Các băng DNA được ghi nhận dựa trên sự có mặt hay vắng mặt của chúng ở các mẫu nghiên cứu theo DNA chuẩn (DNA marker). Nếu một băng DNA (có kích thước cụ thể) xuất hiện ở mẫu i nhưng không xuất hiện ở mẫu j hoặc đồng thời xuất hiện ở cả i và j nhưng không xuất hiện ở các mẫu khác thì
băng DNA này gọi là băng đa hình. Ngược lại, nếu băng DNA này xuất hiện ở tất cả các mẫu nghiên cứu thì gọi là băng đơn hình.
Các băng được mã hóa bằng số tự nhiên 0 và 1. Nếu mẫu nào có băng thì ký hiệu là 1, còn không có thì ký hiệu là 0. Các số liệu này được đưa vào xử lý theo chương trình NTSYSpc 2.1 để tính ma trận tương đồng giữa các đôi mẫu.
Việc tính toán ma trận tương đồng dựa trên công thức:
Jij = a/(n – d)
a: Số băng DNA có ở hai dòng i và j
d: Số băng DNA không có băng cả hai dòng i và j n: Tổng số băng thu được
Jij: Hệ số tương đồng Jaccard giữa hai dòng i và j
Sau đó các mẫu nghiên cứu được xử lý tiếp với phần mền NTSYS để tính hệ số tương đồng di truyền và được biểu hiện trên biểu đồ quan hệ di truyền giữa các đối tượng nghiên cứu.
Ngoài ra, để đánh giá hiệu quả sử dụng mồi thì các nhà khoa học còn đưa ra một thông số nữa, đó là hàm lượng thông tin tính đa hình (PIC - Polymorphic Information Content) hay hệ số đa hình di truyền cho mỗi locus (i) được tính theo công thức (Weir, 1996).
PIC (i) = 1 – Σ Pij2
Trong đó: Pijlà tần suất allen thứ j với locus thứ i
Hệ số này có thể được tính bằng phần mềm PIC calculator. Tổng số các băng DNA có cùng kích thước (được coi là cùng một allen) sẽ được nhập vào phần mềm này và sẽ đưa ra được hệ số PIC.
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số
Hiện nay có nhiều phương pháp tách chiết DNA tổng số rất hiệu quả đã được cải biến và ứng dụng tuỳ thuộc vào đối tượng và điều kiện nghiên cứu
khác nhau. Chúng tôi chọn phương pháp tách chiết DNA các mẫu bạch đàn theo phương pháp của Grattapaglia và Sederoff (1994).
Sau khi thực hiện tách chiết DNA, tiến hành kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% và thu được kết quả như hình 3.1.
Hình 3.1. Kết quả điện di DNA tổng số 20 giống bạch đàn trắng
Trên ảnh điện di, các băng DNA tổng số của 20 giống bạch đàn trắng thu được đều gọn, không dính giếng cũng như không xuất hiện vệt sáng kéo dài ở phía dưới. Điều đó cho thấy DNA tổng số của các mẫu Bạch đàn trắng sau khi tách chiết có độ nguyên vẹn và tinh sạch cao.
Để xác định chính xác hơn nồng độ và độ tinh sạch của dụng dịch DNA tách chiết chúng tôi tiến hành đo nồng độ DNA trên máy đo NanoDrop (Thermo Scientific). Kết quả được thể hiện trong bảng 3.1 cho thấy độ hấp thụ bước sóng 260 nm, 280 nm đo được ở các mẫu là từ 1,78 đến 2,00. Nồng độ DNA dao động trong khoảng 849,8 đến 1284,7. Các chỉ số này cho thấy sản phẩm DNA tách được đã có độ tinh sạch khá cao. Vì vậy ta có thể tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Bảng 3.1. Kết quả đo độ hấp thụ bước sóng 260 nm, 280 nm và nồng độ DNA tổng số của 20 mẫu Bạch đàn trắng
TT Tên mẫu OD260/OD280 Nồng độ DNA
ng/µl 1 BD1 1,98 1093,5 2 BD2 1,94 1284,7 3 BD3 1,98 1236,6 4 BD4 1,85 1132,1 5 BD5 1,84 1036,8 6 BD6 1,95 849,8 7 BD7 1,83 880,5 8 BD8 1,96 944,9 9 BD9 2,00 1221,9 10 BD10 1,98 874,1 11 BD11 1,93 1180,6 12 BD12 1,96 965,4 13 BD13 1,82 1117,2 14 BD14 1,80 1242,5 15 BD15 1,79 1098,5 16 BD16 2,00 1224,3 17 BD17 1,88 981,8 18 BD18 1,88 922,6 19 BD19 1,93 1069,4 20 BD20 1,78 1165,5
Từ nồng độ DNA tính theo công thức ta sẽ pha loãng DNA để sử dụng cho phản ứng RAPD – PCR với nồng độ pha loãng là 100 ng/µl.
3.2. Kết quả đánh giá sự đa hình của các mồi RAPD với 20 giống bạch đàn trắng
Để nghiên cứu quan hệ di truyền giữa các xuất xứ Bạch đàn trắng, chúng tôi đã sử dụng 10 mồi RAPD có tên và trình tự trên bảng 2.2.
Sau khi hoàn thành phản ứng PCR sản phẩm được điện di trên gel agarose 1% để phân tích đa hình DNA của các mẫu nghiên cứu. Các băng DNA thu được được phân tích dựa trên sự có mặt hay vắng mặt của chúng ở các mẫu nghiên cứu
Sau đây là một số ví dụ của việc sử dụng chỉ thị RAPD trong phản ứng PCR. Hình ảnh điện di và đa hình các băng DNA thu được của sản phẩm PCR-RAPD khi sử dụng các mồi: OPG13, OPB10, OPR08, RA31, RA50.
Hình 3.2. Điện di sản phẩm PCR-RAPD của các giống bạch đàn trắng với mồi OPG13 (M: Marker 1 kb, giếng 1-20: tương ứng giống BD1-BD20)
Từ hình 3.2 ta thấy, chạy RAPD – PCR với mồi OPG13 cho kết quả rất tốt với nhiều băng DNA. Sản phẩm DNA nhân lên với mồi OPG13 có kích thước trong khoảng 0,25 – 0,65 kb. Trong tổng số 111 băng thu được, có 71 băng đa hình (tỷ lệ 63%) và 40 băng đơn hình (tỷ lệ 37%). Các băng đơn hình xuất hiện ở vị trí marker khoảng 0,25 và 0,5 kb. Số lượng băng đa hình tạo ra và tỷ lệ băng đa hình cao. Nên mồi OPG13 có giá trị cao trong việc đánh giá đa dạng của 20 giống bạch đàn trắng.
250 bp 500 bp 750 bp 500 bp 750 bp 1000 bp
Hình 3.3. Điện di sản phẩm PCR-RAPD của các giống bạch đàn trắng với mồi OPB10 (M: Marker 1 kb, giếng 1-20: tương ứng giống BD1-BD20)
Với mồi OPB10: ta thu được sản phẩm RAPD – PCR của 20 giống
bạch đàn trắng ở hình 3.3 cho thấy, các băng DNA được nhân lên có kích thước trong khoảng 0,35 – 0,95 kb. Tổng số băng DNA xuất hiện là 93 với 73 băng đa hình (tỷ lệ 78.5%) và 20 băng đơn hình (tỷ lệ 21.5%). Các băng đơn hình xuất hiện ở vị trí marker khoảng 0,4 kb. Số lượng băng đa hình tạo ra và tỷ lệ băng đa hình khá cao. Mồi OPB10 cũng có giá trị cao trong việc đánh giá đa dạng của 20 giống bạch đàn trắng.
Hình 3.4. Điện di sản phẩm PCR-RAPD của các giống bạch đàn trắng với mồi OPR08 (M: Marker 1 kb, giếng 1-20: tương ứng giống BD1-BD20)
Với mồi OPR08: ta có sản phẩm RAPD – PCR của các mẫu bạch đàn trắng ở hình 3.4 cho thấy, các băng DNA được nhân lên có kích thước trong khoảng 0,3 – 0,75 kb. Tổng số băng DNA xuất hiện là 46 với 46 băng đa hình (tỷ lệ 100%). Số lượng băng đa hình tạo ra khá lớn và tỷ lệ băng đa hình 100%. Vì vậy mồi OPR08 có giá trị cao trong việc đánh giá đa dạng của 20 giống bạch đàn trắng.
250 bp 500 bp 750 bp
Hình 3.5. Sản phẩm PCR-RAPD 20 giống bạch đàn trắng với mồi RA31 (M: Marker 1 kb, giếng 1-20: tương ứng giống BD1-BD20)
Với mồi RA31: thu được sản phẩm RAPD – PCR 20 giống bạch đàn
trắng ở hình 3.5 cho thấy, các băng DNA được nhân lên có kích thước trong khoảng 0,5 – 1,3 kb. Tổng số băng DNA xuất hiện là 54 với 54 băng đa hình (tỷ lệ 100%). Số lượng băng đa hình tạo ra khá lớn và tỷ lệ băng đa hình 100%. Nên mồi RA31 có giá trị cao trong việc đánh giá đa dạng của 20 giống bạch đàn trắng. 500 bp 250 bp 750 bp 1000 bp 1500 bp 500 bp 750 bp
Hình 3.6: Điện di sản phẩm PCR-RAPD của các giống bạch đàn trắng với mồi RA50 (M: Marker 1 kb, giếng 1-20: tương ứng giống BD1-BD20)
Với mồi RA50: thu được sản phẩm RAPD – PCR 20 giống bạch đàn
trắng ở hình 3.6 cho thấy, các băng DNA được nhân lên có kích thước trong khoảng 0,1 – 0,75 kb. Tổng số băng DNA xuất hiện là 34 với 34 băng đa hình (tỷ lệ 100%). Tỷ lệ băng đa hình 100%. Vì vậy mồi RA50 cũng có giá trị cao trong việc đánh giá đa dạng của 20 giống bạch đàn trắng.
Các mồi OPD20, OPF09, OPG09, RA45, RA46 cũng cho kết quả tương tự như các mồi ở trên. Sản phẩm cũng cho rất nhiều băng, số lượng và tỷ lệ băng đa hình cũng là khá cao. Tỷ lệ băng đa hình đều trên 50%. Vì vậy các mồi này cũng có giá trị cao trong việc đánh giá đa dạng của 20 giống bạch đàn trắng.
Phân tích tổng hợp các băng DNA thu được trên hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RADP của 10 mồi và sử dụng phần mềm PIC calculator ta có thể đưa ra kết quả ở bảng 3.2.
STT Tên mồi Số băng quan sát được Số băng đa hình Tỷ lệ đa hình (%) Pic 1 OPB10 93 73 78.5% 0,832 2 OPD20 41 41 100% 0,622 3 OPF09 27 27 100% 0,417 4 OPG09 48 48 100% 0,772 5 OPG13 111 71 63% 0,720 6 OPR08 46 46 100% 0,714 7 RA31 54 54 100% 0,772 8 RA45 46 46 100% 0,764 9 RA46 70 50 71.43% 0,753 10 RA50 33 33 100% 0,562 Tổng 569 489 6,928
Bảng 3.2. Sự đa hình của 10 mồi RAPD nhận được sau khi chạy PCR với DNA tổng số của 20 mẫu bạch đàn trắng
Sự đa hình của 10 mồi RAPD được đánh giá thông qua giá trị PIC của mỗi chỉ thị RAPD. Giá trị PIC biến động giữa các vị trí locus, dao động từ 0,417 (mồi OPF09) đến 0,832 (mồi OPB10), giá trị PIC trung bình là 0,69. Các chỉ thị RAPD có giá trị PIC lớn hơn hoặc bằng 0,50 sẽ cho sự phân biệt cao về tỷ lệ đa hình của chỉ thị đó (Đinh Thị Phòng và Ngô Thị Lam Giang, 2008). Mồi OPB10 cho giá trị PIC lớn nhất là 0,832. Chứng tỏ mồi OPB10 có khả năng rất cao trong việc đánh giá sự đa dạng của 20 dòng bạch đàn.
Qua bảng 3.3 ta thấy các băng DNA được nhân lên gồm có hai loại: loại đơn hình (monomorphic) có mặt ở tất cả các mẫu nghiên cứu và loại đa hình (polymorphic) không có mặt ở mẫu này nhưng lại có mặt ở mẫu khác. Trong tổng số 569 băng thu được thì có 80 băng đơn hình xuất hiện ở tất cả các mẫu nghiên cứu (chiếm 14,06%) và 489 băng đa hình (chiếm 85,94%). Kích thước băng nhỏ nhất khoảng 0,25 kb và kích thước băng lớn nhất khoảng 1,35 kb. Mồi OPG13 nhân lên được số băng nhiều nhất (111 băng). Mồi OPF 09 nhân lên được số băng ít nhất (27 băng). Có 7 mồi cho tỷ lệ đa hình là 100% (OPD20, OPF09, OPG09, OPR08, RA31, RA45, RA50). Và 3 mồi còn lại đều cho tỷ lệ đa hình cao (lớn hơn 60%). Tỷ lệ đa hình cao cho thấy các mồi RAPD sử dụng có ý nghĩa cao trong phân tích, nghiên cứu đa dạng di truyền của loài bạch đàn trắng.
3.3. Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền giữa mẫu bạch đàn nghiên cứu.
Hệ số tương đồng di truyền Jaccard cho ta biết mối tương quan về mặt di truyền giữa các mẫu phân tích. Hệ số Jaccard càng tiến về 0 thì mức độ tương đồng di truyền giữa các mẫu càng thấp và ngược lại, càng tiến về 1 thì mức độ tương đồng di truyền càng cao. Số liệu thu được từ kết quả PCR– RAPD được đưa vào xử lý bằng phần mềm NTSYSpc 2.1 để tính hệ số tương đồng di truyền và xây dựng biểu đồ quan hệ di truyền giữa các dòng bạch đàn
trắng. Sau đó dựa vào hệ số tương đồng di truyền chúng tôi xây dựng cây phát sinh chủng loại được thể hiện trên hình sau:
Hệ số tương đồng di truyền phản ánh quan hệ di truyền của các giống bạch đàn trắng với nhau. Hai giống bạch đàn trắng càng gần nhau về mặt di truyền thì hệ số tương đồng giữa chúng càng lớn và ngược lại hai giống có hệ số tương đồng di truyền thấp thì mối quan hệ di truyền của chúng càng xa nhau.
Bảng 3.8 thể hiện hệ số tương đồng di truyền của từng cặp giống. Kết quả cho thấy giữa các mẫu nghiên cứu có hệ số tương đồng di truyền Jaccard nằm trong khoảng 0,4000 – 0,7812. Trong đó, hệ số tương đồng di truyền thấp nhất là 0,4000 của cặp mẫu BD5 – BD20 và BD6 – BD14 (các mẫu ký hiệu BD5, BD6 có xuất xứ Quảng Trị còn các mẫu ký hiệu BD14, BD20 có xuất xứ Đồng Nai và Bình Dương), 2 cặp giống này có sự đa dạng rất cao. Hệ số tương đồng di truyền cao nhất của BD8 và BD11 là 0,7812. Hai mẫu BD8 và BD11 xuất xứ Quảng Trị , Quy Nhơn có hệ số tương đồng di truyền rất cao chứng tỏ hai mẫu này có quan hệ di truyền rất gần nhau.
Sau khi phân tích hệ số tương đồng chúng tôi đã xây dựng sơ đồ hình cây (hình 3.7) để chỉ ra sự sai khác di truyền của các giống bạch đàn trắng. Mức độ khác nhau được biểu hiện bằng hệ số sai khác giữa các giống. Các giống có hệ số di truyền cao được xếp vào một nhóm, giữa các nhóm lại có liên kết với nhau.
Hình 3.7. Biểu đồ quan hệ di truyền giữa các giống bạch đàn trắng (gồm 4 nhóm chính và 4 phân nhóm phụ)
PN 1
PN 2
PN 1
Phân tích hình 3.7 cho thấy, 20 giống bạch đàn trắng được chia làm 4 nhóm chính:
Nhóm I: Gồm 11 giống BD1, BD2, BD3, BD4, BD7, BD9, BD8, BD11,
BD13, BD5, BD6. Hệ số tương đồng từng cặp dao động trong khoảng 0,55 đến 0,78. Cặp giống BD2 và BD13 có hệ số tương đồng thấp nhất là 0,475. Cặp giống BD8 và BD11 có hệ số tương đồng cao nhất là 0,78. Các giống này được phân chia thành 2 phân nhóm:
+ Phân nhóm 1: Gồm 3 giống BD1, BD2, BD3. Hệ số tương đồng di
truyền từng cặp dao động trong khoảng 0,58 đến 0,71 và có hệ số tương đồng di truyền từng cặp với các giống khác trong nhóm dao động từ 0,56 đến 0,71. Các giống trong phân nhóm này đều có cùng 1 xuất xứ ở Vĩnh Phúc. BD1 và BD2 là các giống có khả năng kháng bệnh cao, BD3 là giống mẫn cảm với bệnh.
+ Phân nhóm 2: Gồm 8 giống BD4, BD5, BD6, BD7, BD8, BD9, BD11,
BD13. Hệ số tương đồng di truyền từng cặp dao động trong khoảng 0,6 đến 0,78 và có hệ số tương đồng di truyền từng cặp với các giống khác trong nhóm dao động từ 0,48 đến 0,78. Các giống ở phân nhóm này có ở 4 xuất xứ: Vĩnh Phúc, Quảng Trị, Quy Nhơn, Đồng Nai chứng tỏ có sự đa dạng cao trong phân nhóm này. Các giống BD5, BD9,BD13 là các giống kháng bệnh, còn các giống BD4, BD6, BD7, BD8, BD11 là các giống mẫn cảm.
Nhóm II: Gồm 7 giống BD12, BD14, BD18, BD19, BD15, BD17, BD20.
Hệ số tương đồng từng cặp dao động trong khoảng 0,58 đến 0,75. Cặp giống BD12 và BD17 có hệ số tương đồng thấp nhất là 0,486. Cặp giống BD2 và BD14 có hệ số tương đồng cao nhất là 0,741. Các giống này được phân chia thành 2 phân nhóm:
+ Phân nhóm 1: Gồm 5 giống BD12, BD14, BD18, BD19, BD15. Hệ số tương đồng di truyền từng cặp dao động trong khoảng 0,65 đến 0,75 và có hệ số tương đồng di truyền từng cặp với các giống khác trong nhóm dao động từ 0,48 đến 0,74. Các giống ở phân nhóm này có ở 3 xuất xứ: Quy Nhơn, Đồng Nai, Bình Dương. Có sự đa dạng trong phân nhóm này. BD14, BD18 là các giống có khả năng kháng bệnh, còn BD14, BD15, BD19 là các giống mẫn cảm.
+ Phân nhóm 2: Gồm 2 giống BD17, BD20. Hệ số tương đồng di truyền giữa hai giống này là 0,71. Ở phân nhóm này có 2 giống ở cùng 1 xuất xứ ở Bình Dương. BD17 là giống có khả năng kháng bệnh, còn BD20 là giống mẫn cảm với bệnh.
Nhóm III: Có 1 giống là BD16. Giống này có sự khác biệt lớn so với các giống khác. Hệ số tương đồng di truyền giữa giống này với các giống khác nằm trong khoảng 0,42 đến 0,62. BD16 có xuất xứ tại Đồng Nai và là giống mẫn cảm với bệnh.
NhómIV: Có 1 giống là BD10. Hệ số tương đồng di truyền giữa giống này với các giống khác nằm trong khoảng 0,43 đến 0,57. BD10 có xuất xứ tại Quy Nhơn, BD10 là giống có khả năng kháng bệnh cao.
Nhìn chung qua phân tích ta thấy các nhóm đã có sự đa dạng về kiểu hình và kiểu gen. Ở Nhóm I với 11 giống thì có 6 giống kháng bệnh (BD1, BD2, BD5, BD6, BD9, BD13) ở 4 xuất xứ Vĩnh Phúc Quảng Trị, Quy Nhơn, Đồng Nai và 5 giống mẫn cảm (BD3, BD4, BD7, BD8, BD11) có ở 3 xuất xứ Vĩnh