạch đàn do nấm Cylindrocladium reteaudii gây ra [18] Tại Ấn Độ,

các nhà khoa học của Viện nghiên cứu Lâm nghiệp Kerala đã tiến hành khảo

nghiệm các loài bạch đàn ở Kerala và đã tìm ra loài E brassiana cũng có khả năng kháng bệnh cháy lá do nấm Cylindrocladium reteaudii gây ra [54] Tại Braxin, bệnh loét thân bạch đàn loài nấm Cryphonectria gây bệnh nghiêm

trọng cho nhiều loài bạch đàn trồng ở nước này, do đó các nhà khoa đã tiếnhành khảo nghiệm các dòng bạch đàn để tìm ra dòng có khả năng kháng bệnh

này, kết quả cho thấy dòng bạch đàn lai giữa E.grandis x E.urophylla có khả

năng kháng rất cao Các nhà chọn giống cũng tiến hành khảo nghiệm cácdòng lại giữa các loài bạch đàn để tìm ra dòng kháng bệnh loét thân do nấm

Coniothyrium zuluense gây ra, kết quả chỉ ra các dòng lai giữa E.grandis x E.camaldulensis và E.grandis x E.urophylla có khả năng kháng bệnh rất cao.

Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng kháng bệnh trênthế giới: đã có rất nhiều công trình nghiên cứu chọn giống kháng bệnh bằngchỉ thị phân tử trên thế giới trên cả cây nông nghiệp và lâm nghiệp

+ Các nghiên cứu tại Mỹ:

Từ năm 1991 nhóm nghiên cứu của Rick Kesseli đã phát triển phươngpháp phân tích sự phân ly tính trạng theo nhóm BSA (Bulked SegregantAnalysis, phân tích phân ly dạng mẫu lớn) để xác định nhanh các chỉ thị phân

tử có liên kết với các gen hay các vùng đặc hiệu trên bộ gen Phương phápnày dựa trên việc so sánh sự đa hình của các mẫu DNA của các cá thể đãđược phân nhóm từ một quần thể phân ly bằng việc sử dụng các kĩ thuậtRAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) và RFLP (RestrictionFragment Length Polymorphism) Sau khi phân tích kết quả các nhà khoahọc đã xây dựng thành công bản đồ liên kết và xác định được ba chỉ thị phân

tử có liên quan đến tính kháng bệnh mốc sương (downy mildew) ở cây rau

diếp (Lactuca sativa L.) [34] Từ các nghiên cứu trước, các nhà khoa học tại

trường Washington State (Hoa Kỳ) đã chứng minh được tính kháng với các

triệu chứng đốm và rỉ sắt ở lá cây Bạch dương (Populus trichocarpa Torr.)

được quy định bởi một gen trội Bằng kết hợp các kĩ thuật RAPD và RFLPvới kĩ thuật STS (Sequence-Taggeds-Site), Newcombe và cs (1996) [44] cũng

đã tìm được gen Mmd1 kháng bệnh đốm lá ở cây Bạch dương (Populus

trichocarpa Torr.) gây ra bởi Melampsora medusae f sp Deltoidae Từ các

nghiên cứu này một bản đồ liên kết đã được thiết lập bao gồm số lượng tươngđối lớn các chỉ thị RAPD và RFLP, và STS 343 cho thế hệ cây lai F2 Bêncạnh những ứng dụng rất hữu hiệu trong việc xác định các chỉ thị phân tử liênquan đến tính chịu bệnh ở cây, kĩ thuật RAPD và RFLP còn được ứng dụngmạnh trong các nghiên cứu xây dựng bản đồ di truyền liên kết, ví dụ trên câybạch đàn [34] Nhằm tìm hiểu rõ hơn bản chất phân tử của tính kháng bệnhHarkins và cs (1998) cố gắng lập bản đồ liên kết di truyền và phân lập các gen

liên quan đến tính kháng bệnh phồng rộp (blister rust – Cronartium ribicola Fisch) ở cây thông đường (Pinus lambertiana) Đây là những nguyên liệu rất

tốt cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm xây dựng bản đồ di truyền có độ phângiải cao tiến tới việc phân lập gen kháng bệnh Tương tự với những thínghiệm của Harkins và cs (1998)[35], một nhóm nghiên cứu tại trường Đại

học Iowa State cũng phân lập được gen Lrd1 quy định tính trạng chống chịu bệnh đốm lá gây ra bởi Melampsora medusae f sp deltoidae ở một loài bạch dương khác là Populus deltoid.

+ Các nghiên cứu tại Bỉ:

Ở châu Âu, những chương trình nhân giống cây Bạch dương trước đâycũng đã thành công trong việc tạo ra những dòng cây kháng hoàn toàn với

Melampsora larici-populina - loài nấm gây bệnh gỉ sắt, đốm lá Tuy nhiên do

sự tiến hoá rất nhanh của Melampsora larici-populina nên nhiều loài nấm đã

có thể gây bệnh trở lại ở cây Bạch dương Chính vì vậy việc tìm ra và phânlập các đoạn gen quy định tính kháng trở nên cần thiết để tạo ra các dòng cây

kháng nấm Melampsora larici-populina Các nhà khoa học tại Bỉ đã phát hiện

ra rằng các nhóm gen kháng bệnh có thể phân thành 5 lớp chính, dựa trên cấutrúc bậc 1 của protein tương ứng Hầu hết các protein này được phân vàonhóm gắn nucleotide/giàu leucine (NBS/LRR) và chúng tham gia vào mộtchu trình truyền tín hiệu dẫn tới tính kháng ở cây Kỹ thuật chủ yếu được sửdụng cho công việc này là kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment LengthPolymorphism) Trong các thí nghiệm này, trên 556 tổ hợp mồi AFLP đãđược dùng với hy vọng phát hiện được khoảng 5000 chỉ thị chứa locus kháng

Melampsora Dựa trên bản đồ di truyền xây dựng được các tác giả này thông

báo rằng đã phân lập được 11 chỉ thị AFLP từ quần thể bao gồm 512 cá thểlai Khi phân lập và đọc trình tự các chỉ thị này cho thấy chúng có độ tươngđồng rất cao với các gen mã hoá cho các protein thuộc nhóm NBS/LRR

+ Các nghiên cứu tại Brazil:

Tại Brazil, Junghans và cs (2003) [37] đã nghiên cứu sử dụng chỉ thị

phân tử để nhận biết loài bạch đàn Eucalyptus grandis kháng bệnh rỉ sắt (Puccinia psidii Winter) Bệnh rỉ sắt là một trong những bệnh bạch đàn nguy

hiểm nhất ở Brazil và cũng được xem như là loại bệnh nguy hiểm tiềm năngtrên toàn thế giới Trong công trình nghiên cứu này, nhóm tác giả đã sử dụngmột tổ hợp gồm 10 gia đình cây bạch đàn được lai chéo nhau giữa cây bạchđàn kháng bệnh và cây bạch đàn mẫn cảm với bệnh rỉ sắt để nghiên cứu Cáccây bạch đàn lai ở thế hệ F1 được nhiễm bệnh rỉ sắt nhân tạo để xác định tỷ lệ

phân ly theo tính trạng kiểu hình trong gia đình, kết quả quan sát khẳng định cógen điều khiển sự kháng bệnh rỉ sắt và nhóm tác giả đã tìm ra được một gia đình(G38xG21) có tính trạng phân ly theo kiểu hình tuân theo quy luật của Melden(tỷ lệ 1:1) Để xác định các chỉ thị phân tử liên quan đến đoạn gen (locus) kháng

bệnh, nhóm tác giả đã sử dụng 1000 cây con bạch đàn E grandis của gia đình

phân ly chuẩn (G38xG21) và 980 mồi để phân tích nghiên cứu Phương phápphân tích đa hình RAPD và phân tích bằng phương pháp BSA được sử dụng.Một bản đồ liên kết (giữa các chỉ thị RAPD và gen kháng bệnh rỉ sắt) được xây

dựng xung quanh đoạn gen Ppr1 (gen kháng bệnh Puccina psidii), nhóm này

bao gồm 6 chỉ thị RAPD với 1 cửa sổ gen dài 5 cM Chỉ thị RAPD AT9/917

cùng phân ly với gen Ppr1 mà không có sự tái tổ hợp nào trong tổng số 994

phân bào Từ đây các tác giả đã xây dựng lên chỉ thị STS dùng để nhận biết gen

kháng bệnh rỉ sắt đối với bạch đàn Eucalyptus grandis.

1.2.2 Các nghiên cứu ở Việt Nam

Công việc chọn giống bạch đàn theo tiêu chí kháng bệnh ở Việt Namđược bắt đầu từ những năm 1990, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt nam kếthợp với CSIRO của Úc thực hiện dự án “Minimising Disease Impacts onEucalypts in South East Aisa’’ giai đoạn 1996 - 2000 Kết quả của dự án đãxác định được các loài sinh vật gây hại chính đối với bạch đàn ở Việt Nam vàcác nước thành viên tham gia dự án ( Úc, Thái Lan và Việt Nam), kết quả này

cũng chỉ ra rằng nấm bệnh Cryptosporiopsis eucalypti cùng với nấm bệnh

Cylindrocladium quinquesetptatum là những nấm bệnh nguy hiểm nhất đối

với bạch đàn ở Việt Nam và đã xây dựng được phương pháp nhiễm bệnh nhân

tạo cho cây con bạch đàn ở trong nhà kính với hai loài nấm bệnh là C.

eucalypti và C quinquesetptatum để đánh giá các dòng mẫn cảm và kháng

bệnh bằng kiểu hình, trong lĩnh vực cải thiện giống, đã thiết lập được khukhảo nghiệm bạch đàn ở Chơn Thành (Bình Phước - năm 1996) với diện tích3.5 ha của 150 gia đình cây bạch đàn và khu khảo nghiệm 50 dòng bạch đàn

vô tính tại Sông Mây (Đồng Nai – năm 1998) nhằm đánh giá sinh trưởng vàkhả năng kháng bệnh của chúng Kết quả này cho thấy các xuất xứ bạch đàncủa Kennedy Creek, Laura River và Kennedy River là những xuất xứ có sinhtrưởng và tính kháng bệnh tốt nhất [6].

Viện Khoa học Lâm ngiệp Việt Nam thực hiện các đề tài nghiên cứutiếp theo về chọn giống kháng bệnh các loài bạch đàn và keo, bao gồm các đềtài “Nghiên cứu chọn giống kháng bệnh có năng suất cao cho một số loàibạch đàn và keo” giai đoạn 2001-2005 và đề tài “Nghiên cứu chọn các dòngkeo và bạch đàn chống chịu bệnh có năng suất cao cho trồng rừng kinh tế”giai đoạn 2006-2010 Kết quả đã xây dựng được 17 khu khảo nghiệm bạchđàn các loại tại nhiều vùng trên cả nước (Đồng Nai, Bình Dương, BìnhPhước, Huế, Vĩnh Phúc), từ đây đã chọn ra được các loài Bạch đàn trắngSM16, SM23, SM7, EF24, EF39, EF55 (Nguyễn Hoàng Nghĩa và cs tuyểnchọn và khảo nghiệm) có tốc độ sinh trưởng nhanh, có tính chống chịu bệnh,các dòng này đã được công nhận giống tiến bộ kỹ thuật, kết quả đã xác địnhđược các loại sinh vật gây bệnh cho bạch đàn trên các vùng sinh thái khảonghiệm và đã xác định được các nấm bệnh nguy hiểm đối với bạch đàn ở cảgiai đoạn vườn ươm và rừng trồng trên các vùng trồng, trong đó đáng chú ý

nhất là các loại nấm bệnh Cryptosporiopsis eucalypti, Cylindrocladium

quinquesetptatum và Phaeopheospora destructans.

* Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống kháng bệnh ở Việt Nam:

Trong lĩnh vực lâm nghiệp việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiêncứu còn rất hạn chế Cho đến nay chưa có một công trình nghiên cứu nào sửdụng phương pháp chỉ thị phân tử để chọn giống bạch đàn hay bất kỳ một loàicây rừng nào kháng bệnh ở Việt Nam Hiện nay mới chỉ có một số ứng dụng

về chỉ thị phân tử/phương pháp phân tử trong lĩnh vực lâm nghiệp ở ViệtNam Một số các công trình nghiên cứu về cây lâm nghiệp đã sử dụng chỉ thịphân tử (RAPD và DNA lục lạp) để nghiên cứu sự đa dạng di truyền của các

cây trội để lựa chọn các cặp bố mẹ nhằm xây dựng vườn giống Keo tai tượng

Acacia mangium [7] Kết quả nghiên cứu cho thấy các dòng Keo tai tượng có

mức độ đa dạng di truyền rất thấp Một nghiên cứu khác của Nguyễn HoàngNghĩa và cs (2006) sử dụng chỉ thị phân tử để phân tích đa dạng di truyền củacác loài Sao lá hình tim thuộc họ Dầu để đề xuất các biện pháp bảo tồn thíchhợp Kết quả nghiên cứu cho thấy không có sự đa hình các gen lục lạp đãnghiên cứu do các quần thể nghiên cứu rất gần nhau về địa lý Ngoài raNguyễn Hoàng Nghĩa và cs (2005) [5], đã sử dụng chỉ thị RAPD và DNA lụclạp để đánh giá đa dạng di truyền của ba xuất xứ Lim xanh Kết quả nghiêncứu ở đây chỉ ra sự khác biệt rất rõ rệt đối với 3 xuất xứ Lim xanh, các xuất

xứ từ Cầu Hai, Nghệ An và Quảng Ninh Trong các nghiên cứu khác tronglĩnh vực lâm nghiệp, có các nghiên cứu về sử dụng chỉ thị phân tử trong đánhgiá mức độ thụ phấn chéo của các quần thể chọn giống của Keo tai tượng,Thông nhựa, Bạch đàn urô [10], đánh giá chất lượng hạt giống tại các vườngiống, xác lập mối tương quan với sinh trưởng của cây con của Keo tai tượng

Trong lĩnh vực nông nghiệp, đã có rất nhiều các công trình nghiên cứu

sử dụng chỉ thị phân tử để chọn giống cây trồng, đặc biệt là với đối tượng câylúa Năm 2005 nhóm nghiên cứu của Nguyễn Vĩnh Phúc và Nguyễn Thị Lang[8] đã ứng dụng thành công hai kĩ thuật chỉ thị phân tử SSR và STS trong việc

chọn tạo các giống lúa kháng bệnh đạo ôn gây ra bởi nấm Pyricularia grysea.

Phương pháp này cho thấy khả năng dự đoán kiểu gene kháng bệnh và kiểuhình kháng bệnh rất cao, do đó có thể áp dụng để chọn lọc những giống khángbệnh đạo ôn bằng các kĩ thuật SSR và STS

1.3 Một số đặc điểm và tình hình nghiên cứu bệnh đốm lá ở bạch đàn

1.3.1 Triệu trứng và đặc điểm hình thái của nấm bệnh

quan trọng có tính chất đặc trưng của chi nấm Cryptosporiopsis Bào tử vô

tính có kích thước chiều dài từ 11 đến 26 µm, chiều rộng từ 4,5 đến 10 µm

Nấm Cryptosporiopsis eucalypti gây ra các triệu chứng khác nhau như:

Đốm lá, khô cành nhỏ và ngọn cây Loài nấm này thường gây hại cho các loài

Bạch đàn ở các nước Đông Nam á, đặc biệt là Bạch đàn trắng Eucalyptus

camaldulensis và Bạch đàn uro E urophylla Những đốm bệnh rải rác trên lá

và có hình dạng bất định, thường là màu nâu tối Trong một số trường hợp,

đặc biệt ở những lá già, vùng bị bệnh lớn có màu hơi đỏ, các mô bị nứt làmcho mặt lá gồ ghề Đỉnh ngọn bị nhiễm bệnh và biến dạng và chết sau đó sẽhình thành nhiều đỉnh sinh trưởng từ đó mọc các lá có kích thước nhỏ hơn lábình thường rất nhiều vào cuối mùa mưa Những đỉnh sinh trưởng này cũng

sẽ bị bệnh và làm tán lá bẹt lại, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng về chiều caocủa cây Khi bị bệnh nặng, rừng bạch đàn bị rụng lá, chỉ còn một số ít tậptrung trên phía ngọn, số lá còn lại bị sần sùi và biến dạng

Hình 1.3 Hình ảnh lá bạch đàn bị bệnh đốm lá do nấm Cryptosporiopsis

eucalypti gây ra 1.3.2 Tình hình nghiên cứu bệnh đốm lá ở bạch đàn

1.3.2.1 Các nghiên cứu trên thế giới

Quy mô trồng rừng bạch đàn trên thế giới ngày càng tăng, song songvới việc phát triển về diện tích, các rừng trồng bạch đàn trên thế giới ngàycàng đối mặt với dịch bệnh hại gây ra bởi nấm bệnh, côn trùng, vi khuẩn,virus, phyto-plasma và tuyến trùng [50] Bệnh hại lá bạch đàn gây ra bởinhiều loại nấm bệnh, chúng là một vấn đề rất lớn đối với các rừng trồng bạchđàn, và đã có rất nhiều ví dụ về các dịch bệnh gây chết hàng loạt rừng trồngbạch đàn ở Úc, New Zealand, Nam Phi, Braxin và Ấn Độ [46] Ví dụ ở Úc,

bệnh đốm lá bạch đàn gây ra bởi nấm bệnh Aulographina eucalypti đã gây ra đại dịch bệnh ở rừng trồng bạch đàn Eucalyptus nitens ở Errinundra Plateau,

bang Victoria năm 1974 đã dẫn đến sự dụng lá hoàn toàn ở rừng trồng và gây

chết trên một diện tích rất lớn [43] Sau đó dịch bệnh này cũng được ghi nhận

ở các rừng trồng bạch đàn ở Taggerty, Toolangi và Noojee bang Victoria[55] Dịch bệnh bạch đàn thường gây ra ở các rừng trồng bạch đàn đơn dòng

hơn là các rừng trồng bạch đàn hỗn giao Nấm Mycosphaerella nubilosa cũng

đã từng gây ra 90% số lá rụng của một số xuất xứ bạch đàn E globulus và các rừng trồng bạch đàn kinh tế E globulus và E nitens ở bang Tasmania [62] Ở

New Zealand, một loài nấm thuộc chi Mycospharella đã xuất hiện [46] và gây

dịch bệnh ở rừng trồng bạch đàn kinh tế E delegatensis trên diện tích 1000

ha Ở Nam Phi loài nấm Mycosphaerella juvenis cũng gây dịch bệnh trên rừng trồng E globulus và một số xuất xứ của E nitens [26] Ngoài ra nấm

Cylindrocladium gây ra dịch bệch cháy lá, tàn rụi đối với các rừng trồng bạch

đàn non ở Braxin [27] ở Ấn Độ [54], ở Nam Phi [31] và ở Việt Nam [8] Loài nấm gây bệnh rỉ sắt Puccinia psidii cũng gây dịch bệnh ở các rừng trồng bạch

đàn ở Braxin [27]

Nấm Cryptosporiopsis eucalypti Sankaran & B.sutton gây ra bệnh đốm

lá, khô ngọn và loét thân trên một số loài bạch đàn ở rất nhiều nước, chủ yếu

các vùng nhiệt đới ẩm [54] Loài nấm này gây ra bệnh đốm lá bạch đàn ởIndonesia, Braxin [27] Thái Lan, Việt Nam, Lào, Nhật Bản, Trung Quốc, SriLanka, Hawaii [54] và New Zealand [44] Ngoài ra còn gây bệnh đốm lá ởbạch đàn ở Úc, Ấn Độ và Mỹ [54] Loài nấm này có thể tồn tại trong thân câybạch đàn dưới dạng loét thân trong những tháng khô hạn, song ở độ ẩm cao(trong và sau mùa mưa) và nhiệt độ thích hợp (20-250C) nó sẽ bùng phát trởlại, gây bệnh cho lá (đốm lá) và ngọn bạch đàn [8]

1.3.2.2 Các nghiên cứu ở Việt Nam

Từ cuối những năm 1980, đầu những năm 1990 đến nay dịch bệnh (docác loài nấm Cryptosporiopsis eucalypti, Cylindrocladium

quinqueseptatum gây ra) thường xuyên xảy ra đối với các rừng trồng bạch

đàn ở Việt Nam, đặc biệt là ở các vùng Đông Nam Bộ (các tỉnh Đồng Nai,

Bình Dương, Bình Phước) và miền Trung (các tỉnh Quảng Nam, Đà Nẵng vàThừa Thiên Huế) Theo kết quả điều tra đánh giá của các tác giả NguyễnHoàng Nghĩa (2000, 2003) diện tích rừng trồng bạch đàn ở Việt Nam bị bệnhlên tới 50% tổng diện tích với các mức độ khác nhau Các tác giả đều cảnhbáo nguy cơ gây hại lớn của các loại dịch bệnh này đối với rừng trồng tập

trung, đặc biệt là rừng trồng Bạch đàn trắng Eucalyptus camaldulensis có xuất

xứ Petford

Nấm Cryptosporiopsis eucalyti gây bệnh đốm lá ở Việt Nam: cùng với nấm bệnh Cylindrocladium quinquesetptatum, nấm Cryptosporiopsis

eucalypti được đánh giá là một trong những loài nấm bệnh gây hại nguy hiểm

nhất đối với rừng trồng bạch đàn ở Việt Nam Khi gây bệnh trên cây bạchđàn, nó gây ra triệu chứng điển hình trên lá cây là đốm lá, đôi khi các lá bịbệnh hình thành các u nhỏ, trên bề mặt lá sần sùi, làm cho lá bị rụng, khi tấncông lên cành hoặc ngọn bạch đàn nó làm cho cành ngọn bị khô héo, sau đómọc lên các chồi và lá non với kích thước rất nhỏ vào cuối mùa mưa, đôi khicòn làm cho ngọn và cành ngọn bị chết

1.4 Các loại chỉ thị phân tử trong chọn giống

1.4.1 Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)

Kĩ thuật RFLP là kĩ thuật nghiên cứu tính đa hình chiều dài của cácphân đoạn DNA dựa trên điểm cắt các enzim giới hạn (Restriction enzym,RE) Khi ủ DNAvới enzyme giới hạn ở dung dịch đệm thích hợp ở PH, nhiệt

độ thích hợp sẽ sẽ tạo ra những phân đoạn DNA với kích thước khác nhau, từ

đó lập nên các bản đồ gen Kỹ thuật này được sử dụng phổ biến từ thập niên

Ưu điểm và nhược điểm của kỹ thuật RFLP

- RFLP có ưu điểm là marker đồng trội cho phép phân biệt được cá thểđồng hợp và dị hợp Do kích thước DNA khảo sát trong RFLP lớn vì vậy sốlượng dấu phân tử (marker) tạo ra nhiều đủ đáp ứng nhu cầu nghiên cứu

- Tuy nhiên do qui trình thực hiện phức tạp, nguy hiểm đối với sứckhoẻ người nghiên cứu (sử dụng phóng xạ đánh dấu), và DNA yêu cầu cóchất lượng cao đã làm hạn chế việc sử dụng kỹ thuật này Hơn nữa hiện nay,

ở nước ta nhà nước chưa cho phép nhập các chất phóng xạ

- Cùng với sự phát triển kỹ thuật PCR, kỹ thuật RFLP trở nên đơn giảnhơn Một cặp mồi oligonucleotide có thể dùng khuếch đại một vùng DNA cầnkhảo sát, sau đó đoạn DNA được khuếch đại được cắt bằng các RE, điện di vàphân tích trên gel nhuộm ethidium bromide hoặc bạc PCR-RFLP bỏ quabước lai nên giá thành rẻ hơn và ít nguy hiểm hơn phương pháp RFLP

1.4.2 Chỉ thị AFLP (Amplified fragment length polymorphism)

Kĩ thuật AFLP được phát triển bởi công ty KeyGene trong đầu nhữngnăm 1990 và đã trở thành một trong những công nghệ in dấu vân tay di truyền(fingerprinting) phổ biến nhất trên thế giới

Kĩ thuật AFLP dựa trên nguyên lý kết hợp giữa kĩ thuật RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism) và PCR để khuếch đại nhữngđoạn DNA có chiều dài giới hạn sau khi được cắt hạn chế bởi enzyme cắt hạn chế

Kĩ thuật AFLP được cấp bằng sáng chế vào năm 1991 và tại thời điểmnày được ban hành ở nhiều quốc gia như Canada, Châu Âu, Nhật Bản, Úc và

Mỹ Hiện nay đã được ứng dụng rộng rãi trên thế giới

Nguyên lý:

DNA được phân giải bởi hai enzyme cắt hạn chế khác nhau

Phần nối (adapter) oligonucleotide được nối với những đầu tận cùngcủa các phân đoạn DNA

Tập con đặc trưng của các sản phẩm phân giải DNA được khuếch đại

- Không cần biết trước trình tự DNA của gen cần nghiên cứu, khôngcần sử dụng nhiều loại primer

- Là kỹ thuật in dấu DNA còn khá mới lạ nhưng rất hiệu quả, có thể indấu DNA của bất kỳ nguồn gốc phức tạp nào từ sinh vật sơ hạch, thực vật,động vật đến con người

- Lệ thuộc nhiều vào thao tác ở những bước đầu để có được phổ diệncác phân đoạn DNA lý tưởng.

1.4.3 Chỉ thị SSR (Single Sequence Repeat hay Microsatelite)

Khi nghiên cứu hệ gen của một số sinh vật người ta đã phát hiện ranhững đoạn DNA có chiều dài khác nhau phân bố một cách ngẫu nhiên màtrình tự của nó bao gồm các nhóm nucleotide giống nhau lặp lại nhiều lần; cácnhóm này thường có số lượng không vượt quá 5 nucleotide ví dụ như (TG)n

hoặc (AAT)n Ở lúa các nhóm nucleotide đã phát hiện được gồm GA, GT,CAT, CTT Những đoạn DNA lặp lại như vậy được gọi là Microsatelite haycòn có các tên khác như: SSLPs (single sequence length polymorphisms),SSRs (simple sequence repeats), STRs (short tDNAom repeats) Các đoạnDNA lặp lại này có trình tự hai đầu rất đặc trưng cho mỗi đoạn; bởi vậy màtrình tự đặc trưng ở hai đầu của đoạn lặp lại này đã được sử dụng để thiết kếmồi cho PCR Do có sự khác nhau về chiều dài giữa các đoạn lặp lại, bởi vậy

mà kỹ thuât nhận dạng DNA Microsatelite rất phù hợp trong nghiên cứu đahình, lập bản đồ và phân lập gen

Cũng giống như kỹ thuật RAPD, kỹ thuật SSR đơn giản, thuận tiện,không tốn kém; mặt khác Microsatelites là chỉ thị đồng trội nên nó được sửdụng để phát hiện cá thể dị hợp tử và lập bản đồ gen sử dụng quần thể F2

1.4.4 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

RAPD là viết tắt của cụm từ tiếng Anh: Randomly AmplifiedPolymorphic DNA (Đa hình DNA dược nhân bản ngẫu nhiên) RAPD là kỹthuật được xây dựng dựa trên nguyên lý PCR, với những mồi được thiết kếngẫu nhiên có chiều dài khoảng 10 nucleotide Trong phản ứng, các mồiRAPD gắn ngẫu nhiên vào DNA khuôn ở bất kỳ vị trí nào mà có trình tự bổsung với nó Sản phẩm PCR được điện di trong gel agarose và phát hiện bằngcách nhuộm với dung dịch ethidium bromide, kích thước sản phẩm có chiềudài từ 200bp đến 2000bp Về cơ bản, chỉ thỉ RAPD là một chỉ thị trội, nghĩa

là chỉ thị này không phân biệt được giữa những cá thể đồng hợp tử và dị hợp

tử trong quần thể F2

RAPD là một kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện, không mất nhiều thờigian, ít tốn kém Kỹ thuật này rất phù hợp cho phân tích đa dạng di truyền và lậpbản đồ gen sử dụng quần thể RIL (Recombinant Inbred Line) Hạn chế lớn nhấtcủa kỹ thuật RAPD đó là nó rất nhậy cảm với nhiều yếu tố như: các thành phầntham gia phản ứng và đặc biệt là nhiệt độ gắn mồi, vì yếu tố gắn mồi mà có thể

có hai kết quả khác nhau với cùng một thí nghiệm sử dụng hai máy PCR khácnhau Để hạn chế nhược điểm này, cần phải tuân thủ nghiêm ngặt các điều kiệnthí nghiệm và phải tiến hành đồng bộ giữa các lần thí nghiệm

Trong những năm gần đây, kỹ thuật RAPD được sử dụng rộng rãi trongnghiên cứu đa dạng di truyền Nhiều nghiên cứu đã cho thấy, RAPD là mộtphương pháp có hiệu quả trong việc xác định kiểu gen, phân tích quần thể vànguồn gốc loài, nghiên cứu di truyền và lập bản đồ di truyền Phương

pháp này còn được ứng dụng trong việc đánh giá bộ gen của giống và khảnăng phân tích

Một số công trình nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử RAPD:

Trên thế giới:

Iqba và cs (1997) đã nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền của 23

giống Bông thuộc 2 loài Gossypium hirsutum L và Gossypium arboreum L.

sử dụng chỉ thị RAPD với 50 mồi ngẫu nhiên, kết quả có tổng số 349 băngđược nhân lên bởi phản ứng PCR, cho tỉ lệ đa hình 89,1%

Năm 2000, Jack và cs đã sử dụng kết hợp chỉ thị RAPD và SSR nghiên

cứu mối quan hệ di truyền của loài Dưa lê (Cucumis melo L.).

Một nhóm nghiên cứu tại trường Đại học Iowa State cũng đã thành

công trong việc phân lập được gen Lrd1 quy định tính trạng chống chịu bệnh đốm lá gây ra bởi Melampsora medusae f sp deltoidae ở một loài bạch dương là Populus deltoides (Tabor.GM và cs., 2000) Phương pháp chủ yếu

của tác giả này là nghiên cưu sự phân li của 2 chỉ thị RAPD – OPG10340 vàOPZ191800 liên kết với gen Lrd1 ở quần thể 116 cây lai.

Junghans và cs (2003) đã nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử để nhận

biết loài bạch đàn Eucalyptus grandis kháng bệnh rỉ sắt (Puccinia psidii

Winter) Phương pháp được sử dụng là phân tích đa hình RAPD và phân tíchbằng phương pháp BSA

Ngoài ra, các chỉ thị RAPD còn được sử dụng trong chọn giống thựcvật Gần đây, các nhà nghiên cứu còn khám phá một loạt các chỉ thị RAPDliên kết với gen kháng bệnh thối thân ở loài cải, gen kháng bệnh xoăn lá táo

do rầy, gen kiểm soát tính độc và không độc của dầu mè (Jatropha curcas),

một số chỉ thị RAPD cũng được xác định liên quan đến giới tính ở cọ

(Borassus flabellifer L.), giới tính của loài Pistacia vera

Ở Việt Nam:

Ở Việt Nam, cũng đã có một số công trình nghiên cứu sử dụng chỉ thịphân tử RAPD để phân tích đa hình di truyền, xác định quan hệ họ hàng giữacác loài đã được công bố

Năm 2004, tác giả Quách Thị Liên và cs đã sử dụng kỹ thuật RAPD vàDNA lục lạp đánh giá quan hệ di truyền của các xuất xứ lim xanh

(Erythrophloeum fordii Oliv.), cho thấy các xuất xứ nghiên cứu rất khác nhau

về mặt di truyền Cũng trên loài Lim xanh với 27 mẫu từ 3 vùng (Cầu Hai –Phú Thọ, Quảng Ninh và Nghệ An), tác giả Trần Quốc Trọng và cs (2005) sử

dụng kỹ thuật RAPD và DNA lục lạp với các mồi trnH - trnK, pbsC - trnS, các enzyme cắt hạn chế TaqI, HhaI, HinfI, cho kết quả là Lim xanh ở các

vùng nghiên cứu trên rất khác nhau về mặt di truyền

Tác giả Nguyễn Đức Thành và cs (2005) sử dụng kết hợp chỉ thị RAPDvới phân tích DNA lục lạp trong nghiên cứu quan hệ di truyền của một số loàithuộc họ Dầu (Dipterocarpaceae) tại Việt Nam Kết quả nghiên cứu cho thấycác loài cây họ Dầu ở Việt Nam rất đa dạng về mặt di truyền, hệ số di truyềndao động từ 0,18 đến 0,58

Năm 2007, Nguyễn Thị Lang và cs kết hợp phân tích đánh giá kiểuhình và đánh giá kiểu gen nhờ chỉ thị RAPD để phân tích đa dạng di truyền

của 14 mẫu giống Dưa leo (Cucumis spp.) được sưu tập tại Đồng bằng sông

Cửu long, kết quả đánh giá kiểu gen cho thấy các giống Dưa leo có sự sai

khác về mặt di truyền, mức sai khác từ 0,33 đến 0,66

Tác giả Nguyễn Hoàng Nghĩa và cs (2007) sử dụng chỉ thị RAPD phân

tích đa dạng di truyền loài Gõ đỏ (Afzelia xylocarpa (Kurz) Craib.) Kết quả

nghiên cứu chỉ ra các mẫu Gõ đỏ có mức đa dạng di truyền cao với hệ sốtương đồng di truyền dao động từ 47 đến 100%

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu gồm 20 giống bạch đàn trắng khô (được bảo quảntrong Silica gel) thu thập từ 5 xuất xứ Vĩnh Phúc, Quảng Trị, Quy Nhơn,Đồng Nai và Bình Dương (mỗi xuất xứ có 4 mẫu), do Trung tâm Nghiên cứugiống cây rừng, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam cung cấp Các giốngkháng bệnh có khả năng thích ứng với điều kiện khí hậu cao, còn các giốngmẫn cảm là những giống có khả năng sinh trưởng nhanh và cho năng suấtchất lượng gỗ cao Các mẫu được ký hiệu trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Ký hiệu các mẫu bạch đàn sử dụng trong nghiên cứu

STT Kí

Hiệu

Xuất Xứ

Kháng/Mẫn STT Kí

Hiệu

Xuất Xứ

+ Hỗn hợp phenol/ chloroform/ isoamyl alcohol (25: 24: 1 v/v)

+ Hỗn hợp chloroform/ isoamyl alcohol (25: 1 v/v)

+ Cồn tuyệt đối, cồn 70% (lạnh)

Những hoá chất dùng để thực hiện phản ứng RAPD:

- Dung dịch dệm PCR 5X (amplification buffer): 200 mM Tris-HCl (pH8,4), 500 mM KCl (Promega )

+ Ethidium bromide: 10 mg/ml

+ Đệm tra mẫu (Loading buffer) gồm: 2,5 mg bromophenol blue, 2,5

mg Xylene cyanol FF, 0,4 g Sucrose Thêm nước cất đến thể tích 1 ml Saukhi pha xong giữ ở tủ lạnh 4ºC

Hóa chất dùng cho phản ứng PCR:

Taq polymerase, dNTP, MgCl2, đệm 10× PCR và 10 mồi RAPD đượcđặt mua từ hãng OPERON (Mỹ), các mồi có trình tự trong bảng 2.2

Bảng 2.2 Tên và trình tự 10 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu

Stt Tên mồi Trình tự nucleotide

Các dụng cụ và thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm:

Khay đựng nitơ, cối và chày sứ, eppendorf 1,5 ml, micropipette các loại, đầu típ các loại, bồn ủ nhiệt (water bath), máy vortex, máy ly tâm lạnh,

tủ 40C và - 200C