Đánh giá sự đa dạng đi truyền của một số mẫu đậu đen (Vigna cylindrica) địa phương trồng tại tỉnh Bắc Giang bằng chỉ thị phân tử RAPD

Hệ số giống nhau và khác nhau và các phân đoạn DNA đặc trưng của các mẫu đậu đen nghiên cứu .... Hiện nay, các nhà khoa học đã sử dụng nhiều phương pháp mới trong nghiên cứu sự đa dạng d

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

DƯƠNG VĂN HẠNH

ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ

MẪU ĐẬU ĐEN (Vigna cylindrica) ĐỊA PHƯƠNG TRỒNG

TẠI TỈNH BẮC GIANG BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ RAPD

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN – 2013

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

DƯƠNG VĂN HẠNH

ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ

MẪU ĐẬU ĐEN (Vigna cylindrica) ĐỊA PHƯƠNG TRỒNG

TẠI TỈNH BẮC GIANG BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ RAPD

Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC

Mã số: 60.42.01.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học : GS.TS Chu Hoàng Mậu

THÁI NGUYÊN – 2013

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa có ai công bố trong một công trình nào khác

Tác giả

Dương Văn Hạnh

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS Chu Hoàng Mậu đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh, KTV Lê Đức Huấn và các các cán bộ phòng thí nghiệm Sinh học, khoa Khoa học sự sống, trường Đại học khoa học đã tạo điều kiện giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong thời gian làm thực nghiệm

Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô giáo Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại, cảm ơn các thầy cô và cán bộ Khoa Sinh – KTNN, trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành bản luận văn thạc sĩ

Tôi xin cảm ơn sự động viên, khích lệ của gia đình, bạn bè và đồng nghiệp trong suốt thời gian làm luận văn

Tác giả

Dương Văn Hạnh

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

DNA Axit deoxyribonucleic

AFLP Fragment Length Polymorphism ( Sự đa hình chiều dài các phân đoạnADN được khuếch đại)

ASTT Áp suất thẩm thấu

EDTA Ethylene Diamin Tetraaxetic Acid

PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)

RAPD Random Amplified Polymorphism DNA (Phân tích ADN đa hình được nhân bản ngẫu nhiên)

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Sự đa hình chiều dài cácphân đoạn ADN cắt hạn chế)

SSR Simple Sequence Repeats

TBE Tris - Boric acid - EDTA

TAE Tris - Acetate - EDTA

Tris Trioxymetylaminometan

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Những chữ viết tắt iii

Mục lục iv

Danh mục các bảng v

Danh mục các hình vi

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2

2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Cây đậu đen 3

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm nông sinh học của cây đậu đen 3

1.1.3 Thành phần hoá sinh của hạt đậu đen 9

1.1.4 Vị trí, tầm quan trọng của cây đậu đen 11

1.2 Ngiên cứu tính đa dạng và mối quan hệ di truyền ở thực vật 17

1.2.1 Một số kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích quan hệ di truyền ở thực vật 17

1.2.1.1 Kỹ thuật RAPD 17

1.2.1.2 Kỹ thuật AFLP 19

1.2.1.3 Kỹ thuật RFLP 20

1.2.1.4 Kỹ thuật SSR 20

1.2.2 Sử dụng kỹ thuật RAPD trong nghiên cứu sự đa dạng và mối quan hệ di truyền ở thực vật 21

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Vật liệu 23

2.1.1 Vật liệu thực vật 23

2.1.2 Hoá chất và thiết bị 24

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 25

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.2.1 Phương pháp sinh học phân tử 25

2.2.1.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 25

2.2.1.2 Phương pháp xác định hàm lượng và độ tinh sạch DNA tổng số 26

2.2.1.3 Phương pháp RAPD 26

2.2.1.4 Phân tích số liệu RAPD 28

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái, kích thước, khối lượng 28

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Đặc điểm hình thái , kích thước và khối lương 1000 hạt của các mẫu đậu đen nghiên cứu 29

3.2 Phân tích sự đa dạng trong hệ gen của các mẫu đậu đen bằng kỹ thuật RAPD 31

3.2.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số từ lá đậu đen 31

3.2.2 Kết quả nhân bản các phân đoạn DNA bằng kĩ thuật RAPD 32

3.3 Phan tích ính đa dạng và khoảng cách di truyền của các mẫu đậu đen nghiên cứu 43

3.3.1 Hệ số giống nhau và khác nhau và các phân đoạn DNA đặc trưng của các mẫu đậu đen nghiên cứu 43

3.3.2 Mối quan hệ và khoảng cách di truyền giữa các mẫu đậu đen dựa trên phân tích RAPD 45

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47

1 Kết luận 47

2 Đề nghị 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

1 Tài liệu tham khảo tiếng Việt 48

2 Tài liệu tham khảo tiếng Anh 49

3 Các trang Web 50

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1.Thành phần dinh dưỡng của đậu đen đã nấu chín trong 1 cốc đậu đen

tương đương với 172g 10

Bảng 2.1 Nguồn gốc các mẫu đậu đen nghiên cứu 23

Bảng 2.2 Trình tự nucleotide của 12 mồi sử dụng trong nghiên cứu 26

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng RAPD 27

Bảng 2.4 Chu trình nhiệt của phản ứng RAPD 27

Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái, kích thước và khối lượng của 8 mẫu đậu đen 29 Bảng 3.2 Tỷ lệ phân đoạn đa hình khi sử dụng 12 mồi RAPD 33

Bảng 3.3 Hàm lượng thông tin đa hình (PIC) của các mồi ngẫu nhiên trong phản ứng RAPD khi nhân bản DNA của 8 mẫu đậu đen địa phương 35

Bảng 3.4 Hệ số giống nhau và khác nhau của 8 mẫu đậu đen nghiên cứu 44

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang Hình 1.1 Cây đậu đen 4

Hình 2.1 Hình ảnh hạt của các mẫu đậu đen nghiên cứu 24

Hình 3.1 Ảnh điện di DNA tổng số của 8 mẫu đậu đen nghiên cứu 31

Hình 3.2 Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M2 của 8 mẫu đậu đen 36

Hình 3.3 Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M3 của 8 mẫu đậu đen 37

Hình 3.4 Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M5 của 8 mẫu đậu đen 38

Hình 3.5 Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M7 của 8 mẫu đậu đen 40

Hình 3.6 Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M11 của 8 mẫu đậu đen 42

Hình 3.7 Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M12 của 8 mẫu đậu đen 43

Hình 3.8 Sơ đồ về mối quan hệ di truyền của 8 mẫu đậu đen trên cơ sở phân tích RAPD với 12 mồi ngẫu nhiên 45

Nhóm I Nhóm II

P I

P II

Nhóm I Nhóm II

P I

P II

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Đậu đen (Vigna cylindrica) là cây trồng cạn, ngắn ngày có giá trị kinh tế

cao Khó có thể có tìm thấy một cây trồng nào có tác dụng nhiều mặt như cây đậu đen Sản phẩm của nó làm thực phẩm cho con người, thức ăn cho gia súc nguyên liệu cho công nghiệp, hàng xuất khẩu, đặc biệt là dùng làm thuốc chữa bệnh, gần đây còn có khả năng chống ung thư và là cây cải tạo đất tốt Vì thế cây đậu đen có vai trò hết sức quan trọng trong nền kinh tế và y học Hiện nay,

cả nước đã có nhiều nơi sản xuất đậu đen, đặc biệt là ở các vùng trung du miền núi phía Bắc, tuy nhiên chưa hình thành được các vùng chuyên canh như một

số giống đậu và cây trồng khác Các giống đậu đen ở nước ta hiện nay rất phong phú, trong đó có các giống đậu đen địa phương Đây là nguồn vật liệu quý cho công tác chọn tạo giống đậu đen phù hợp với điều kiện sản xuất của từng vùng, miền khác nhau [8]

Đánh giá sự đa dạng di truyền của các giống đậu đen địa phương tạo cơ

sở cho công tác chọn tạo giống đang được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Hiện nay, các nhà khoa học đã sử dụng nhiều phương pháp mới trong nghiên cứu sự đa dạng di truyền của các giống cây trồng nói chung và của cây

họ đậu nói riêng như RAPD, RFLP, AFLP, SSR, STS, Các phương pháp này không những phát huy hiệu quả mà còn khắc phục nhược điểm của các phương pháp truyền thống bởi hiệu quả sàng lọc cao, tiết kiệm thời gian và tin cậy Trong những năm gần đây nhiều công trình nghiên cứu sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để phân tích sự đa dạng di truyền của cây họ đậu đã được công bố Chu Hoàng Mậu và đtg (2002) đã đánh giá hệ gen của một số dòng đậu tương đột biến bằng kỹ thuật phân tích đa hình của DNA được nhân bản ngẫu nhiên”, Vũ Thanh Trà và Trần Thị Phương Liên (2006) nghiên cứu sự đa dạng

di truyền của một số giống đậu tương địa phương có phản ứng khác nhau với

bệnh gỉ sắt bằng chỉ thị SSR Năm 2002, Coulibaly và đtg thuộc Đại học

California (Hoa Kỳ) đã sử dụng kỹ thuật AFLP phân tích tính đa dạng di truyền

của cây Đậu đũa (Vigna unguiculata L Walp) cho thấy sự khác nhau về kiểu

gen giữa các loài hoang dã và các giống đậu thuần hoá Năm 2010, Vijaykumar

và đtg phân tích sự phát sinh đa dạng loài của Vigna subgenus đã xác lập được bằng chứng về lai tạo giữa các phân loài Vigna unguiculata Nhiều công trình

của các tác giả khác ở Trung Quốc, Hoa Kỳ, Ấn Độ, Nhật Bản đã đề cập đến tính đa dạng di truyền của cây họ đậu bằng các chỉ thị SSR, SNP, ITS, tuy nhiên đối với cây đậu đen nghiên cứu sự đa dạng di truyền bằng kỹ thuật sinh học phân tử mới chỉ được bắt đầu

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi đã lựa chọn và tiến hành đề tài

luận văn thạc sĩ là: “Đánh giá sự đa dạng di truyền của một số mẫu đậu đen

(Vigna cylindrica) địa phương trồng tại tỉnh Bắc Giang bằng chỉ thị phân

tử RAPD”

Xác định được sự sai khác trong hệ gen và mối quan hệ di truyền của một

số mẫu giống đậu đen địa phương trồng tại tỉnh Bắc Giang bằng chỉ thị phân tử RAPD

3.1 Phân tích sự đa dạng của một số đặc điểm hình thái, khối lượng và một số chỉ tiêu của các mẫu đậu đen nghiên cứu

3.2 Sử dụng kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) để khuếch đại các phân đoạn DNA với các mồi ngẫu nhiên có kích thước 10 nucleotide

3.3 Xác định hệ số giống nhau và hệ số sai khác trong hệ gen của các mẫu đậu đen nghiên cứu

3.4 Thiết lập sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ và khoảng cách di truyền của

các mẫu đậu đen nghiên cứu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CÂY ĐẬU ĐEN

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại

Theo từ điển thực phẩm, cây đậu đen có nguồn gốc ở Phi châu, được trồng phổ biến ở các vùng nóng của Cựu lục địa và Tân lục địa Sau đó được truyền bá vào châu Âu và châu Á, Châu Mỹ Hiện nay cây đậu đen được trồng nhiều ở các nước Châu Phi, châu Á đặc biệt các nước Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn quốc và một số nước Đông Nam Á như Thái lan, Malaisia, Lào, Campuchia Ở nước ta, đậu đen được trồng phổ biến từ Nghệ An vào tới Ðắc Lắc, Khánh Hoà, Lâm Ðồng, Bến Tre, đặc biệt là khu vực trung du miền núi phía Bắc [28]

Đậu đen (danh pháp hai phần: Vigna cylindrica Skeels, thuộc chi (Vigna), thuộc phân họ Đậu (Faboideae), họ (Fabaceae), bộ (Fabales), giới (Plantae) Có tên thuốc theo Đông y là ô đậu, hắc đại đậu, hương xị [25]

Do xuất phát từ những yêu cầu, căn cứ và tiêu chí phân loại khác nhau nên cũng có nhiều cách phân loại khác nhau Nhưng đến nay, hệ thống phân loại căn cứ vào đặc điểm về hình thái, phân bố địa lý và số lượng nhiễm sắc thể được nhiều người sử dụng

1.1.2 Đặc điểm nông sinh học của cây đậu đen

Cây đậu đen là cây trồng cạn thu hạt, gồm các bộ phận chính: rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt

Rễ đậu đen

Rễ cây đậu đen có rễ chính và rễ phụ Rễ chính có thể ăn sâu 20 - 45cm và

có thể trên 1m Trên rễ chính mọc ra nhiều rễ phụ, rễ phụ cấp 2, cấp 3 tập trung nhiều ở tầng đất 7 - 8cm rộng 30 - 40cm2 Trên rễ chính và rễ phụ có nhiều nốt sần Bộ rễ phân bố nông sâu, rộng hẹp, số lượng nốt sần ít hay nhiều phụ thuộc

vào giống, đất đai, khí hậu và kỹ thuật trồng

Hình 1.1 Cây đậu đen

Quá trình phát triển của bộ rễ có thể phân ra làm 2 thời kỳ: (i) Ở thời kỳ

thứ nhất, lớp rễ đầu tiên được phát triển, rễ cái và rễ phụ đầu tiên phát triển

mạnh kéo dài ra và sinh nhiều rễ con Thời kỳ này thường kéo dài từ 30 - 40

ngày sau mọc (ii) Ở thời kỳ thứ hai, lớp rễ đầu tiên phát triển chậm dần, rễ con không nhú ra nữa, thậm chí có một số rễ con rụng đi Lúc này gốc thân gần cổ

rễ các rễ phụ nhỏ kéo dài ra và phát triển cho tới khi gần thu hoạch Số lượng

có thể 30 - 40 rễ phụ ăn ở phía gần mặt đất Lớp rễ này có nhiệm vụ cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng cho sự phát triển của thân, lá và làm quả Trong kỹ thuật trồng nên chú ý thời kỳ này, cần vun đất sao cho lớp rễ này phát triển mạnh Một đặc điểm hết sức quan trọng cần lưu ý là trên bộ rễ của cây đậu đen

có rất nhiều nốt sần Đó là các u bướu nhỏ bám vào các rễ Nốt sần là kết quả

cộng sinh của một số loại vi sinh vật có tên khoa học là Rhizobium Japonicum

với rễ cây đậu đen [4] Vi sinh vật thường có dạng hình cầu hoặc hình que

Trong một nốt sần có khoảng 3 - 4 tỷ vi sinh vật, mà ta chỉ có thể nhìn thấy chúng qua kính hiển vi phóng đại 600 - 1000 lần

Nốt sần ở rễ đậu đen thường tập trung ở tầng đất 0 - 15cm, từ 20 - 30cm

nốt sần ít dần và nếu sâu hơn nữa thì có ít hoặc không có Nốt sần đóng vai trò chính trong quá trình cố định đạm khí trời cung cấp cho cây Lượng đạm cung cấp cho cây khá lớn khoảng 30 - 60 kgN/ha Nốt sần có thể dài l cm, đường kính 5 - 6 mm, mới hình thành có màu trắng sữa, khi nốt sần tốt nhất có màu

hồng (màu globulin có cấu tạo gần giống hemoglobin trong máu có Fe) [4]

Thân đậu đen

Thân cây đậu đen thuộc thân thảo, có hình tròn, trên thân không có lông Thân khi còn non có màu xanh tím hoặc hơi trắng khi về già chuyển sang màu nâu nhạt, màu sắc của thân khi còn non có liên quan chặt chẽ với màu sắc của hoa sau này Thân có trung bình 14 - 18 lóng, các lóng ở phía dưới thường ngắn, các lóng ở phía trên thường dài (vì những lóng phía trên phát triển từ ngày 35 - 40 trở đi vào lúc cây đang sinh trưởng nhanh nên lóng thường dài) Tuỳ theo giống và thời vụ gieo mà chiều dài lóng có sự khác nhau thường biến động từ 3 - 10 cm Chiều dài của lóng góp phần quyết định chiều cao của thân Thân cây đậu tương thường cao từ 0,2 m – 0,8 m Cây thường đứng, có khi leo Những giống thân to thường là thân đứng và có nhiều hạt và chống được gió bão Toàn thân nhẵn không có lông [27]

Thân đậu đen có khả năng phân cành ngay từ nách lá đơn hoặc kép Những cành trên thân chính phân ra gọi là cành cấp 1, trên cành cấp 1 có thể phân ra cành cấp 2 Số lượng cành trên một cây nhiều hay ít thay đổi theo giống, thời vụ, mật độ gieo trồng và điều kiện canh tác Trung bình trên 1 cây thường có 2 - 7 cành, có một số giống trong điều kiện sinh trưởng tốt có thể có trên 10 cành Thường sau mọc khoảng 20 - 25 ngày thì cây đậu đen bắt đầu phân cành Vị trí phân cành phù hợp là cao trên 20 cm, nếu thấp quá không có lợi cho việc cơ giới hoá Giống đậu đen có góc độ phân cành càng hẹp thì càng tốt cho việc tăng mật độ [4]

Lá đậu đen

Lá đậu đen có 3 loại: Lá mầm, lá nguyên, lá kép Lá mầm mới mọc có

màu vàng hơi trắng hay xanh lục, khi tiếp xúc với ánh sáng thì chuyển sang

màu xanh Hạt giống to thì lá mầm chứa nhiều dinh dưỡng nuôi cây mầm, khi hết chất dinh dưỡng lá mầm khô héo đi, cho nên trong kỹ thuật trồng đậu đen

nên làm đất tơi nhỏ và chọn hạt to cây sẽ mọc khoẻ, sinh trưởng tốt Lá nguyên (lá đơn) xuất hiện sau khi cây mọc từ 3- 5 ngày và mọc phía trên lá mầm Lá

đơn mọc đối xứng nhau Lá đơn to màu xanh bóng là biểu hiện cây sinh trưởng tốt Lá đơn to xanh đậm biểu hiện của một giống có khả năng chịu rét Lá đơn nhọn gợn sóng là biểu hiện cây sinh trưởng không bình thường [8] Lá kép gồm

3 lá chét, mọc so le, có lá kèm nhỏ, lá chét giữa to và dài hơn các lá chét bên,

các lá chét bên có gốc không cân lá kép thường có màu xanh tươi khi già biến

thành màu vàng nâu Cũng có giống khi quả chín lá vẫn giữ được màu xanh, những giống này thích hợp trồng làm thức ăn gia súc Phần lớn trên lá không có lông tơ Lá có nhiều hình dạng khác nhau tuỳ theo giống, những giống lá nhỏ

và dài chịu hạn khoẻ nhưng thường cho năng suất thấp Những giống lá to chống chịu hạn kém nhưng thường cho năng suất cao hơn Nếu 2 lá kép đầu to

và dày thường biểu hiện giống có khả năng chống chịu rét Số lượng lá kép nhiều hay ít, diện tích lá to hay nhỏ chi phối rất lớn đến năng suất và phụ thuộc vào thời vụ gieo trồng Các lá nằm cạnh chùm hoa nào giữ vai trò chủ chủ yếu cung cấp dinh dưỡng cho chùm hoa ấy Nếu vì điều kiện nào đó làm cho lá bị

úa vàng thì quả ở vị trí đó thường bị rụng hoặc lép Các nhà chọn giống đậu đen đưa ra cơ sở để nâng cao năng suất đậu đen tăng cường quá trình quang hợp và muốn quang hợp với hiệu quả cao thì phải chọn những cây có bộ lá nhỏ, dày, thế lá đứng Số lá nhiều to khoẻ nhất vào thời kỳ đang ra hoa rộ Khi phiến

lá phát triển to, rộng, mỏng, phẳng, có màu xanh tươi là biểu hiện cây sinh trưởng khoẻ có khả năng cho năng suất cao

Hoa đậu đen

Hoa đậu đen nhỏ, không hương vị, thuộc loại cánh bướm Màu sắc của

hoa thay đổi tuỳ theo giống và thường có màu tím, tím nhạt hoặc trắng Đa phần các giống có hoa màu tím và tím nhạt dài khoảng 5 - 6mm Hoa phát sinh

ở nách lá, đầu cành và đầu thân Hoa mọc thành từng chùm, Chùm hoa dài 20 30cm, mỗi chùm hoa thường có 3 - 5 hoa Hoa đậu đen ra nhiều nhưng tỷ lệ rụng rất cao khoảng 30% có khi lên tới 80% [27]

-Hoa đậu đen thuộc loại hoa đồng chu lưỡng tính trong hoa có nhị và nhụy, mỗi hoa gồm 5 lá đài, 5 cánh hoa có 10 nhị và 1 nhụy

- Đài hoa có màu xanh

- Cánh hoa: Một cánh to gọi là cánh cờ, 2 cánh bướm và 2 cánh thìa

- Nhị đực: 9 nhị đực cuốn thành ống ôm lấy vòi nhuy cái và 1 nhị riêng lẻ

- Nhụy cái: Bầu thượng, tử phòng một ngăn có 1- 4 tâm bì (noãn) nên thường

quả đậu đen có 8 - 10 hạt

Các cánh hoa vươn ra khỏi lá đài từ ngày hôm trước và việc thụ phấn xẩy

ra vào sáng ngày hôm sau lúc 8 - 9 giờ sáng trước khi nụ hoặc hoa chưa nở hoàn toàn Mùa hè hoa thường nở sớm hơn mùa đông và thời gian nở hoa rất ngắn sáng nở chiều tàn Hoa đậu đen thường thụ phấn trước khi hoa nở và là cây tự thụ phấn, tỷ lệ giao phấn rất thấp chiếm trung bình 0,5 - 1%

Thời gian bắt đầu ra hoa sớm hay muộn, dài hay ngắn tuỳ thuộc vào giống

và thời tiết khác nhau Giống chín sớm sau mọc trên dưới 30 ngày đã ra hoa và giống chín muộn 45 - 50 ngày mới ra hoa Thời gian ra hoa dài hay ngắn theo giống và theo thời vụ Có những giống thời gian ra hoa chỉ kéo dài 10 - 15 ngày Kết quả nghiên cứu cho thấy thời kỳ hoa rộ thường từ ngày thứ 5 đến ngày thứ 10 sau khi hoa bắt đầu nở Hoa trong đợt rộ mới tạo quả nhiều, còn trước và sau đợt hoa rộ thì tỷ lệ đậu quả thấp Điều kiện thích hợp cho sự nở hoa là ở nhiệt độ 25 - 280C, ẩm độ không khí 75 - 80%, ẩm độ đất 70 - 80% Căn cứ vào phương thức ra hoa người ta chia các giống đậu đen làm 2 nhóm:

Nhóm ra hoa hữu hạn: Thuộc những giống sinh trưởng hữu hạn, hướng

ra hoa theo trình tự từ trên xuống dưới và từ ngoài vào trong Những giống này

thường cây thấp ra hoa tập trung, quả và hạt đồng đều

Nhóm ra hoa vô hạn: Thuộc những giống sinh trưởng vô hạn, có hướng

ra hoa theo trình tự từ dưới lên trên và từ trong ra ngoài Những giống này thường ra hoa rất phân tán, quả chín không tập trung và phẩm chất hạt không đồng đều Trong thực tế, những giống hoa tập trung nếu gặp điều kiện bất thuận, hoa sẽ rụng nhiều nên gây thất thu nặng Còn những giống thời gian ra hoa dài tuy quả chín không tập trung nhưng nếu bị rụng vào một đợt thì hoa sẽ

ra tiếp đợt sau nên năng suất không giảm nhiều Một hoa có từ 1600 - 6500 hạt phấn tuỳ theo giống khác nhau, giống hạt to thì có bao phấn to và nhiều hạt phấn Hạt phấn thường hình tròn, số lượng và kích thước hạt phấn tuỳ giống khác nhau, giống hạt to thường có hạt phấn to và nhiều hơn so với giống có hạt nhỏ Hạt phấn nảy mầm tốt trong điều kiện nhiệt độ 18 - 250

C

Quả và hạt

Số quả biến động từ 2 đến 5 quả ở mỗi chùm hoa Một quả chứa từ 8 tới

16 hạt, nhưng hầu hết các giống quả thường từ 8 đến 10 hạt Quả đậu đen thẳng hay nghiêng, có chiều dài từ 7 tới 13 cm hoặc hơn Quả có màu sắc biến động

từ xanh trắng tới xanh đậm, nâu hoặc đen Màu sắc quả phụ thuộc vào sắc tố caroten, xanthophyll, sự có mặt của các sắc tố antocyanin Lúc quả non có màu xanh (có khả năng quang hợp do có diệp lục) khi chín có màu vàng hoặc nâu Hoa đậu đen ra nhiều nhưng tỷ lệ đậu quả thấp 20 - 30% Ví dụ trong vụ xuân 1 cây có thể có 40 hoa nhưng chỉ đậu 5 - 10 quả là cao, trên một chùm 3 - 5 hoa chỉ đậu 2 - 3 quả Những đốt ở phía gốc thường quả ít hoặc không có quả, từ đốt thứ 5 - 6 trở lên tỷ lệ đậu quả cao và quả chắc nhiều Trên cành thường từ đốt 2 - 3 trở lên mới có quả chắc Sau khi hoa nở được vài ngày thì cánh hoa héo và rụng, hoa nở đã hình thành quả và 7 - 8 ngày sau là thấy nhân quả xuất

hiện Trong 18 ngày đầu quả lớn rất nhanh sau đó chậm dần, vỏ dày lên và chuyển từ màu xanh sang màu vàng Hạt lớn nhanh trong vòng 10 - 20 ngày sau khi hình thành quả [4]

Hạt có nhiều hình dạng khác nhau: Hình tròn, hình bầu dục, tròn dẹt vv Giống có màu đen bóng giá trị thương phẩm cao Trong hạt, phôi thường chiếm 2%, 2 lá tử điệp chiếm 90% và vỏ hạt 8% tổng khối lượng hạt Hạt to nhỏ khác nhau tuỳ theo giống, khối lượng một nghìn hạt (M1000 hạt) thay đổi từ 20 - 130g trung bình từ 80g - 100g Rốn hạt của các giống khác nhau thì có màu sắc

và hình dạng khác nhau, đây là một biểu hiện đặc trưng của của các giống

1.1.3 Thành phần hoá sinh của hạt đậu đen

Thành phần hoá học: Hạt chứa 24,2% protein, 1,7% lipid; 53,3% glucid; 2,8% tro; calcium 56mg%, phosphor 354mg%, sắt 6,1mg% caroten 0,06mg%, vitamin B1 0,51mg%, vitamin B2 0,21mg%, vitamin PP 3mg% Hàm lượng các acid amin cần thiết trong đậu đen rất cao, tính theo g%: lysin 0,97% metionin 0,31%, tryptophan 0,31; phenylalanin 1,1%; alanin 1,09, valin 0,97, leucin 1,26, isoleucin 1,11, arginin 1,72; histidin 0,75 Hạt cũng chứa stigmasterol nên có thể dùng thay được đậu tương [28]

Trong số tất cả các nhóm thực phẩm thường được sử dụng trên toàn thế giới, không một nhóm nào lại có sự kết hợp tuyệt vời giữa protein và chất xơ hơn cây họ đậu, đặc biệt là đậu đen Chỉ với một cốc đậu đen (tương ứng với 172g) cũng đã cung cấp cho chúng ta tới 15 gram chất xơ (chiếm hơn một nửa nhu cầu chất xơ trung bình mỗi ngày cho một người lớn) và 15 gram protein (gần bằng một phần ba nhu cầu protein hàng ngày, tương đương với 56,7 gam thịt gà hay cá hồi) Và chúng ta sẽ không thể tìm thấy sự kết hợp này trong các loại trái cây, rau quả, ngũ cốc, thịt, các sản phẩm sữa, đồ hải sản hoặc các loại hạt khác Chính sự kết hợp đó đã giải thích tại sao đậu đen lại mang đến cho

chúng ta nhiều lợi ích đối với đường tiêu hóa, hệ thống kiểm soát lượng đường trong máu và hệ tim mạch [14]

Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng của đậu đen đã nấu chín trong 1 cốc đậu

đen tương đương với 172g Các chất dinh dưỡng Hàm lượng Nhu cầu hàng ngày(%)

khoáng chất như can-xi, sắt, magiê, mangan, đặc biệt có hàm lượng cao chất molypdenum và những sắc tố chống oxy hoá anthocyanins

Theo khuyến nghị của dinh dưỡng học, chế độ ăn nhiều đậu đen là một biện pháp tự nhiên giúp phòng chống các loại bệnh thuộc hội chứng chuyển hoá như cao huyết áp, bệnh tim, tiểu đường Giống như các loại hạt thô khác, đậu đen có hàm lượng chất xơ cao [6]

Chất xơ giúp làm chậm và giảm hấp thu mỡ qua màng ruột, đồng thời kết dính một phần muối mật để đào thải ra ngoài, qua đó góp phần làm hạ cholesterol trong máu Tác dụng tổng hợp của những hợp chất chống oxy hoá

và chất xơ có khả năng làm giảm các loại mỡ xấu LDL và triglycerides Những chất chống oxy hoá trong đậu đen còn có tác dụng kháng viêm và ngăn chặn sự oxy hoá LDL, loại chất béo có tính ổn định thấp dễ bị oxy hóa và bám vào thành mạch để tạo nên các mãng xơ vữa Chất xơ hoà tan trong nước có vai trò quan trọng trong việc làm tăng lượng phân, tăng nhu động ruột, chống táo bón, kết dính nhiều loại độc tố để thải ra ngoài, giúp giảm nguy cơ một số rối loạn ở ruột già Với tỷ lệ 24,2% chất đạm và 53,3% chất bột đường và nhiều chất xơ, đậu đen là thực phẩm tốt cho người bệnh tiểu đường [6]

1.1.4 Vị trí, tầm quan trọng của cây đậu đen

*Giá trị về mặt thực phẩm

Trong hạt đậu đen có khá nhiều loại vitamin, đặc biệt là hàm lượng vitamin B1

và B2 ngoài ra còn có các loại vitamin PP, A, E, K, D, C,v.v Đặc biệt trong hạt đậu đen đang nảy mầm hàm lượng vitamin tăng lên nhiều, đặc biệt là vitamin C Phân tích thành phần sinh hoá cho thấy trong hạt đậu đen đang nảy mầm, ngoài hàm lượng vitamin C cao, còn có các thành phần khác như: vitamin PP, và nhiều chất khoáng khác như Ca, P, Fe v.v Hiện nay, từ hạt đậu đen người ta đã chế biến ra được nhiều sản phẩm khác nhau, trong đó có hơn 300 loại làm thực phẩm được chế biến bằng cả phương pháp cổ truyền, thủ công và hiện đại dưới dạng tươi, khô vv như làm chè đỗ đen, xôi vv đến các

sản phẩm cao cấp khác Đậu đen còn là vị thuốc để chữa bệnh, đậu đen là thức

ăn tốt cho những người bị bệnh đái đường, thấp khớp, thần kinh suy nhược

Hạt đậu đen là nguồn dinh dưỡng rất phong phú, ngon mà tương đối lại

rẻ tiền, cung cấp đủ các loại amino acid thiết yếu mà cơ thể cần Đậu đen có nhiều calci, cho nên các vị tu hành, người ăn chay có thể sống lành mạnh chỉ với đậu hũ và các loại sản phẩm khác của đậu đen Nói chung, đậu đen có lượng đạm chất cao hơn các các loại ngũ cốc khác từ hai đến năm lần

Hạt đậu đen có nhiều sinh tố nhóm B, nhiều sắt, kali, rất nhiều chất xơ

Đa số hạt đậu đều có rất ít chất béo và năng lượng, ngoại trừ đậu đen lại có nhiều chất béo tốt ở dạng chưa bão hòa Đậu đen có ít năng lượng nhưng chứa nhiều nước [28]

Một trăm gram đậu đen nấu chín cung cấp khoảng 100 - 130 calo và 7 gram chất đạm, tương đương với số đạm trong 30 gram thịt động vật Đậu nẩy mầm

có nhiều đạm hơn đậu nguyên hạt Khi ăn chung đậu đen với các loại hạt, đạm của đậu đen có phẩm chất tương đương với đạm động vật

Người Bắc Mỹ và người châu Âu ít chú ý đến các loại đậu đen vì phải mất nhiều thời gian để nấu hoặc phải ngâm đậu trước khi nấu Để tiết kiệm thì giờ, dùng đậu chế biến nấu sẵn đựng trong hộp rất tiện lợi: chỉ cần đổ bớt nước mặn trong đậu hoặc rửa đậu cho bớt mặn rồi nấu

Nhưng người Nam Mỹ và Á Châu xem các loại hạt đậu đen là một thành phần quan trọng của lương thực

Ở Châu Mỹ La Tinh, từ Mexico xuống đến Trung Mỹ, Nam Mỹ, đâu đâu cũng thấy có đậu lăng (lentil), đậu đen và đậu đỏ (black and red beans) trong các bữa ăn

Ở Ấn Độ, đậu được ăn trộn với gạo và rất phổ biến

Nhật Bản có loại một số loại đậu trong đó có đậu đen được ăn với cơm

Ở Trung Hoa và Nhật Bản, Việt Nam đậu đen rất thông dụng trong việc nấu xôi, chè.Hạt đậu đen nấu chín có thể ăn khi còn nóng hay để nguôi

Có thể nấu đậu đen với thịt, cá hoặc với các loại rau khác Đậu đen nấu chín cũng có thể cho thêm gia vị, nghiền nát rồi quệt vào bánh mì kẹp để ăn [2]

Đậu tươi không cần nhiều thời gian để nấu, nhưng khi phơi khô thì cần ninh nấu lâu hơn Để rút ngắn thời gian nấu, ta có thể ngâm đậu trong nước nóng vài giờ cho đậu thấm nước và mềm hơn Nước ngâm đậu có thể dùng để nấu món ăn cho thêm hương vị

*Giá trị về mặt công nghiệp

Đậu đen là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp khác nhau như: chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt lỏng, dầu bôi trơn trong ngành hàng không, nhưng chủ yếu đậu đen được dùng

để ép dầu Hiện nay trên thế giới đậu đen là cây chỉ đứng sau đậu tương và đậu xanh về cung cấp nguyên liệu cho ép dầu Đặc điểm của dầu đậu đen: khô chậm, chỉ số iốt cao : 120 - 127 ; ngưng tụ ở nhiệt độ : - 15 đến - 180c Từ dầu này người ta chế ra hàng trăm sản phẩm công nghiệp khác như: làm nến, xà phòng, ni lông v.v

*Giá trị về mặt nông nghiệp

Đậu đen là nguồn thức ăn tốt cho gia súc 1 kg hạt đậu đen tương đương

với 1,2 đơn vị thức ăn chăn nuôi Toàn cây đậu đen thân, lá, quả, hạt có hàm lượng đạm khá cao cho nên các sản phẩm phụ như thân lá tươi có thể làm thức

ăn cho gia súc rất tốt, hoặc nghiền khô làm thức ăn tổng hợp của gia súc Sản phẩm phụ công nghiệp như khô dầu có thành phần dinh dưỡng khá cao: N: 6,2%, P2O5: 0,7%, K2O: 2,4%, vì thế làm thức ăn cho gia súc rất tốt [17]

Đậu đen là cây luân canh cải tạo đất tốt 1 ha trồng đậu đen nếu sinh

trưởng phát triển tốt để lại trong đất từ 30 - 60 kg N Trong hệ thống luân canh, nếu bố trí cây đậu đen vào cơ cấu cây trồng hợp lý sẽ có tác dụng tốt đối với cây trồng sau, góp phần tăng năng suất cả hệ thống cây trồng mà giảm chi phí cho việc bón N Thân lá đậu đen dùng bón ruộng thay phân hữu cơ rất tốt bởi hàm lượng N trong thân chiếm 0,05%, trong lá: 0,19%

*Giá trị về mặt y học

Ngoài các thành phần hóa học đã nêu, họ đậu này còn có thêm 2 loại flavonoid đó là kaempferol và quercetin và nhiều axit hydroxycinnamic như axit ferulic, sinapic, chlorogenic, và rất nhiều triterpenoid Tất cả các flavonoid này được chứng minh là các chất chống oxy hóa và chống viêm rất tốt cho tim mạch Khi các mạch máu trong tình trạng stress oxy hóa quá mức và mãn tính (gây ra bởi các dạng oxy phản ứng) hoặc viêm thì nguy cơ phát triển bệnh là rất cao Ngoài flavonoid, các chất chống oxy hóa khác trong đậu đen như kẽm và mangan cũng góp phần ngăn chặn tình trạng stress oxy hóa và sự viêm này

Ngoài ra trong đậu đen còn có chứa rất nhiều folate và magie có tác dụng tốt cho việc hỗ trợ tim mạch Một cốc đậu đen cung cấp khoảng 64% nhu cầu folate; 30% nhu cầu magie hàng ngày và hơn nữa là cung cấp khoảng 180 mg axit béo omega-3 dưới dạng axit alpha-linolenic (ALA) cho cơ thể

Bên cạnh đó, với khả năng ngăn chặn tình trạng stress oxy hóa và viêm, đậu đen còn được cho là có thể giảm nguy cơ mắc các bệnh ung thư như ung thư vú, ung thư gan, nhưng hiệu quả nhất vẫn là ung thư ruột kết

Như vậy có thể khảng định việc thường xuyên bổ sung đậu đen vào chế

độ ăn rất tốt cho sức khỏe Lượng đậu đen nên bổ sung khoảng 1- 2 cốc/ngày

và với tần suất khoảng 4 ngày/tuần

Có rất nhiều sách viết về tác dụng chữa bệnh của đậu đen Sách Bản thảo Đường tân tụ nói rằng đậu đen chữa được thủy thũng Sách Bản thảo Thập di nói rằng đậu đen còn chữa được chứng phong tê, ôn bổ, nếu ăn lâu ngày thì đẹp nhan sắc.Bản thảo Cương mục cho rằng, nước đậu đen có thể bổ thận, giải được độc của các dược liệu bổ thận như hà thủ ô, ba kích…[26]

Theo nghiên cứu ở Ý và Thụy Sĩ cho thấy là, bệnh nhân có cholesterol cao, mà ăn nhiều chất đạm từ đậu đen thay thế cho thịt cá, thì mức cholesterol của họ giảm xuống đến 31% Kết quả này xem ra còn tốt hơn tác dụng của các loại thuốc giảm cholesterol đắt tiền bán trên thị trường.[ 26]

Bác sĩ James Anderson thuộc Đại học Kentucky, khuyên bệnh nhân mỗi ngày ăn một cốc đậu đen nấu chín để hạ cholesterol

Cũng theo Anderson, ăn đậu đen thường xuyên giảm nhu cầu Insulin để chữa bệnh tiểu đường, vì đậu làm đường trong máu tăng lên rất chậm.[ 26]

Gần đây các nhà khoa học lại mới tìm ra một tác dụng vô cùng bổ ích của các hạt đậu, trong đó có đậu đen, đó là khả năng chống ung thư [14] Đậu

có chứa chất acid phytic, một chất chống oxy hóa rất mạnh có thể chận đứng tiến trình ung thư hóa của tế bào

Ngoài ra, khảo cứu trên một số động vật trong phòng thí nghiệm cho thấy đậu, nhất là đậu “pea” và đậu lăng “lentil” và đậu đen có chứa chất ức chế protease là chất có khả năng phòng chống ung thư da, vú và gan ở động vật Thử nghiệm ở người cũng thấy tác dụng tương tự về phòng chống ung thư vú

và nhiếp hộ tuyến

Chuyên gia về ung thư Anne Kennedy cho chuột ăn một hóa chất gây ung thư, nhưng khi chất ức chế protease được bôi vào miệng chuột thì ung thư không xẩy ra

Đậu giúp đại tiện đều đặn, dễ dàng vì phẩn to hơn, mềm hơn, từ đó giảm thiểu được các nguy cơ ung thư ruột già và trực tràng Đó là kết quả các nghiên cứu của Sharon Fleming, Đại học Berkeley, California.[ 26]

Ngoài ra đậu đen có lợi ích đối với hệ tiêu hóa trong đậu đen có chứa nhiều chất xơ không hòa tan hơn so với trong đậu lăng hoặc đậu xanh Ngoài

ra trong đậu đen còn có sự kết hợp hài hòa của các chất tạo điều kiện cho sự phát triển của vi khuẩn trong ruột kết để chúng sản sinh ra axit butyric Axit này được các tế bào lót ở mặt trong của đại tràng sử dụng để phục vụ cho các hoạt động của mình và giữ cho các chức năng của đường tiêu hóa hoạt động tốt

hơn [6]

Đậu đen có khả năng kiểm soát lượng đường trong máu do có sự kết hợp giữa protein và chất xơ có trong đậu đen và các cây họ đậu khác có ý nghĩa

quan trọng trong việc hỗ trợ cân bằng lượng đường và điều chỉnh lượng đường trong máu Chỉ với 15g chất xơ và 15g đường trong một thìa đậu đen có thể ngăn ngừa được hoàn toàn tình trạng giải phóng quá nhiều hoặc quá ít lượng đường đơn khỏi ống tiêu hóa Đối với bệnh tiểu đường type 2, các nhà khoa học đặc biệt quan tâm đến hiệu quả hạn chế enzym alpha - amylase của đậu đen Alpha-amylase là enzyme có vai trò rất quan trọng trong việc phân hủy tinh bột thành đường, nếu quá trình phân hủy này chậm thì sẽ giúp giải phóng ít đường hơn Như vậy, cộng thêm với khả năng ổn định đường huyết do sự kết hợp protein - chất xơ thì không có gì ngạc nhiên khi thấy đậu đen có trong danh sách các loại các loại thực phẩm giúp ngăn ngừa bệnh tiểu đường type 2 [6] Ngoài ra đậu đen còn có lợi ích đối với tim mạch và giải độc khá tốt

Sau đây giới thiệu một số bài thuốc chữa bệnh bằng đậu đen:

Chữa đau bụng dữ dội dùng đậu đen sao cháy, sắc với rượu uống hay sắc

với nước rồi chế thêm rượu vào uống Chữa liệt dương dùng đậu đen sao già,

đổ rượu vào ngâm, uống Chữa trúng độc cho phụ nữ mang thai, bị ngất dùng đậu đen 80g, Gừng sống 20g, sắc uống Chữa tiêu khát (đái đường) do thận hư dùng đậu đen, Thiên hoa phấn, 2 vị bằng nhau, tán nhỏ, làm viên, uống với nước sắc Đau bụng do nhiệtdùng đậu đen nấu nước cô đặc, ngậm nuốt dần.Đầu, cổ, vai cứng đờ, đau nhức dùng đậu đen 1 bát hầm nhừ, khô nước, bọc vào túi vải, đem gối đầu cỏ lúc còn ấm

Tóm lại, hạt đậu đen có giá trị rất cao về dinh dưỡng, giá trị của nó được đánh giá đồng thời cả về hàm lượng protein và lipit, trong đó hàm lượng protein dự trữ và chất lượng của chúng là yếu tố quan trọng đã quyết định vai trò và vị thế của cây đậu đen so với các cây ngũ cốc khác, đậu đen đã trở thành loài thực vật cung cấp nguồn thực phẩm quan trọng cho người và gia súc, hạt đậu đen có thể chế biến nhiều sản phẩm khác nhau, ngoài ra đậu đen còn dùng làm thuốc chữa bệnh rất tốt

và lành tính

1.2 NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG VÀ MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN

đa hình các đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên bằng việc sử dụng mồi đơn chứa trật tự nucleotide ngẫu nhiên [12] Đến nay, kỹ thuật này đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của sinh học phân tử Người ta đã sử dụng kỹ thuật này để thiết lập bản đồ di truyền, đánh giá hệ gen của giống và

sự đa dạng di truyền của tập đoàn giống [16 ]

Về nguyên lý, kỹ thuật RAPD có cơ sở là kỹ thuật PCR, nhưng sử dụng mồi ngẫu nhiên để nhân bản những đoạn DNA hoàn toàn ngẫu nhiên trong hệ gen của sinh vật

Các yếu tố cần thiết để tiến hành phản ứng RAPD bao gồm:

- DNA khuôn (DNA template) với nồng độ 5 - 50 ng trong 20 - 25 µl DNA khuôn là vật liệu khởi đầu cho phản ứng RAPD, được tách từ các mẫu: virus, vi khuẩn, tế bào thực vật, động vật… DNA có độ tinh sạch, có thể là sợi đơn, sợi đôi, mạch vòng hoặc mạch thẳng DNA khuôn được khuếch đại dưới dạng thẳng có hiệu quả hơn dạng vòng Kích thước DNA khuôn nhỏ hơn 3kb cho kết quả tốt nhất [3]

- Đoạn mồi (primer): chỉ sử dụng một mồi đó là một oligonucleotide có trật tự nucleotide ngẫu nhiên và có chiều dài 8 - 10 nucleotide (thường sử dụng mồi dài 10 nucleotide) Nhiệt độ gắn mồi trong phản ứng RAPD thấp (320

-

400C) Nồng độ mồi phải thích hợp để đảm bảo kết quả phản ứng (phù hợp với lượng DNA cần tổng hợp) tạo nên lượng sản phẩm cần thiết Nếu nồng độ

mồi quá cao có thể làm cho hiệu quả phản ứng kém chính xác, do mồi bám vào các vị trí không đặc hiệu Nếu nồng độ mồi quá thấp sẽ không đảm bảo

đủ lượng sản phẩm RAPD

- Taq-polymerase: là một enzyme quan trọng, có vai trò quyết định đến

phản ứng PCR Đây là loại enzyme chịu được nhiệt độ cao trong các loại enzyme Đặc điểm của chúng là có khả năng kéo dài mồi để tạo một sản phẩm

có chiều dài 8 - 13 kb Taq-polymerase được tách chiết từ chủng vi khuẩn ở suối nước nóng Thermus aquaticus, không bị mất hoạt tính ở nhiệt độ biến tính

DNA (92o - 950C) Taq - polymerase có hoạt tính ở dải nhiệt độ cao, tồn tại ở

nhiệt độ ủ 950C kéo dài Enzyme này có hoạt tính cao ở 720

- 800C làm cho phản ứng xảy ra nhanh, hiệu quả và chính xác [1]

- dNTP: là các nucleotide tự do được sử dụng làm nguyên liệu cho phản ứng RAPD, gồm bốn loại: dATP, dTTP, dGTP, dCTP Nồng độ dNTP mỗi loại thường dùng trong các phản ứng RAPD khoảng 50 - 200 µM Nếu nồng độ các loại dNTP quá ít thì tạo sản phẩm ít không đủ để phát hiện, ngược lại, nồng độ dNTP quá cao thì phản ứng khó thực hiện [2]

- Dung dịch đệm: là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng và hiệu quả của phản ứng Dung dịch đệm của phản ứng phải đảm bảo thành phần các chất cần thiết cho hoạt động của enzyme như: MgCl2, KCl, Tris HCl Thành phần của dung dịch đệm của phản ứng bao gồm: Tris HCl 10mM (pH = 8.3 ở nhiệt độ phòng), KCl 50mM, MgCl2 1,5mM khi ủ ở nhiệt độ phòng Nồng độ MgCl2 có thể dao động từ 0,5 - 5mM Thành phần này đóng vai trò quan trọng đến khả năng bắt cặp và gắn các mồi với mạch khuôn [1], [3]

Chu kỳ phản ứng

Phản ứng RAPD được tiến hành qua các giai đoạn sau:

- Giai đoạn biến tính DNA: Ở nhiệt độ 950C trong 30 - 60 giây làm cho các liên kết hydro giữa 2 mạch bị đứt Khi đó DNA sợi đôi tách thành 2 sợi đơn tạo điều kiện cho sự bắt cặp mồi

- Giai đoạn tiếp hợp mồi: Nhiệt độ hạ xuống 320 - 400C, mồi bám vào đầu 3’OH của mạch khuôn DNA và bắt đầu quá trình tổng hợp sợi mới

- Giai đoạn tổng hợp: Nhiệt độ được nâng lên 720C thì các đoạn mồi đã bắt cặp

với các mạch đơn sẽ được kéo dài với sự tham gia của Taq - polymerase

Một chu kỳ trên xảy ra, một đoạn DNA được nhân lên thành hai, các đoạn DNA được nhân tiếp tục được coi là mạch khuôn để tổng hợp cho chu kì sau Như vậy, sau n chu kỳ thì sẽ tạo ra 2n

các đoạn DNA giống hệt đoạn DNA

khuôn ban đầu Phản ứng RAPD có thể thực hiện 40 - 45 chu kỳ

1.2.1.2 Kỹ thuật AFLP

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism - đa hình độ dài các đoạn được nhân bản chọn lọc) là kỹ thuật kết hợp của RFLP và PCR Kỹ thuật này cho phép phát hiện một cách có chọn lọc các đoạn DNA hệ gen đã được cắt bởi enzyme giới hạn và gắn với đoạn tiếp hợp

Về nguyên tắc, kỹ thuật AFLP tương tự như kỹ thuật RAPD, chỉ có điểm khác biệt là mồi trong phản ứng AFLP gồm hai phần: phần cố định dài khoảng

15 bp chứa vị trí nhận biết của enzyme giới hạn, phần thay đổi dài khoảng 2 - 4

bp Sản phẩm PCR được điện di trên gel polyacrylamide có độ phân giải cao

Sự đa hình được xác định bởi sự có mặt hay vắng mặt của một phân đoạn DNA

Kỹ thuật AFLP có ưu điểm là phân tích đa hình di truyền trong khoảng thời gian ngắn, lượng DNA đòi hỏi ít, cho sự đa hình cao Kỹ thuật này được đánh giá là nhanh chóng và có hiệu quả trong việc xác định tính đa dạng di truyền ở cây trồng, như lúa, lạc, đậu xanh, đậu tương…[ 23 ]

1.2.1.3 Kỹ thuật RFLP

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism - đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn) là kỹ thuật sử dụng các endonuclease giới hạn cắt DNA hệ gen ở trình tự nhận biết đặc trưng tạo ra hàng loạt đoạn DNA có độ dài xác định, số lượng các đoạn phụ thuộc vào số điểm nhận biết trong hệ gen Sử dụng

kỹ thuật RFLP có thể xác định một tính trạng ở trạng thái đồng hợp hoặc dị hợp trong một cá thể Vì vậy, RFLP là một chỉ thị tin cậy trong phân tích liên kết và chọn giống Tuy nhiên, kỹ thuật này có nhược điểm là tốn kém và mất thời gian

Kỹ thuật này đòi hỏi phải có một lượng DNA lớn (50 - 200 ng từ mỗi cá thể) [12]

1.2.1.4 Kỹ thuật SSR

SSR (Simple Sequence Repeats - trình tự lặp lại đơn giản) hay còn gọi là

vi vệ tinh (microsatellites) Kỹ thuật này được Litt và Luty phát triển năm 1989 dựa trên nguyên tắc của phản ứng PCR Trong cấu trúc hệ gen của sinh vật nhân chuẩn tồn tại một loạt các trình tự nucleotide lặp lại, chúng đặc trưng cho loài SSR gồm 2 - 5 nucleotide lặp lại nhiều lần Thông thường, các SSR có mặt chủ yếu ở các vùng dị nhiễm sắc của NST, như vùng tâm động hoặc các đầu mút Chúng giữ vai trò quan trọng trong việc điều hòa hoạt động của các gen, góp phần làm tăng tính ổn định cơ học của NST trong các quá trình phân bào

và có thể chứa đựng những thông tin di truyền liên quan đến sự xác định giới tính ở cả động vật và thực vật Do sự khác nhau về số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại mà sự đa hình về độ dài của SSR được nhân bản sẽ được phát hiện sau quá trình điện di trên gel agarose hay polyacrylamide

SSR là công cụ hữu ích trong phân tích hệ gen và chọn giống cây trồng,

do khả năng phát hiện tính đa hình rất cao Song chỉ thị này có nhược điểm là sự phức tạp trong thiết kế mồi và giá thành thiết kế mồi cao Trong thực tế, chỉ thị này đã được sử dụng để nghiên cứu một số tính trạng liên quan đến năng suất, bệnh hại, xác định giới tính, phân tích quan hệ di truyền, lập bản đồ gen… [ 23 ]