Sau khi tách chiết DNA tổng số, chúng tôi pha loãng DNA về nồng độ 50ng/μl và tiến hành các phản ứng RAPD với sự sàng lọc 12 mồi ngẫu nhiên. Đánh giá tính đa hình thông qua giá trị PIC (giá trị PIC càng lớn thì tính đa hình của mồi đó càng cao), khoảng cách di truyền được xác định thông qua hệ số tương đồng và biểu đồ hình cây. Sản phẩm RAPD với các mồi khác nhau được điện di trên gel agarose 1,8%.
Phân tích RAPD với 12 mồi kết quả thu được số lượng các phân đoạn DNA được nhân bản với mỗi mồi dao động từ 11 đến 27 phân đoạn. Kích thước các phân đoạn DNA được nhân bản trong khoảng từ 0,25 kb đến 1,7 kb. Tổng số phân đoạn DNA nhân bản được của 12 đoạn mồi RAPD khi phân tích 8 mẫu đậu đen là 212 phân đoạn. Trong số 12 mồi phân tích, số phân đoạn DNA được nhân bản của 8 mẫu đậu đen ở mồi M2 là nhiều nhất (27 phân đoạn DNA) và số phân đoạn được nhân bản ít nhất là ở mồi M4 và M8 (11phân đoạn DNA).
Đối với mỗi mẫu đậu đen thì số phân đoạn được nhân bản có sự khác nhau, dao động từ 23 phân đoạn đến 32 phân đoạn. Mẫu có tổng số phân đoạn DNA được nhân bản với 12 mồi nhiều nhất là giống BG3 (33 phân đoạn), và giống có tổng số phân đoạn DNA được nhân bản với 12 mồi ít nhất là giống BG5 (23 phân đoạn). Tính đa hình thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện của các phân đoạn khi so sánh giữa các mẫu đậu đen với nhau trong cùng một mồi. Điều này được tổng kết và thể hiện qua tỷ lệ phân đoạn đa hình ở mỗi mồi nghiên cứu, kết quả tổng hợp trên bảng 3.2.
Bảng 3.2. Tỷ lệ phân đoạn đa hình khi sử dụng 12 mồi RAPD Mồi Số phân đoạn DNA Số phân đoạn đa hình Số phân đoạn đơn hình Tỷ lệ phân đoạn đa hình (%) M1 2 1 1 50 M2 4 3 1 75 M3 3 2 1 66,67 M4 2 1 1 50 M5 5 4 1 80 M6 3 2 1 66,67 M7 3 2 1 66,67 M8 3 2 1 66,67 M9 3 2 1 66,67 M10 3 1 2 33,33 M11 3 2 1 66,67 M12 6 6 0 100,00 Tổng 40 28 12 70
Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy, tổng số phân đoạn DNA của 8 mẫu đậu đen khi phân tích 12 mồi ngẫu nhiên là 40 phân đoạn, trong đó có 28 phân đoạn cho tính đa hình (chiếm 70%) và không đa hình là 12 phân đoạn (chiếm 30%). Kích thước các phân đoạn DNA được nhân bản trong khoảng từ 0,25 kb đến 1,7kb. Số lượng các phân đoạn tương ứng với mỗi mồi nằm trong khoảng 1 đến 6 phân đoạn, trong đó mồi nhân bản được ít phân đoạn DNA nhất là mồi M1 và M4 (2 phân đoạn), và mồi nhân được nhiều phân đoạn DNA nhất là mồi M12 (6 phân đoạn).
Bảng 3.2 cũng cho thấy, có 12/12 mồi đều biểu hiện tính đa hình. Tuy nhiên, mức độ đa hình giữa các mồi là khác nhau. Mồi biểu hiện tính đa hình
thấp nhất đó là mồi M10 (33,33%), mồi biểu hiện tính đa hình cao nhất là các mồi M12 (100%). Giá trị PIC (Polymophism Information Content) được sử dụng khi phân tích hàm lượng thông tin đa hình. Giá trị PIC không chỉ liên quan tới tỷ lệ phân đoạn DNA đa hình mà còn liên quan trực tiếp với số lượng cá thể cùng xuất hiện phân đoạn đa hình lớn hay nhỏ. Tính đa hình của các mồi RAPD còn được đánh giá thông qua giá trị PIC, giá trị PIC càng lớn thì sự đa hình càng cao và ngược lại.
n i i f PIC 1 2
1 Trong đó, fi là tần số của alen thứ i
Từ bảng 3.3 cho thấy có 8/12 mồi RAPD (M1, M4, M5, M7, M8, M9, M10, M12) cho kết quả đa hình cao, với giá trị PIC > 0,5. Tuy nhiên, sự đa hình của các mồi không tỷ lệ thuận với số lượng các phân đoạn DNA được nhân bản. Chẳng hạn, đối với mồi M5 có 5 phân đoạn DNA được nhân bản nhưng lại có giá trị PIC là (0,8), trong khi đó mồi M10 có 3 phân đoạn DNA được nhân bản nhưng giá trị PIC là (0,98) cao hơn mồi M5. Số liệu bảng 3.3 cho thấy, hầu hết các mồi đều cho tính đa hình. Trong 12 mồi được sử dụng trong kỹ thuật RAPD có 5 mồi M2, M3, M6, M11 là thể hiện tính đa hình thấp (PIC < 0,5). Điều này cho thấy mức độ đa dạng về phân đoạn DNA của các mẫu đậu đen mà chúng tôi nghiên cứu tương đối cao. Như vậy, với 12 mồi ngẫu nhiên đã phản ánh sự đa dạng di truyền của 8 mẫu đậu đen có nguồn gốc khác nhau.
Bảng 3.3. Hàm lượng thông tin đa hình (PIC) của các mồi ngẫu nhiên trong phản ứng RAPD khi nhân bản các phân đoạn DNA của 8 mẫu đậu đen địa phương
STT Tên mồi PIC STT Tên mồi PIC
1 M1 0,75 9 M7 0,86 2 M2 0,22 10 M8 0,84 3 M3 0,17 11 M9 0,69 4 M4 0,93 12 M10 0,98 5 M5 0,8 13 M11 0,32 6 M6 0,47 14 M12 0,93
Kết quả điện di kiểm tra phản ứng RAPD trên gel agarose 1,8% của 12 mồi được chúng tôi phân tích chi tiết thông qua các ảnh điện di được trình bày của một số mồi dưới đây:
Mồi M1
Kết quả diện di sản phẩm RAPD của 8 mẫu đậu đen nghiên cứu với mồi M1 thu được các phân đoạn DNA được nhân bản dao động trong khoảng từ 1 đến 2 phân đoạn. Các phân đoạn xuất hiện ở 2 vị trí khác nhau trên ảnh điện di. Kích thước các phân đoạn dao động 0,7 - 0,9 kb. Trong đó giống BG1, BG3, BG6, BG8 có số phân đoạn là 2, các giống còn lại có 1 phân đoạn được nhân bản.
Tại vị trí 0,8 kb xuất hiện phân đoạn DNA ở 4 Mẫu BG1, BG3, BG6, BG8. Tại vị trí 0.7 kb xuất hiện phân đoạn DNA ở tất cả các mẫu BG1, BG2, BG3, BG4, BG5, BG6, BG7, BG8. Trong số 2 phân đoạn DNA xuất hiện có 1 phân đoạn biểu hiện tính đa hình.
Như vậy, với mồi M1 tổng số có 12 phân đoạn được nhân bản ở 8 mẫu đậu đen và thể hiện sự sai khác trong cấu trúc DNA hệ gen giữa các giống đậu tương tại 1 vị trí 0.8 kb.
Mồi M2
Hình 3.2. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M2 của 8 mẫu đậu đen
M: Marker 1kb;1.BG1, 2.BG2, 3.BG3, 4.BG4, 5.BG5, 6.BG6, 7.BG7, 8.BG8
Kết quả điện di sản phẩm RAPD với mồi M2 được thể hiện ở hình 3.2. cho thấy, đã có từ 1 đến 4 phân đoạn DNA được nhân bản. Các phân đoạn này có chiều dài ước tính từ 0,25Kb đến 0,9Kb. Cụ thể như sau ở kích thước 0,9Kb có 3 giống xuất hiện phân đoạn DNA là BG3, BG4, BG5. Các giống còn lại không xuất hiện. Ở kích thước 0,75Kb có 5 mẫu xuất hiện phân đoạn DNA nhân bản đó là BG1, BG5, BG6, BG7, BG8, 3 mẫu không xuất hiện là BG2, BG3, BG4. Ở vị trí 0,65Kb có 4 mẫu xuất hiện phân đoạn DNA nhân bản là BG3, BG6, BG7, BG8 các mẫu còn lại không xuất hiện. Ở kích thước 0,4Kb tất cả 8 mẫu đều xuất hiện phân đoạn DNA nhân bản. Như vậy, với mồi M2 có tất cả 20 phân đoạn DNA được nhân bản ở 8 mẫu đậu đen nghiên cứu. Với mồi M2 có 4 phân đoạn đoạn DNA trong đó có 3 phân đoạn cho tính đa hình tương ứng với kích thước (0,65Kb; 0,75Kb; 0,9kb).
Mồi M3
Hình 3.3. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M3 của 8 mẫu đậu đen
M: Marker 1kb;1.BG1, 2.BG2, 3.BG3, 4.BG4, 5.BG5, 6.BG6, 7.BG7, 8.BG8
Kết quả điện di sản phẩm RAPD với M3 thể hiện ở Hình 3.3 cho thấy. Từ giới hạn kích thước 0,25 - 1kb có 3 băng DNA xuất hiện, tương ứng với tổng số 19 phân đoạn DNA được nhân bản trên tổng 8 mẫu đậu đen nghiên cứu. Cụ thể ở kích thước khoảng 0,85kb chỉ có 4 mẫu BG1, BG2, BG3, BG4, xuất hiện phân đoạn DNA nhân bản, 4 mẫu còn lại không xuất hiện. Ở kích thước 0,65kb có 7 mẫu xuất hiên phân đoạn DNA được nhân bản là BG1, BG2, BG3, BG5, BG6, BG7, BG8 mẫu còn lại BG4 không xuất hiện phân đoạn DNA được nhân bản. Ở kích thước 0,45Kb tất cả các mẫu xuất hiện đoạn DNA nhân bản đó là BG1, BG2, BG3, BG4, BG5, BG6, BG7, BG8.
Như vậy, với mồi M3 tổng số có 19 phân đoạn được nhân bản ở 8 mẫu đậu đen và thể hiện sự sai khác trong cấu trúc DNA giữa các giống đậu đen tại 2 vị trí 0,85kb, 0,65kb. Như vậy có 2 phân đoạn thể hiện tính đa hình là 0,8kb, 0,65kb, một phân đoạn DNA thể hiện tính đơn hình là 0,45Kb.
Mồi M4
Kết quả điện di sản phẩm RAPD với mồi M4 cho thấy, đã có từ 1 - 2 phân đoạn DNA được nhân bản. Các phân đoạn này có chiều dài ước tính từ 0.75 – 1,5 kb.
Giống xuất hiện nhiều phân đoạn DNA nhất là giống BG1, BG2, BG3 (2phân đoạn).
Ở kích thước 1,4kb cả 8 mẫu xuất hiện phân đoạn DNA. Ở vị trí 1,1 kb chỉ có 3 giống BG1, BG2, BG3 xuất hiện phân đoạn DNA, Còn lại các mẫu BG4, BG5, BG6 không xuất hiên phân đoạn DNA ở vị trí này.
Như vậy, với mồi M4, các phân đoạn thể hiện tính đa hình ở 1 vị trí khác nhau 1.1 kb.
Với M4 tổng số có 11 phân đoạn DNA được nhân bản ở 8 mẫu đậu đen nghiên cứu và thể hiện sự sai khác trong cấu trúc DNA ở 1 vị trí 1.1 kb
Mồi M5
Hình 3.4. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M5 của 8 mẫu đậu đen
M: Marker 1kb;1.BG1, 2.BG2, 3.BG3, 4.BG4, 5.BG5, 6.BG6, 7.BG7, 8.BG8.
Kết quả phân tích điện di sản phẩm RAPD của 8 mẫu đậu đen với mồi M5 được thể hiện ở hình 3.4. Kết quả cho thấy xuất hiện từ 2 - 5 phân đoạn DNA được nhân bản, chúng có chiều dài ước tính từ 0.25 – 1kb.
Giống có số phân đoạn DNA được nhân bản nhiều nhất với 3 phân đoạn. Còn lại các mẫu còn lại đều có 1 đến 2 phân đoạn. Tại vị trí kích thước 0,9kb có 2 Mẫu BG6, BG7 xuất hiện phân đoạn DNA nhân bản còn các mẫu
khác không xuất hiện đoạn DNA nhân bản. Tại vị trí 0,8 kb xuất hiện phân đoạn DNA ở 4 mẫu BG1, BG2, BG3, BG4, BG8. Tại vị trí 0,75kb xuất hiện phân đoạn DNA ở 1 mẫu BG4. Tại vị trí 0,6kb xuất hiện phân đoạn DNA ở 4 mẫu là BG3, BG6, BG7, BG8 còn lại các mẫu khác không xuất hiện. Tại vị trí 0,4kb xuất hiện phân đoạn DNA ở tất cả các mẫu nghiên cứu.Với M5 tổng số có 19 phân đoạn DNA được nhân bản ở 8 mẫu đậu đen nghiên cứu và thể hiện sự sai khác trong cấu trúc DNA ở 4 vị trí 0,9kb, 0,8kb, 0,75kb, 0,6kb. Như vậy, với mồi M5, các phân đoạn thể hiện tính đa hình ở 4 vị trí khác nhau 0,9kb, 0,8kb, 0,75kb, 0,6kb.
Mồi M6
Kết quả điện di sản phẩm RAPD của mồi M6 cho thấy, trong phạm vi vùng phân tích từ 0.25 - 0,75 kb có 3 phân đoạn DNA được nhân bản, trong đó có tới 2 phân đoạn cho tính đa hình. Cụ thể ở kích thước khoảng 0,6 kb có cả 8 mẫu xuất hiện phân đoạn DNA nhân bản. Phân đoạn tiếp theo cho tính đa hình ở kích thước khoảng 0,5 kb với sự xuất hiện phân đoạn DNA ở các mẫu số BG6, BG7, BG8, các mẫu còn lại không thu được phân đoạn này. Với kích thước 0,4 kb chỉ có 5 mẫu nghiên cứu là BG1, BG4, BG5, BG6, BG8 nhân được phân đoạn DNA. 3 mẫu còn lại đều không xuất hiện phân đoạn DNA nhân bản.
Như vậy, với mồi M6 có 3 kích thước (0,4 kb, 0,5 kb, 0,6 kb) trong đó có 2 phân đoạn thể hiện tính đa hình ( 0,4Kb và 0,5Kb).
Mồi M7
Hình 3.5. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M7 của 8 mẫu đậu đen
M: Marker 1kb;1.BG1, 2.BG2, 3.BG3, 4.BG4, 5.BG5, 6.BG6, 7.BG7, 8.BG8.
Kết quả điện di sản phẩm RAPD với mồi M7 của 8 mẫu đậu đen ở hình 3.5 cho thấy, trên các giếng của bản điện di phân đoạn DNA được nhân bản với kích thước tương ứng khoảng 0,25 kb đến 1 kb.
Như vậy, với mồi M8 có 4 kích thước (0,8kb, 0,75kb, 0,6kb, 0,35kb). Cụ thể ở kích thước khoảng 0,8kb có 4 mẫu BG3, BG6, BG7, BG8 xuất hiện phân đoạn DNA nhân bản. Phân đoạn tiếp theo cho tính đa hình ở kích thước khoảng 0,75 kb với sự xuất hiện phân đoạn DNA ở 1 mẫu số BG1, các mẫu còn lại không thu được phân đoạn này. Với kích thước 0,6 kb có 4 mẫu nghiên cứu là BG5, BG6, BG7, BG8 nhân được phân đoạn DNA, các mẫu còn lại đều không xuất hiện phân đoạn DNA nhân bản. Ở kích thước 0,35 Kb tất cả các mẫu nghiên cứu đều xuất hiện đoạn DNA nhân bản.
Như vậy, với mồi M7 có 4 kích thước (0,8kb, 0,75kb, 0,6kb, 0,35kb) trong đó có 3 kích thước thể hiện tính đa hình.
Mồi M8
Kết quả điện di cho thấy, Từ giới hạn kích thước 0,5 - 1kb, có 3 phân đoạn DNA xuất hiện, tương ứng với tổng số 12 phân đoạn DNA được nhân bản trên tổng 8 mẫu đậu đen nghiên cứu. Mẫu thu được nhiều phân đoạn nhất là BG7 ( 3 phân đoạn). Cụ thể ở kích thước khoảng 1kb chỉ có 1 mẫu xuất hiện phân đoạn DNA nhân bản là BG7. Ở kích thước 0,85 kb lại có tất cả 8 mẫu xuất hiện phân đoạn DNA nhân bản. Ở kích thước khoảng 0,6 kb có 3 mẫu xuất hiện đoạn DNA nhân bản là BG3, BG4, BG7 còn lại các mẫu khác không thu được phân đoạn DNA nhân bản.
Như vậy, với mồi M8 có 3 kích thước (1kb, 0,85 kb, 0,6 kb) thì có 2 kích thước thể hiện tính đa hình là ( 1Kb; 0,6 Kb).
Mồi M9
Kết quả điện di cho thấy, xuất hiện 3 phân đoạn DNA ở cả 8 mẫu đậu đen nghiên cứu ở vị trí 0,85kb, 0,75kb, 0,45kb . Thu được 14 phân đoạn DNA ở tất cả 8 mẫu đậu đen nghiên cứu. Cụ thể ở kích thươc 0,85kb có 4 mẫu xuất hiện phân đoạn DNA là BG1, BG2, BG3, BG4 còn lại các mẫu khác không xuất hiện. Ở kích thước 0,75kb chỉ có 2 mẫu xuất hiện phân đoạn DNA là BG1, BG3 các mẫu khác không xuát hiện. Ở kích thước 0,45kb tất cả các mẫu đều xuất hiện phân đoạn DNA nhân bản.
Như vậy M9 có 3 phân đoạn DNA nhân bản trog đó có 2 phân đoạn DNA cho tính đa hình ở kích thước 0,85kb, 0,75kb.
Mồi M10
Kết quả điện di cho thấy, xuất hiện 3 phân đoạn DNA ở 8 mẫu đậu đen nghiên cứu ở vị trí 1,5Kb, 0,9kb, 0,35kb. Tổng số phân đoạn DNA được nhân bản ở 8 mẫu đậu đen là 17, trong đó mẫu cho nhiều phân đoạn nhất là BG5 có 3 phân đoạn. Ở các kích thước khác nhau cụ thể như sau, ở kích thước 1,5kb chỉ có 1 mẫu xuất hiện phân đoạn DNA nhân bản là BG5 còn lại các mẫu khác đều không xuất hiện. Ở kích thước 0,35kb và 0,9kb tất cả các mẫu đầu xuất hiện
phân đoạn DNA nhân bản. Như vậy với M10 xuất hiện 3 phân đoạn DNA nhân bản trong đó có 1 phân đoạn cho tính đa hình ở kích thước 1,5Kb.
Mồi M11
Hình 3.6. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M11 của 8 mẫu đậu đen
M: Marker 1kb;1.BG1, 2.BG2, 3.BG3, 4.BG4, 5.BG5, 6.BG6, 7.BG7, 8.BG8.
Kết quả điện di cho thấy, tính đa dạng thể hiện một cách rõ nét giữa các mẫu đậu đen nghiên cứu. Từ giới hạn kích thước 0,5 – 1,5kb, có 3 phân đoạn DNA xuất hiện, tương ứng với tổng số 21 phân đoạn DNA được nhân bản trên tổng 8 mẫu đậu đen nghiên cứu. Có 2 phân đoạn cho tính đa hình phân đoạn DNA nhân bản. Cụ thể ở kích thước khoảng 1,4 kb có 6 mẫu BG2, BG3, BG4, BG5, BG6, BG7 xuất hiện phân đoạn DNA nhân bản, 2 mẫu còn lại BG1, BG8 không xuất hiện phân đoạn DNA nhân bản. Ở kích thước 0.7 kb cả 8 mẫu xuất hiện phân đoạn DNA nhân bản là. Ở kích thước khoảng 0.65 kb có 7 mẫu thu được phân đoạn DNA nhân bản.
Như vậy, với mồi M11 có 3 kích thước (1,4 kb, 0,7 kb, 0,65kb) trong đó có 2 phân đoạn 1,4 Kb và 0,65kb thể hiện tính đa hình.
Mồi M12
Hình 3.7. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M12 của 8 mẫu đậu đen
M: Marker 1kb;1.BG1, 2.BG2, 3.BG3, 4.BG4, 5.BG5, 6.BG6, 7.BG7, 8.BG8.
Kết quả diện di sản phẩm RAPD của 8 mẫ đậu đen nghiên cứu với mồi M12 thu được các phân đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên dao động từ 2