Tách chiết DNA tổng số của bạch đàn

Một phần của tài liệu Đánh giá đa dạng di truyền của một số mẫu bạch đàn trắng có khả năng kháng bệnh đốm lá khác nhau bằng chỉ thị phân tử RAPD (Trang 35 - 36)

Tách chiết và tinh sạch DNA các mẫu bạch đàn theo phương pháp của Grattapaglia và Sederoff (1994).

Quy trình tách chiết

+ Nghiền nhanh 0.2g lá bằng cối chầy sứ trong nitơ lỏng cho đến khi tạo thành bột thật mịn, sau đó chuyển ngay vào ống eppendorf 2ml, giữ trong đá;

+ Bổ sung 1ml đệm rửa, lắc mạnh trong 40 giây ly tâm (14000 vòng/phút, 40C, 7 phút);

+ Loại dịch nổi và lặp lại bước 2-3 từ 1 đến 2 lần;

+ Bổ sung 800 µl chloroform/isoamyl alcohol (24:1) vào mẫu, lắc đều trong thời gian 10 phút;

+ Ly tâm với tốc độ 14000 vòng/phút trong thời gian 10-15 phút ở 40C (tùy từng loại mẫu, làm sao cho phần lặng cắn xuống);

+ Dùng pipet chuyển dịch nổi sang ống eppendorf 2ml;

+ Bổ sung 1 thể tích tương đương Isopropanol (lạnh) và đảo nhẹ, giữ mẫu trong đá 10 phút;

+ Ly tâm 14000 vòng/phút trong thời gian 10-15 phút ở 40C;

+ Loại dịch nổi, rửa DNA bằng cách thêm 500 µl cồn 80%, ly tâm 14000 vòng/phút trong thời gian 4 phút ở 40C (bước này thực hiện 2 lần), sau đó nhẹ nhàng loại bỏ ethanol (tránh để các cuộn DNA rơi ra ngoài);

+ Làm khô DNA bằng quạt gió, máy hút chân không; + Hòa tan trong 200 µl TE;

+ Sau khi DNA được hòa tan thì bổ sung 3 µl RNase (10mg/ml). Giữ sản phẩm ở 370C trong thời gian 2 giờ;

+ Cho vào 200 µl chloroform/isoamyl alcohol (24:1), đảo nhẹ (hỗn hợp được phân thành 2 lớp, lớp trên có chứa DNA), ly tâm 14000 vòng/phút trong thời gian 5 phút ở 40C;

+ Chuyển pha trên sang ống eppendorf mới và bổ sung 200 µl CH3COONa 3M, cho tiếp 450 µl ethanol lạnh 100% vào, lắc nhẹ và giữ sản phẩm trong đá 30 phút;

+ Ly tâm 14000 vòng/phút trong thời gian 10-15 phút ở 40C;

+ Đổ phần dịch nổi, rửa DNA bằng 400 µl ethanol 80% hai lần. Sau mỗi lần rửa, ly tâm với tốc độ 14000 vòng/phút trong thời gian 6 phút, sau đó loại bỏ ethanol nhẹ nhàng (tránh để các cuộn DNA rơi ra ngoài);

+ Làm khô DNA bằng quạt gió hoặc hút chân không;

+ Bổ sung 100 µl TE vào sản phẩm để hòa tan DNA và giữ ở 40C; + Điện di kiểm tra DNA tổng số trên gel agarose 1% và đo OD.

Một phần của tài liệu Đánh giá đa dạng di truyền của một số mẫu bạch đàn trắng có khả năng kháng bệnh đốm lá khác nhau bằng chỉ thị phân tử RAPD (Trang 35 - 36)

Tải bản đầy đủ (DOC)

(71 trang)
w