hệ di truyền ở thực vật
Kỹ Thuật RAPD do nhà khoa học Mỹ Williams JG , Kubelik AR , Livak KJ , Rafalski JA , Tingey SV . thuộc trung tâm nghiên cứu và phát triển, EL du pont de Nemours & Co, lnc, Wilmington phát minh năm 1990 và Welsh và M McClelland cộng sự thuộc Viện nghiên cứu sinh học Califomia hoàn thiện năm 1991 bằng cách xác định chỉ DNA trên các giống lúa bởi mồi ngẫu nhiên với kích thước 10 bp. Sau khi kỹ thuật RAPD ra đời đã được ứng dụng rộng rãi trên toàn thế giới để xác định các chỉ thị phân tử DNA và đặc biệt là xác định sự đa dạng di truyền và mối quan hệ giữa các loài bằng phân đoạn DNA. Nó đã được ứng dụng mạnh mẽ ở Mỹ rồi đến các quốc gia trên thế giới như Ấn Độ, Hàn Quốc, Trung Quốc ... và được ứng dụng vào Việt nam từ những năm đầu thập kỷ 90 của thế kỷ XX và phát triển mạnh ở đầu thế kỷ XXI.
Hiện nay, kỹ thuật RAPD đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu và xác định quan hệ di truyền ở thực vật. Kỹ thuật RAPD cũng được ứng dụng trong việc đánh giá sự đa dạng di truyền giữa các loài và trong phạm vi một loài phân tích và đánh giá hệ gen của thực vật nhằm xác định những thay đổi của các dòng chọn lọc ở mức phân tử.
Phương pháp này còn được ứng dụng trong việc đánh giá hệ gen của giống và mối quan hệ di truyền giữa các loài, nhóm các cá thể cùng một loài [9]. Đinh Thị Phòng và đtg (2001) đã sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên để đánh giá sự thay đổi di truyền của các dòng lúa tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước, kết quả đã chỉ ra sự sai khác ở mức độ phân tử giữa các dòng lúa chọn lọc [10]. Chu Hoàng Mậu và đtg (2002) đã sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên để so sánh hệ gen của các đậu tương đột biến bằng kỹ thuật RAPD cho thấy ba đoạn mồi có biểu hiện đa hình và 6 dòng đậu tương đột biến có mức độ sai khác về DNA trong hệ gen [9]. Nguyễn Thị Tâm (2003) sử dụng 5 mồi ngẫu nhiên để phân tích đa hình DNA trong bộ gen của dòng lúa được chọn lọc, kết quả các dòng có sự sai khác
ở mức độ phân tử, trong đó dòng HR128 có hệ số sai khác với giống gốc là lớn nhất [14]. Vũ Anh Đào (2009), đánh giá sự đa dạng di truyền ở mức phân tử của 16 giống đậu tương với 10 mồi ngẫu nhiên bằng kỹ thuật RAPD tổng số phân đoạn DNA thu được là 766. Trong phạm vi vùng phân tích có 56 phân đoạn DNA được nhân bản, trong đó có 21 băng vạch cho tính đa hình (tương ứng 37,5%) [6]. Kỹ thuật RAPD còn là một công cụ rất có hiệu quả trong việc tìm ra các chỉ thị phân tử để phân biệt các giống hay các loài khác nhau. Trên đối tượng là các cây họ đậu, Doldi và đtg (1997) sử dụng 33 mồi ngẫu nhiên để phân nhóm 18 giống đậu tương có đặc tính chín sớm. Kết quả đã phân nhóm được một số giống có hàm lượng protein cao, sử dụng cho chương trình nghiên cứu nhằm mục đích nâng cao hàm lượng đạm các giống đậu tương thích nghi với điều kiện Châu Âu [18]. Ranade và đtg (2001) sử dụng 40 mồi ngẫu nhiên để nghiên cứu đặc điểm của 12 giống đậu đen. Kết quả phân tích sản phẩm RAPD chỉ ra được một số băng đặc hiệu tương ứng với các mồi ngẫu nhiên để phân biệt một số giống trong nhóm nghiên cứu [22 ]. Li và đtg (2002) đã phân tích 10 giống đậu tương trồng và đậu tương dại ở bốn tỉnh của Trung Quốc đã bổ sung dữ liệu về sự đa dạng chỉ thị phân tử RAPD của các giống đậu tương này [21].
Trong những năm gần đây kỹ thuật RAPD được sử dụng rộng rãi để phân tích di truyền của hệ thống sinh học. Nó là phương pháp hiệu quả trong việc xác định kiểu gen, phân tích quần thể và nguồn gốc loài, nghiên cứu di truyền và lập bản đồ di truyền.
Kỹ thuật RAPD được sử dụng rất nhiều để đánh giá đa dạng di truyền của rất nhiều loài sinh vật khác nhau như Lúa, Ngô, Đậu đen, Khoai tây, Đậu xanh, Đậu đũa, Chè, Cà Phê ...trên thế Giới và Việt Nam. Tuy nhiên chưa có một công trình nghiên cứu nào ở Việt Nam về đánh giá đa dạng di truyền bằng kỹ thuật RAPD đối với cây Đậu đen
Chƣơng 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
2.1.1. Vật liệu thực vật
Vật liệu nghiên cứu của đề tài là hạt của 8 mẫu đậu đen khác nhau, thu thập ở 8 huyện thuộc tỉnh Bắc Giang. Nguồn gốc của các giống đậu tương nghiên cứu được trình bày ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Nguồn gốc các mẫu đậu đen nghiên cứu
TT Tên giống Ký hiệu Nguồn gốc
1 Đậu đen BG1 Lục Nam – Bắc Giang
2 Đậu đen BG2 Lục Ngạn – Bắc Giang
3 Đậu đen BG3 Sơn Động – Bắc Giang
4 Đậu đen BG4 Lạng Giang – Bắc Giang
5 Đậu đen BG5 Yên Thế – Bắc Giang
6 Đậu đen BG6 Tân Yên – Bắc Giang
7 Đậu đen BG7 Việt Yên – Bắc Giang
Hình 2.1. Hình ảnh hạt của các mẫu đậu đen nghiên cứu
2.1.2. Hoá chất và thiết bị
Hoá chất: Sử dụng các hóa chất tinh khiết của các nước và các hãng nổi tiếng như Taq - polymerase, buffer PCR của hãng Invitrogen EDTA, Tris, Agarose,… của Đức.
Các loại thiết bị máy móc: Các thiết bị máy móc phục vụ sinh học phân tử như máy PCR, máy li tâm lạnh eppendorf của Đức, nồi hấp khử trùng, máy soi gel, bộ điện di, box cấy, máy lắc, lò vi sóng, cân điện tử, tủ sấy, tủ lạnh, bể ổn nhiệt, pipetman, máy làm khô DNA (Speed Vac) và một số thiết bị, máy móc cần thiết khác.
BG1 BG2 BG3 BG4
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu
Luận văn được hoàn thành tại Bộ môn Di truyền & Sinh học hiên đại, Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên. Các thí nghiệm được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Công nghệ gen Khoa Sinh_KTNN, Trường ĐHSP và tại phòng thí nghiệm Sinh học - Khoa khoa học sự sống - Trường Đại học khoa học - Đại học Thái Nguyên.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phƣơng pháp sinh học phân tử
2.2.1.1. Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số
Quy trình tách chiết và làm sạch DNA tổng số theo Gawel và Jarret (1991) [20] như sau:
(1) Lấy 200mg lá non nghiền trong nitơ lỏng thành bột mịn.
(2) Bổ sung 800 μl đệm rửa (Tris HCl 1M, EDTA 0,5M, pH=8, Sobitol 2M, NaH2PO4 0,4 %, H2O), li tâm 15 phút tốc độ 12000 vòng /phút, loại bỏ dịch nổi (làm 2 lần )
(3)Thêm 700 μl đệm tách (Tris HCl 1M, pH=8, NaCl 5M, EDTA 0,5M, CTAB 4%, H2O), trộn nhẹ. Ủ 650C ít nhất 1 giờ, 5 phút lắc đều 1 lần, lấy ra để ở nhiệt độ phòng 5 phút.
(4) Thêm 600 μl chloroform : isoamyl (24:1), trộn đều 20 phút. (5) Li tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
(6) Hút 500 μl dịch trong sang ống 1,5 ml, bỏ tủa.
(7) Thêm 500 μl isoprropanol, trộn nhẹ đặt lên đá chờ có tủa trắng.
(8) Li tâm 13000 vòng /phút trong 5 phút, bỏ dịch, úp xuống giấy cho khô. (9) Bổ sung 300 μl cồn 70% búng nhẹ.
(10) Li tâm 13000 vòng/phút, 5 phút, loại bỏ cồn. (Làm 2 lần) (11) Làm khô DNA bằng máy speed vac.
2.2.1.2. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng và độ tinh sạch DNA tổng số
Chúng tôi tiến hành định lượng và kiểm tra độ tinh sạch của DNA tách chiết được bằng phương pháp.
Phương pháp điện di DNA tổng số trên gel agarose
Điện di kiểm tra DNA tổng số của mẫu thí nghiệm trên gel agarose 0,8% (0,8 g agarose trong 100 ml dung dịch TAE 1X). Sản phẩm điện di được nhuộm bằng dung dịch ethydium bromide, soi và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím.
Dựa vào hình ảnh điện di có thể đánh giá nồng độ và độ tinh sạch của DNA trong mẫu thí nghiệm đã tách chiết.
2.2.1.3. Phƣơng pháp RAPD
Phản ứng RAPD được tiến hành với các mồi ngẫu nhiên theo phương pháp của Foolad và đtg (1995) [19]. Sử dụng 12 mồi ngẫu nhiên được tổng hợp bởi hãng Invitrogen, mỗi mồi dài 10 nucleotide, thông tin về trình tự của các mồi được trình bày trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Trình tự nucleotide của 12 mồi sử dụng trong nghiên cứu
Tên mồi Trình tự mồi Tên mồi Trình tự mồi
M1 5’GGCGGACTGT 3’ M7 5’GCCACGGAGA 3’ M2 5’TCGGCGATAG 3’ M8 5’CACGGCTGCG 3’ M3 5’CAGCACCCAC 3’ M9 5’GTATGGGGCT 3’ M4 5’GGAAGTCGCC 3’ M10 5’GCGAACCTCG 3’ M5 5’CTATGCCGAC 3’ M11 5’CCTCCAGTGT 3’ M6 5’CGGCCCACGT 3’ M12 5’GCGAACCTCG3’
Phản ứng RAPD được thực hiện trong 25µl dung dịch và sản phẩm RAPD được điện di trên gel agarose 1,8%, nhuộm ethidium bromide và chụp ảnh. Thành phần của phản ứng RAPD được trình bày trong bảng 2.3.
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng RAPD STT Thành phần Thể tích (µl) 1 PCR MM 12.5 2 Mồi 2 3 Nước 9.5 4 DNA 1 Tổng 25
Phản ứng RAPD thực hiện trong thiết bị nhân DNA AB – applied – biosystems theo chu kỳ nhiệt được trình bày ở bảng 2.4 như sau:
Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của phản ứng RAPD
Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (0
C) Thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 94 3 phút 1
2 Biến tính 94 1 phút
45
3 Gắn mồi 36 1 phút
4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút 30 giây
5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1
2.2.1.4. Phân tích số liệu RAPD
Dựa vào hình ảnh điện di sản phẩm RAPD, sự xuất hiện các băng điện di được ước lượng kích thước và thống kê các băng điện di với từng mồi ở từng mẫu nghiên cứu. Sự xuất hiện hay không xuất hiện các băng điện di được tập hợp để phân tích số liệu theo nguyên tắc: Số 1- xuất hiện phân đoạn DNA và số 0 - không xuất hiện phân đoạn DNA. Các số liệu này được xử lý trên máy tính theo phần mềm NTSYS pc version 2.1 để xác định quan hệ di truyền của các giống đậu tương.
Xác định hàm lượng thông tin đa hình (Polymorphic Information Content) của mỗi mồi được tính theo công thức:
n i i f PIC 1 2 1
PIC là hàm lượng thông tin đa hình
fi là tần suất của alen thứ i
2.2.2. phƣơng pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái, kích thƣớc và khối lƣợng
- Phương pháp quan sát đặc điểm hình thái - Phương pháp đo kích thước hạt
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, KÍCH THƢỚC VÀ KHỐI LƢỢNG 1000 HẠT CỦA CÁC MẪU ĐẬU ĐEN NGHIÊN CỨU
Hình thái, kích thước và khối lượng hạt là một trong những đặc tính quan trọng được quan tâm trong công tác chọn tạo giống đậu đen. Khối lượng 1000 hạt là một trong các yếu tố quan trọng cấu thành năng suất của cây đậu đen, tính trạng này do kiểu gen chi phối và có thể thay đổi do chế độ chăm sóc, mùa vụ và điều kiện môi trường. Kết quả nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, kích thước và khối lượng 1000 hạt của các mẫu đậu đen nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái, kích thước và khối lượng của 8 mẫu đậu đen
TT Tên giống Màu sắc hạt Hình dạng hạt Màu rốn hạt Kích thƣớc hạt (mm) Khối lƣợng 1000 hạt (g) Dài Rộng Dẹt 1 BG1 Đen Tròn hơi vuông Nâu nhạt 0,8 0,8 0,5 128,8
2 BG2 Đen Trứng hơi dài Xám 0,7 0,45 0,3 84,0
3 BG3 Đen Trứng Nâu trắng 0,8 0,5 0,4 97,9
4 BG4 Đen Thận dẹt 0,8 0,6 0,4 104,7
5 BG5 Đen Trứng Nâu xám 0,8 0,55 0,4 101,4
6 BG6 Đen Thận Xám 0,6 0,4 0,3 72,5
7 BG7 Đen Thận Nâu nhạt 0,9 0,5 0,4 98,7
8 BG8 Đen Ô van Nâu trắng 0,7 0,4 0,3 81,1
Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, khối lượng 1000 hạt của các mẫu đậu đen biểu hiện khác nhau và phụ thuộc vào kích thước và độ đồng đều của hạt. Khối
lượng hạt của 8 mẫu đậu đen dao động từ 72,5 g đến 128,8g. Trong các mẫu đậu đen nghiên cứu thì mẫu đậu đen BG1 có khối lượng hạt cao nhất 128,8g, thấp nhất là mẫu BG6 có khối lượng 72,5g. Có thể xếp theo thứ tự từ cao đến thấp về khối lượng 1000 hạt của các mẫu đậu đen như sau: BG1 > BG4 > BG5 > BG7 > BG3 > BG2 > BG8 > BG6.
Kích thước hạt của các mẫu đậu đen nghiên cứu cũng không đồng đều và dao động từ: chiều dài từ 0,6 - 0,9 mm, chiều rộng từ 0,4 - 0,8 mm và chiều dẹt từ 0,3 - 0,5 mm. Chiều dài có kích thước lớn nhất là mẫu BG7 0,9mm, kích thước nhỏ nhất là BG6 0,6mm. Chiều rộng kích thước lớn nhất là BG1 0,8 mm, kích thước nhỏ nhất là BG6 và BG8 là 0,4 mm. chiều dẹt kích thước lớn nhất BG1 0,5mm, kích thước nhỏ nhất BG2 và BG8 là 0,3mm.
Qua kết quả phân tích cho thấy kích thước hạt có liên quan mật thiết với khối lượng hạt, kích thước hạt càng lớn thì khối lượng hạt càng lớn. Do vậy kích thước hạt và khối lượng hạt tỉ lệ thuận với nhau.
Màu sắc chủ yếu của rốn hạt ở các mẫu đậu đen nghiên cứu là màu nâu, xám, nâu nhạt và nâu trắng. Đây là đặc điểm hình thái quan trọng, đặc trưng cho từng mẫu đậu đen..
Về hình dạng hạt, các mẫu đậu đen nghiên cứu có nhiều hình dạng khác nhau, bao gồm hình trứng, ô van và hình thận. sử dụng trong chọn giống để nhận dạng mẫu đậu đen trồng.
Kết quả phân tích màu sắc vỏ hạt, màu rốn hạt, hình dạng hạt và khối lượng 1000 hạt đã cho thấy sự đa dạng về hình thái, kích thước hạt của các giống đậu đen địa phương. Đây chính là cơ sở để đánh giá hiện trạng nguồn gen cây đậu đen địa phương Việt Nam và cũng là nguồn vật liệu chọn giống phong phú cần đươc khai thác có hiệu quả.
3.2. PHÂN TÍCH KẾT QUẢ NHÂN BẢN NGẪU NHIÊN CÁC PHÂN ĐOẠN DNA TỪ HỆ GEN CỦA CÁC MẪU ĐẬU ĐEN BẰNG KỸ THUẬT RAPD
Công nghệ sinh học đang có nhiều đóng góp có giá trị sản xuất nông nghiệp, đặc biệt trong lĩnh vực chọn giống cây trồng. Kỹ thuật sinh học phân tử được ứng dụng nhằm đánh giá sự đa dạng trong hệ gen và xác định mối quan hệ di truyền của thực vật, trong đó RAPD là một kỹ thuật khá thuận lợi và có hiệu quả. Trong nghiên cứu này, chúng tôi trình bày kết quả ứng dụng RAPD vào việc phân tích tính đa hình DNA của 8 mẫu đậu đen trồng tại Bắc Giang.
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ lá đậu đen
Lá non đậu đen 14 ngày tuổi được sử dụng để tách chiết DNA tổng số. Kiểm tra chất lượng tách chiết DNA bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8% (Hình 3.1). Hình 3.1 cho thấy DNA tổng số có một băng duy nhất, rõ nét ở gần giếng truyền mẫu, đảm bảo và có thể sử dụng cho các phân tích DNA tiếp theo.
Hình 3.1. Ảnh điện di DNA tổng số của 8 mẫu đậu đen nghiên cứu
3.2.2. Kết quả nhân bản các phân đoạn DNA bằng kĩ thuật RAPD
Sau khi tách chiết DNA tổng số, chúng tôi pha loãng DNA về nồng độ 50ng/μl và tiến hành các phản ứng RAPD với sự sàng lọc 12 mồi ngẫu nhiên. Đánh giá tính đa hình thông qua giá trị PIC (giá trị PIC càng lớn thì tính đa hình của mồi đó càng cao), khoảng cách di truyền được xác định thông qua hệ số tương đồng và biểu đồ hình cây. Sản phẩm RAPD với các mồi khác nhau được điện di trên gel agarose 1,8%.
Phân tích RAPD với 12 mồi kết quả thu được số lượng các phân đoạn DNA được nhân bản với mỗi mồi dao động từ 11 đến 27 phân đoạn. Kích thước các phân đoạn DNA được nhân bản trong khoảng từ 0,25 kb đến 1,7 kb. Tổng số phân đoạn DNA nhân bản được của 12 đoạn mồi RAPD khi phân tích 8 mẫu đậu đen là 212 phân đoạn. Trong số 12 mồi phân tích, số phân đoạn DNA được nhân bản của 8 mẫu đậu đen ở mồi M2 là nhiều nhất (27 phân đoạn