RAPD là viết tắt của cụm từ tiếng Anh: Randomly Amplified Polymorphic DNA (Đa hình DNA dược nhân bản ngẫu nhiên). RAPD là kỹ thuật được xây dựng dựa trên nguyên lý PCR, với những mồi được thiết kế ngẫu nhiên có chiều dài khoảng 10 nucleotide. Trong phản ứng, các mồi RAPD gắn ngẫu nhiên vào DNA khuôn ở bất kỳ vị trí nào mà có trình tự bổ sung với nó. Sản phẩm PCR được điện di trong gel agarose và phát hiện bằng cách nhuộm với dung dịch ethidium bromide, kích thước sản phẩm có chiều dài từ 200bp đến 2000bp. Về cơ bản, chỉ thỉ RAPD là một chỉ thị trội, nghĩa là chỉ thị này không phân biệt được giữa những cá thể đồng hợp tử và dị hợp tử trong quần thể F2.
RAPD là một kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện, không mất nhiều thời gian, ít tốn kém. Kỹ thuật này rất phù hợp cho phân tích đa dạng di truyền và lập bản đồ gen sử dụng quần thể RIL (Recombinant Inbred Line). Hạn chế lớn nhất của kỹ thuật RAPD đó là nó rất nhậy cảm với nhiều yếu tố như: các thành phần tham gia phản ứng và đặc biệt là nhiệt độ gắn mồi, vì yếu tố gắn mồi mà có thể có hai kết quả khác nhau với cùng một thí nghiệm sử dụng hai máy PCR khác nhau. Để hạn chế nhược điểm này, cần phải tuân thủ nghiêm ngặt các điều kiện thí nghiệm và phải tiến hành đồng bộ giữa các lần thí nghiệm.
Trong những năm gần đây, kỹ thuật RAPD được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy, RAPD là một phương pháp có hiệu quả trong việc xác định kiểu gen, phân tích quần thể và nguồn gốc loài, nghiên cứu di truyền và lập bản đồ di truyền. Phương
pháp này còn được ứng dụng trong việc đánh giá bộ gen của giống và khả năng phân tích.
Một số công trình nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử RAPD: Trên thế giới:
Iqba và cs (1997) đã nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền của 23 giống Bông thuộc 2 loài Gossypium hirsutum L. và Gossypium arboreum L. sử dụng chỉ thị RAPD với 50 mồi ngẫu nhiên, kết quả có tổng số 349 băng được nhân lên bởi phản ứng PCR, cho tỉ lệ đa hình 89,1%.
Năm 2000, Jack và cs đã sử dụng kết hợp chỉ thị RAPD và SSR nghiên cứu mối quan hệ di truyền của loài Dưa lê (Cucumis melo L.).
Một nhóm nghiên cứu tại trường Đại học Iowa State cũng đã thành công trong việc phân lập được gen Lrd1 quy định tính trạng chống chịu bệnh đốm lá gây ra bởi Melampsora medusae f. sp. deltoidae ở một loài bạch dương là Populus deltoides (Tabor.GM và cs., 2000). Phương pháp chủ yếu của tác giả này là nghiên cưu sự phân li của 2 chỉ thị RAPD – OPG10340 và OPZ191800 liên kết với gen Lrd1 ở quần thể 116 cây lai.
Junghans và cs (2003) đã nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử để nhận biết loài bạch đàn Eucalyptus grandis kháng bệnh rỉ sắt (Puccinia psidii
Winter). Phương pháp được sử dụng là phân tích đa hình RAPD và phân tích bằng phương pháp BSA.
Ngoài ra, các chỉ thị RAPD còn được sử dụng trong chọn giống thực vật. Gần đây, các nhà nghiên cứu còn khám phá một loạt các chỉ thị RAPD liên kết với gen kháng bệnh thối thân ở loài cải, gen kháng bệnh xoăn lá táo do rầy, gen kiểm soát tính độc và không độc của dầu mè (Jatropha curcas), một số chỉ thị RAPD cũng được xác định liên quan đến giới tính ở cọ (Borassus flabellifer L.), giới tính của loài Pistacia vera.
Ở Việt Nam:
Ở Việt Nam, cũng đã có một số công trình nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử RAPD để phân tích đa hình di truyền, xác định quan hệ họ hàng giữa các loài đã được công bố.
Năm 2004, tác giả Quách Thị Liên và cs đã sử dụng kỹ thuật RAPD và DNA lục lạp đánh giá quan hệ di truyền của các xuất xứ lim xanh (Erythrophloeum fordii Oliv.), cho thấy các xuất xứ nghiên cứu rất khác nhau về mặt di truyền. Cũng trên loài Lim xanh với 27 mẫu từ 3 vùng (Cầu Hai – Phú Thọ, Quảng Ninh và Nghệ An), tác giả Trần Quốc Trọng và cs (2005) sử dụng kỹ thuật RAPD và DNA lục lạp với các mồi trnH - trnK, pbsC - trnS, các enzyme cắt hạn chế TaqI, HhaI, HinfI, cho kết quả là Lim xanh ở các vùng nghiên cứu trên rất khác nhau về mặt di truyền.
Tác giả Nguyễn Đức Thành và cs (2005) sử dụng kết hợp chỉ thị RAPD với phân tích DNA lục lạp trong nghiên cứu quan hệ di truyền của một số loài thuộc họ Dầu (Dipterocarpaceae) tại Việt Nam. Kết quả nghiên cứu cho thấy các loài cây họ Dầu ở Việt Nam rất đa dạng về mặt di truyền, hệ số di truyền dao động từ 0,18 đến 0,58.
Năm 2007, Nguyễn Thị Lang và cs kết hợp phân tích đánh giá kiểu hình và đánh giá kiểu gen nhờ chỉ thị RAPD để phân tích đa dạng di truyền của 14 mẫu giống Dưa leo (Cucumis spp.) được sưu tập tại Đồng bằng sông Cửu long, kết quả đánh giá kiểu gen cho thấy các giống Dưa leo có sự sai khác về mặt di truyền, mức sai khác từ 0,33 đến 0,66.
Tác giả Nguyễn Hoàng Nghĩa và cs (2007) sử dụng chỉ thị RAPD phân tích đa dạng di truyền loài Gõ đỏ (Afzelia xylocarpa (Kurz) Craib.). Kết quả nghiên cứu chỉ ra các mẫu Gõ đỏ có mức đa dạng di truyền cao với hệ số tương đồng di truyền dao động từ 47 đến 100%.
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu gồm 20 giống bạch đàn trắng khô (được bảo quản trong Silica gel) thu thập từ 5 xuất xứ Vĩnh Phúc, Quảng Trị, Quy Nhơn, Đồng Nai và Bình Dương (mỗi xuất xứ có 4 mẫu), do Trung tâm Nghiên cứu giống cây rừng, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam cung cấp. Các giống kháng bệnh có khả năng thích ứng với điều kiện khí hậu cao, còn các giống mẫn cảm là những giống có khả năng sinh trưởng nhanh và cho năng suất chất lượng gỗ cao. Các mẫu được ký hiệu trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Ký hiệu các mẫu bạch đàn sử dụng trong nghiên cứu
STT Kí Hiệu Xuất Xứ Kháng/Mẫn STT Kí Hiệu Xuất Xứ Kháng/Mẫn 1 BD1 Vĩnh Phúc Kháng bệnh 11 BD11 Quy Nhơn Mẫn cảm 2 BD2 Vĩnh Phúc Kháng bệnh 12 BD12 Quy Nhơn Mẫn cảm 3 BD3 Vĩnh Phúc Mẫn cảm 13 BD13 Đồng Nai Kháng bệnh 4 BD4 Vĩnh Phúc Mẫn cảm 14 BD14 Đồng Nai Kháng bệnh 5 BD5 Quảng Trị Kháng bệnh 15 BD15 Đồng Nai Mẫn cảm 6 BD6 Quảng Trị Kháng bệnh 16 BD16 Đồng Nai Mẫn cảm 7 BD7 Quảng Trị Mẫn cảm 17 BD17 Bình Dương Kháng bệnh 8 BD8 Quảng Trị Mẫn cảm 18 BD18 Bình Dương Kháng bệnh 9 BD9 Quy Nhơn Kháng bệnh 19 BD19 Bình Dương Mẫn cảm 10 BD10 Quy Nhơn Kháng bệnh 20 BD20 Bình Dương Mẫn cảm
2.1.2. Hóa chất và thiết bị2.1.2.1. Hóa chất 2.1.2.1. Hóa chất
Hoá chất dùng để tách chiết DNA tổng số:
+ Đệm CTAB 100 ml gồm: - Nước cất : 71 ml -Tris HCl 1 M, pH 8,0 : 10 ml - EDTA 0,5 M, pH 8,0 : 2 ml - NaCl 5 M : 14 ml - CTAB 2 % : 2 g - β – mercaptoethanol : 200 µl + Đệm TE gồm: - EDTA 0,5 M, pH 8,0 : 10 mM - Tris HCl pH 8,0 : 1 mM +RNase (10 mg/ml)
+ Hỗn hợp phenol/ chloroform/ isoamyl alcohol (25: 24: 1 v/v) + Hỗn hợp chloroform/ isoamyl alcohol (25: 1 v/v)
+ Cồn tuyệt đối, cồn 70% (lạnh)
Những hoá chất dùng để thực hiện phản ứng RAPD:
- Dung dịch dệm PCR 5X (amplification buffer): 200 mM Tris-HCl (pH8,4), 500 mM KCl (Promega ).
- MgCl2 25 mM (Promega).
- dNTP 10 mM (gồm dATP, dTTP, dGTP, dCTP) (Promega). - Taq DNA polymerase 5 UI/µl (Promega). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Primer .
Hóa chất điện di:
+ Agarose
+ Đệm 10× TBE gồm: 54 g Tris base, 27,5 g boric axit, 20 ml EDTA 0,5 M, pH 8,0. Thêm nước cất đến thể tích 500 ml
+ Ethidium bromide: 10 mg/ml
+ Đệm tra mẫu (Loading buffer) gồm: 2,5 mg bromophenol blue, 2,5 mg Xylene cyanol FF, 0,4 g Sucrose. Thêm nước cất đến thể tích 1 ml. Sau khi pha xong giữ ở tủ lạnh 4ºC.
Hóa chất dùng cho phản ứng PCR:
Taq polymerase, dNTP, MgCl2, đệm 10× PCR và 10 mồi RAPD được đặt mua từ hãng OPERON (Mỹ), các mồi có trình tự trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Tên và trình tự 10 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu
Stt Tên mồi Trình tự nucleotide
1 OPB10 CTGCTGGGAC 2 OPD20 ACCCGGTCAC 3 OPF09 CCAAGCTTCC 4 OPG09 CTGACGTCAC 5 OPG13 CTCTCCGCCA 6 OPR08 CCCGTTGCCT 7 RA31 AACCGACGGG 8 RA45 TACCACCCCG 9 RA46 CCAGACCCTG 10 RA50 GCTGTGCAGC 2.1.2.2. Thiết bị
Các dụng cụ và thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm:
Khay đựng nitơ, cối và chày sứ, eppendorf 1,5 ml, micropipette các loại, đầu típ các loại, bồn ủ nhiệt (water bath), máy vortex, máy ly tâm lạnh, tủ 40C và - 200C.
Các dụng cụ và thiết bị dùng trong điện di:
Cân kĩ thuật 4 số, lò viba, khay đổ gel, bồn và máy điện di (Bio-rad), máy chụp hình gel (Gel doc), ống đong.
Các dụng cụ và thiết bị đuợc sử dụng trong phản ứng RAPD:
Hộp đá khô -200C, eppendorf 0,2 ml, micropipette 10 µl, 100 µl và các loại đầu típ tương ứng, máy luân nhiệt, tủ thao tác vô trùng.
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Tách chiết DNA tổng số của bạch đàn
Tách chiết và tinh sạch DNA các mẫu bạch đàn theo phương pháp của Grattapaglia và Sederoff (1994).
Quy trình tách chiết
+ Nghiền nhanh 0.2g lá bằng cối chầy sứ trong nitơ lỏng cho đến khi tạo thành bột thật mịn, sau đó chuyển ngay vào ống eppendorf 2ml, giữ trong đá;
+ Bổ sung 1ml đệm rửa, lắc mạnh trong 40 giây ly tâm (14000 vòng/phút, 40C, 7 phút);
+ Loại dịch nổi và lặp lại bước 2-3 từ 1 đến 2 lần;
+ Bổ sung 800 µl chloroform/isoamyl alcohol (24:1) vào mẫu, lắc đều trong thời gian 10 phút;
+ Ly tâm với tốc độ 14000 vòng/phút trong thời gian 10-15 phút ở 40C (tùy từng loại mẫu, làm sao cho phần lặng cắn xuống);
+ Dùng pipet chuyển dịch nổi sang ống eppendorf 2ml;
+ Bổ sung 1 thể tích tương đương Isopropanol (lạnh) và đảo nhẹ, giữ mẫu trong đá 10 phút;
+ Ly tâm 14000 vòng/phút trong thời gian 10-15 phút ở 40C;
+ Loại dịch nổi, rửa DNA bằng cách thêm 500 µl cồn 80%, ly tâm 14000 vòng/phút trong thời gian 4 phút ở 40C (bước này thực hiện 2 lần), sau đó nhẹ nhàng loại bỏ ethanol (tránh để các cuộn DNA rơi ra ngoài); (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Làm khô DNA bằng quạt gió, máy hút chân không; + Hòa tan trong 200 µl TE;
+ Sau khi DNA được hòa tan thì bổ sung 3 µl RNase (10mg/ml). Giữ sản phẩm ở 370C trong thời gian 2 giờ;
+ Cho vào 200 µl chloroform/isoamyl alcohol (24:1), đảo nhẹ (hỗn hợp được phân thành 2 lớp, lớp trên có chứa DNA), ly tâm 14000 vòng/phút trong thời gian 5 phút ở 40C;
+ Chuyển pha trên sang ống eppendorf mới và bổ sung 200 µl CH3COONa 3M, cho tiếp 450 µl ethanol lạnh 100% vào, lắc nhẹ và giữ sản phẩm trong đá 30 phút;
+ Ly tâm 14000 vòng/phút trong thời gian 10-15 phút ở 40C;
+ Đổ phần dịch nổi, rửa DNA bằng 400 µl ethanol 80% hai lần. Sau mỗi lần rửa, ly tâm với tốc độ 14000 vòng/phút trong thời gian 6 phút, sau đó loại bỏ ethanol nhẹ nhàng (tránh để các cuộn DNA rơi ra ngoài);
+ Làm khô DNA bằng quạt gió hoặc hút chân không;
+ Bổ sung 100 µl TE vào sản phẩm để hòa tan DNA và giữ ở 40C; + Điện di kiểm tra DNA tổng số trên gel agarose 1% và đo OD.
2.2.2. Phương pháp đo nồng độ DNA bằng quang phổ kế
DNA sau khi tách chiết sẽ được đo nồng độ trên NanoDrop.
Dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng ở bước sóng 260 nm của các base purine và pyrimidine, người ta sẽ đo được giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm (OD260nm – Optical Density 260 nm) của các mẫu và cho phép xác định nồng độ DNA. Một dung dịch axit nucleic được xem là sạch (không tạp nhiễm protein) khi tỉ số OD260nm/ OD280nm nằm trong khoảng 1,8 – 2,0.
2.2.3. Phương pháp PCR với các mồi RAPD
Phương pháp PCR với các mồi RAPD được thực hiện trên máy PCR PTC – 100 (MJ Research Inc, Mỹ), với tổng thể tích là 25 µl/mẫu gồm những thành phần được nêu ở bảng 2.3.
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng RAPD – PCR.
STT Thành phần Thể tích (µl)
2 dNTP (2,5 mM) 2,5 µl
3 Đệm 10× PCR 2,5 µl
4 MgCl2 (25 mM) 2 µl
5 Mồi RAPD (10 ng/μl) 2 µl
6 Enzyme Taq Sigma polymerase
(5 UI/μl) 0,2 µl
7 DNA tổng số (100 ng/µl) 3 µl
8 Tổng 25 µl
Trộn đều các thành phần của hỗn hợp rồi chuyển vào máy PCR sau đó chạy theo chương trình đã cài đặt sẵn với 45 chu kỳ gồm các bước:
1. 94ºC trong 4 phút 2. 92ºC trong 1 phút 3. 35ºC trong 1 phút 4. 72ºC trong 1 phút
5. Lặp lại 45 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4 6. 72ºC trong 10 phút
7. Giữ nhiệt độ 4ºC trong 30 phút
Kết quả phản ứng RAPD – PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% với máy điện di Msmidi (Cleaver Scientific).
2.2.4 Phương pháp điện di trên gel agarose
Nguyên lý : (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Các phân tử axit nucleic tích điện âm, do đó khi đặt chúng trong điện trường ổn định với hiệu điện thế thích hợp thì chúng di chuyển từ cực âm sang cực dương của điện trường. Tốc độ di chuyển phụ thuộc vào điện tích, kích thước, cấu trúc không gian của phân tử và nồng độ cấu thành gel.
Việc chọn nồng độ gel tùy thuộc vào kích thước trung bình của các đoạn DNA cần phân tách. Đoạn DNA có kích thước càng nhỏ đòi hỏi hàm lượng agarose trong gel càng lớn và ngược lại.
Trong điện di trên gel agarose, các đoạn DNA được hiện hình dưới tia tử ngoại (UV) nhờ ethidium bromide (EtBr) có khả năng gắn xen giữa các base của DNA và phát huỳnh quang dưới tác dụng của UV. Sau khi điện di, gel được nhuộm với ethidium bromide và soi bằng UV, các đoạn DNA hiện thành vạch sáng màu trên bản gel. Để ước lượng kích thước các trình tự DNA trong gel agarose, người ta dùng “yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử” (molecular weight marker – MWM), đó là một tập hợp các trình tự DNA có kích thước đã biết (thang DNA – Marker)
Các bước thực hiện:
+ Chuẩn bị khay và lược.
+ Chuẩn bị gel agarose 1%: cân 1g agarose, bổ sung xấp xỉ 100ml TAE 1X. Đun agarose trong lò vi sóng cho đến khi tạo thành dung dịch đồng nhất.
+ Để nguội khoảng 50-600C.
+ Đổ dung dịch vào khay sao cho không có bọt khí.
+ Sau 1h rút lược và đưa gel vào bể chạy điện di. Cho đệm TAE 1X ngập gel 2 mm.
+ Cho 5µl loading dye vào mẫu, tra vào giếng, thời gian chạy điện di từ 2h-2h30 phút.
Sau khi điện di xong sẽ tiến hành nhuộm bản gel: bản gel được lấy ra khỏi khuôn, ngâm trong 20-30 phút trong dung dịch EtBt 0,5µg/ml, rửa lại bằng nước cất và quan sát dưới tia UV (254 nm) trên máy soi DNA, (Mini- transllumminatior, BioRad, Mỹ), ảnh được chụp bằng máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển).
2.2.5 Phương pháp phân tích số liệu RAPD
Các băng DNA được ghi nhận dựa trên sự có mặt hay vắng mặt của chúng ở các mẫu nghiên cứu theo DNA chuẩn (DNA marker). Nếu một băng DNA (có kích thước cụ thể) xuất hiện ở mẫu i nhưng không xuất hiện ở mẫu j hoặc đồng thời xuất hiện ở cả i và j nhưng không xuất hiện ở các mẫu khác thì
băng DNA này gọi là băng đa hình. Ngược lại, nếu băng DNA này xuất hiện ở tất cả các mẫu nghiên cứu thì gọi là băng đơn hình.
Các băng được mã hóa bằng số tự nhiên 0 và 1. Nếu mẫu nào có băng thì ký hiệu là 1, còn không có thì ký hiệu là 0. Các số liệu này được đưa vào xử lý theo chương trình NTSYSpc 2.1 để tính ma trận tương đồng giữa các đôi mẫu.
Việc tính toán ma trận tương đồng dựa trên công thức:
Jij = a/(n – d)
a: Số băng DNA có ở hai dòng i và j
d: Số băng DNA không có băng cả hai dòng i và j n: Tổng số băng thu được
Jij: Hệ số tương đồng Jaccard giữa hai dòng i và j
Sau đó các mẫu nghiên cứu được xử lý tiếp với phần mền NTSYS để tính hệ số tương đồng di truyền và được biểu hiện trên biểu đồ quan hệ di