Luận văn được hoàn thành tại Bộ môn Di truyền & Sinh học hiên đại, Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên. Các thí nghiệm được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Công nghệ gen Khoa Sinh_KTNN, Trường ĐHSP và tại phòng thí nghiệm Sinh học - Khoa khoa học sự sống - Trường Đại học khoa học - Đại học Thái Nguyên.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phƣơng pháp sinh học phân tử
2.2.1.1. Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số
Quy trình tách chiết và làm sạch DNA tổng số theo Gawel và Jarret (1991) [20] như sau:
(1) Lấy 200mg lá non nghiền trong nitơ lỏng thành bột mịn.
(2) Bổ sung 800 μl đệm rửa (Tris HCl 1M, EDTA 0,5M, pH=8, Sobitol 2M, NaH2PO4 0,4 %, H2O), li tâm 15 phút tốc độ 12000 vòng /phút, loại bỏ dịch nổi (làm 2 lần )
(3)Thêm 700 μl đệm tách (Tris HCl 1M, pH=8, NaCl 5M, EDTA 0,5M, CTAB 4%, H2O), trộn nhẹ. Ủ 650C ít nhất 1 giờ, 5 phút lắc đều 1 lần, lấy ra để ở nhiệt độ phòng 5 phút.
(4) Thêm 600 μl chloroform : isoamyl (24:1), trộn đều 20 phút. (5) Li tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
(6) Hút 500 μl dịch trong sang ống 1,5 ml, bỏ tủa.
(7) Thêm 500 μl isoprropanol, trộn nhẹ đặt lên đá chờ có tủa trắng.
(8) Li tâm 13000 vòng /phút trong 5 phút, bỏ dịch, úp xuống giấy cho khô. (9) Bổ sung 300 μl cồn 70% búng nhẹ.
(10) Li tâm 13000 vòng/phút, 5 phút, loại bỏ cồn. (Làm 2 lần) (11) Làm khô DNA bằng máy speed vac.
2.2.1.2. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng và độ tinh sạch DNA tổng số
Chúng tôi tiến hành định lượng và kiểm tra độ tinh sạch của DNA tách chiết được bằng phương pháp.
Phương pháp điện di DNA tổng số trên gel agarose
Điện di kiểm tra DNA tổng số của mẫu thí nghiệm trên gel agarose 0,8% (0,8 g agarose trong 100 ml dung dịch TAE 1X). Sản phẩm điện di được nhuộm bằng dung dịch ethydium bromide, soi và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím.
Dựa vào hình ảnh điện di có thể đánh giá nồng độ và độ tinh sạch của DNA trong mẫu thí nghiệm đã tách chiết.
2.2.1.3. Phƣơng pháp RAPD
Phản ứng RAPD được tiến hành với các mồi ngẫu nhiên theo phương pháp của Foolad và đtg (1995) [19]. Sử dụng 12 mồi ngẫu nhiên được tổng hợp bởi hãng Invitrogen, mỗi mồi dài 10 nucleotide, thông tin về trình tự của các mồi được trình bày trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Trình tự nucleotide của 12 mồi sử dụng trong nghiên cứu
Tên mồi Trình tự mồi Tên mồi Trình tự mồi
M1 5’GGCGGACTGT 3’ M7 5’GCCACGGAGA 3’ M2 5’TCGGCGATAG 3’ M8 5’CACGGCTGCG 3’ M3 5’CAGCACCCAC 3’ M9 5’GTATGGGGCT 3’ M4 5’GGAAGTCGCC 3’ M10 5’GCGAACCTCG 3’ M5 5’CTATGCCGAC 3’ M11 5’CCTCCAGTGT 3’ M6 5’CGGCCCACGT 3’ M12 5’GCGAACCTCG3’
Phản ứng RAPD được thực hiện trong 25µl dung dịch và sản phẩm RAPD được điện di trên gel agarose 1,8%, nhuộm ethidium bromide và chụp ảnh. Thành phần của phản ứng RAPD được trình bày trong bảng 2.3.
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng RAPD STT Thành phần Thể tích (µl) 1 PCR MM 12.5 2 Mồi 2 3 Nước 9.5 4 DNA 1 Tổng 25
Phản ứng RAPD thực hiện trong thiết bị nhân DNA AB – applied – biosystems theo chu kỳ nhiệt được trình bày ở bảng 2.4 như sau:
Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của phản ứng RAPD
Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (0
C) Thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 94 3 phút 1
2 Biến tính 94 1 phút
45
3 Gắn mồi 36 1 phút
4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút 30 giây
5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1
2.2.1.4. Phân tích số liệu RAPD
Dựa vào hình ảnh điện di sản phẩm RAPD, sự xuất hiện các băng điện di được ước lượng kích thước và thống kê các băng điện di với từng mồi ở từng mẫu nghiên cứu. Sự xuất hiện hay không xuất hiện các băng điện di được tập hợp để phân tích số liệu theo nguyên tắc: Số 1- xuất hiện phân đoạn DNA và số 0 - không xuất hiện phân đoạn DNA. Các số liệu này được xử lý trên máy tính theo phần mềm NTSYS pc version 2.1 để xác định quan hệ di truyền của các giống đậu tương.
Xác định hàm lượng thông tin đa hình (Polymorphic Information Content) của mỗi mồi được tính theo công thức:
n i i f PIC 1 2 1
PIC là hàm lượng thông tin đa hình
fi là tần suất của alen thứ i
2.2.2. phƣơng pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái, kích thƣớc và khối lƣợng
- Phương pháp quan sát đặc điểm hình thái - Phương pháp đo kích thước hạt
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, KÍCH THƢỚC VÀ KHỐI LƢỢNG 1000 HẠT CỦA CÁC MẪU ĐẬU ĐEN NGHIÊN CỨU
Hình thái, kích thước và khối lượng hạt là một trong những đặc tính quan trọng được quan tâm trong công tác chọn tạo giống đậu đen. Khối lượng 1000 hạt là một trong các yếu tố quan trọng cấu thành năng suất của cây đậu đen, tính trạng này do kiểu gen chi phối và có thể thay đổi do chế độ chăm sóc, mùa vụ và điều kiện môi trường. Kết quả nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, kích thước và khối lượng 1000 hạt của các mẫu đậu đen nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái, kích thước và khối lượng của 8 mẫu đậu đen
TT Tên giống Màu sắc hạt Hình dạng hạt Màu rốn hạt Kích thƣớc hạt (mm) Khối lƣợng 1000 hạt (g) Dài Rộng Dẹt 1 BG1 Đen Tròn hơi vuông Nâu nhạt 0,8 0,8 0,5 128,8
2 BG2 Đen Trứng hơi dài Xám 0,7 0,45 0,3 84,0
3 BG3 Đen Trứng Nâu trắng 0,8 0,5 0,4 97,9
4 BG4 Đen Thận dẹt 0,8 0,6 0,4 104,7
5 BG5 Đen Trứng Nâu xám 0,8 0,55 0,4 101,4
6 BG6 Đen Thận Xám 0,6 0,4 0,3 72,5
7 BG7 Đen Thận Nâu nhạt 0,9 0,5 0,4 98,7
8 BG8 Đen Ô van Nâu trắng 0,7 0,4 0,3 81,1
Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, khối lượng 1000 hạt của các mẫu đậu đen biểu hiện khác nhau và phụ thuộc vào kích thước và độ đồng đều của hạt. Khối
lượng hạt của 8 mẫu đậu đen dao động từ 72,5 g đến 128,8g. Trong các mẫu đậu đen nghiên cứu thì mẫu đậu đen BG1 có khối lượng hạt cao nhất 128,8g, thấp nhất là mẫu BG6 có khối lượng 72,5g. Có thể xếp theo thứ tự từ cao đến thấp về khối lượng 1000 hạt của các mẫu đậu đen như sau: BG1 > BG4 > BG5 > BG7 > BG3 > BG2 > BG8 > BG6.
Kích thước hạt của các mẫu đậu đen nghiên cứu cũng không đồng đều và dao động từ: chiều dài từ 0,6 - 0,9 mm, chiều rộng từ 0,4 - 0,8 mm và chiều dẹt từ 0,3 - 0,5 mm. Chiều dài có kích thước lớn nhất là mẫu BG7 0,9mm, kích thước nhỏ nhất là BG6 0,6mm. Chiều rộng kích thước lớn nhất là BG1 0,8 mm, kích thước nhỏ nhất là BG6 và BG8 là 0,4 mm. chiều dẹt kích thước lớn nhất BG1 0,5mm, kích thước nhỏ nhất BG2 và BG8 là 0,3mm.
Qua kết quả phân tích cho thấy kích thước hạt có liên quan mật thiết với khối lượng hạt, kích thước hạt càng lớn thì khối lượng hạt càng lớn. Do vậy kích thước hạt và khối lượng hạt tỉ lệ thuận với nhau.
Màu sắc chủ yếu của rốn hạt ở các mẫu đậu đen nghiên cứu là màu nâu, xám, nâu nhạt và nâu trắng. Đây là đặc điểm hình thái quan trọng, đặc trưng cho từng mẫu đậu đen..
Về hình dạng hạt, các mẫu đậu đen nghiên cứu có nhiều hình dạng khác nhau, bao gồm hình trứng, ô van và hình thận. sử dụng trong chọn giống để nhận dạng mẫu đậu đen trồng.
Kết quả phân tích màu sắc vỏ hạt, màu rốn hạt, hình dạng hạt và khối lượng 1000 hạt đã cho thấy sự đa dạng về hình thái, kích thước hạt của các giống đậu đen địa phương. Đây chính là cơ sở để đánh giá hiện trạng nguồn gen cây đậu đen địa phương Việt Nam và cũng là nguồn vật liệu chọn giống phong phú cần đươc khai thác có hiệu quả.
3.2. PHÂN TÍCH KẾT QUẢ NHÂN BẢN NGẪU NHIÊN CÁC PHÂN ĐOẠN DNA TỪ HỆ GEN CỦA CÁC MẪU ĐẬU ĐEN BẰNG KỸ THUẬT RAPD
Công nghệ sinh học đang có nhiều đóng góp có giá trị sản xuất nông nghiệp, đặc biệt trong lĩnh vực chọn giống cây trồng. Kỹ thuật sinh học phân tử được ứng dụng nhằm đánh giá sự đa dạng trong hệ gen và xác định mối quan hệ di truyền của thực vật, trong đó RAPD là một kỹ thuật khá thuận lợi và có hiệu quả. Trong nghiên cứu này, chúng tôi trình bày kết quả ứng dụng RAPD vào việc phân tích tính đa hình DNA của 8 mẫu đậu đen trồng tại Bắc Giang.
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ lá đậu đen
Lá non đậu đen 14 ngày tuổi được sử dụng để tách chiết DNA tổng số. Kiểm tra chất lượng tách chiết DNA bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8% (Hình 3.1). Hình 3.1 cho thấy DNA tổng số có một băng duy nhất, rõ nét ở gần giếng truyền mẫu, đảm bảo và có thể sử dụng cho các phân tích DNA tiếp theo.
Hình 3.1. Ảnh điện di DNA tổng số của 8 mẫu đậu đen nghiên cứu
3.2.2. Kết quả nhân bản các phân đoạn DNA bằng kĩ thuật RAPD
Sau khi tách chiết DNA tổng số, chúng tôi pha loãng DNA về nồng độ 50ng/μl và tiến hành các phản ứng RAPD với sự sàng lọc 12 mồi ngẫu nhiên. Đánh giá tính đa hình thông qua giá trị PIC (giá trị PIC càng lớn thì tính đa hình của mồi đó càng cao), khoảng cách di truyền được xác định thông qua hệ số tương đồng và biểu đồ hình cây. Sản phẩm RAPD với các mồi khác nhau được điện di trên gel agarose 1,8%.
Phân tích RAPD với 12 mồi kết quả thu được số lượng các phân đoạn DNA được nhân bản với mỗi mồi dao động từ 11 đến 27 phân đoạn. Kích thước các phân đoạn DNA được nhân bản trong khoảng từ 0,25 kb đến 1,7 kb. Tổng số phân đoạn DNA nhân bản được của 12 đoạn mồi RAPD khi phân tích 8 mẫu đậu đen là 212 phân đoạn. Trong số 12 mồi phân tích, số phân đoạn DNA được nhân bản của 8 mẫu đậu đen ở mồi M2 là nhiều nhất (27 phân đoạn DNA) và số phân đoạn được nhân bản ít nhất là ở mồi M4 và M8 (11phân đoạn DNA).
Đối với mỗi mẫu đậu đen thì số phân đoạn được nhân bản có sự khác nhau, dao động từ 23 phân đoạn đến 32 phân đoạn. Mẫu có tổng số phân đoạn DNA được nhân bản với 12 mồi nhiều nhất là giống BG3 (33 phân đoạn), và giống có tổng số phân đoạn DNA được nhân bản với 12 mồi ít nhất là giống BG5 (23 phân đoạn). Tính đa hình thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện của các phân đoạn khi so sánh giữa các mẫu đậu đen với nhau trong cùng một mồi. Điều này được tổng kết và thể hiện qua tỷ lệ phân đoạn đa hình ở mỗi mồi nghiên cứu, kết quả tổng hợp trên bảng 3.2.
Bảng 3.2. Tỷ lệ phân đoạn đa hình khi sử dụng 12 mồi RAPD Mồi Số phân đoạn DNA Số phân đoạn đa hình Số phân đoạn đơn hình Tỷ lệ phân đoạn đa hình (%) M1 2 1 1 50 M2 4 3 1 75 M3 3 2 1 66,67 M4 2 1 1 50 M5 5 4 1 80 M6 3 2 1 66,67 M7 3 2 1 66,67 M8 3 2 1 66,67 M9 3 2 1 66,67 M10 3 1 2 33,33 M11 3 2 1 66,67 M12 6 6 0 100,00 Tổng 40 28 12 70
Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy, tổng số phân đoạn DNA của 8 mẫu đậu đen khi phân tích 12 mồi ngẫu nhiên là 40 phân đoạn, trong đó có 28 phân đoạn cho tính đa hình (chiếm 70%) và không đa hình là 12 phân đoạn (chiếm 30%). Kích thước các phân đoạn DNA được nhân bản trong khoảng từ 0,25 kb đến 1,7kb. Số lượng các phân đoạn tương ứng với mỗi mồi nằm trong khoảng 1 đến 6 phân đoạn, trong đó mồi nhân bản được ít phân đoạn DNA nhất là mồi M1 và M4 (2 phân đoạn), và mồi nhân được nhiều phân đoạn DNA nhất là mồi M12 (6 phân đoạn).
Bảng 3.2 cũng cho thấy, có 12/12 mồi đều biểu hiện tính đa hình. Tuy nhiên, mức độ đa hình giữa các mồi là khác nhau. Mồi biểu hiện tính đa hình
thấp nhất đó là mồi M10 (33,33%), mồi biểu hiện tính đa hình cao nhất là các mồi M12 (100%). Giá trị PIC (Polymophism Information Content) được sử dụng khi phân tích hàm lượng thông tin đa hình. Giá trị PIC không chỉ liên quan tới tỷ lệ phân đoạn DNA đa hình mà còn liên quan trực tiếp với số lượng cá thể cùng xuất hiện phân đoạn đa hình lớn hay nhỏ. Tính đa hình của các mồi RAPD còn được đánh giá thông qua giá trị PIC, giá trị PIC càng lớn thì sự đa hình càng cao và ngược lại.
n i i f PIC 1 2
1 Trong đó, fi là tần số của alen thứ i
Từ bảng 3.3 cho thấy có 8/12 mồi RAPD (M1, M4, M5, M7, M8, M9, M10, M12) cho kết quả đa hình cao, với giá trị PIC > 0,5. Tuy nhiên, sự đa hình của các mồi không tỷ lệ thuận với số lượng các phân đoạn DNA được nhân bản. Chẳng hạn, đối với mồi M5 có 5 phân đoạn DNA được nhân bản nhưng lại có giá trị PIC là (0,8), trong khi đó mồi M10 có 3 phân đoạn DNA được nhân bản nhưng giá trị PIC là (0,98) cao hơn mồi M5. Số liệu bảng 3.3 cho thấy, hầu hết các mồi đều cho tính đa hình. Trong 12 mồi được sử dụng trong kỹ thuật RAPD có 5 mồi M2, M3, M6, M11 là thể hiện tính đa hình thấp (PIC < 0,5). Điều này cho thấy mức độ đa dạng về phân đoạn DNA của các mẫu đậu đen mà chúng tôi nghiên cứu tương đối cao. Như vậy, với 12 mồi ngẫu nhiên đã phản ánh sự đa dạng di truyền của 8 mẫu đậu đen có nguồn gốc khác nhau.
Bảng 3.3. Hàm lượng thông tin đa hình (PIC) của các mồi ngẫu nhiên trong phản ứng RAPD khi nhân bản các phân đoạn DNA của 8 mẫu đậu đen địa phương
STT Tên mồi PIC STT Tên mồi PIC
1 M1 0,75 9 M7 0,86 2 M2 0,22 10 M8 0,84 3 M3 0,17 11 M9 0,69 4 M4 0,93 12 M10 0,98 5 M5 0,8 13 M11 0,32 6 M6 0,47 14 M12 0,93
Kết quả điện di kiểm tra phản ứng RAPD trên gel agarose 1,8% của 12 mồi được chúng tôi phân tích chi tiết thông qua các ảnh điện di được trình bày của một số mồi dưới đây:
Mồi M1
Kết quả diện di sản phẩm RAPD của 8 mẫu đậu đen nghiên cứu với mồi M1 thu được các phân đoạn DNA được nhân bản dao động trong khoảng từ 1 đến 2 phân đoạn. Các phân đoạn xuất hiện ở 2 vị trí khác nhau trên ảnh điện di. Kích thước các phân đoạn dao động 0,7 - 0,9 kb. Trong đó giống BG1, BG3, BG6, BG8 có số phân đoạn là 2, các giống còn lại có 1 phân đoạn được nhân bản.
Tại vị trí 0,8 kb xuất hiện phân đoạn DNA ở 4 Mẫu BG1, BG3, BG6, BG8. Tại vị trí 0.7 kb xuất hiện phân đoạn DNA ở tất cả các mẫu BG1, BG2, BG3, BG4, BG5, BG6, BG7, BG8. Trong số 2 phân đoạn DNA xuất hiện có 1 phân đoạn biểu hiện tính đa hình.
Như vậy, với mồi M1 tổng số có 12 phân đoạn được nhân bản ở 8 mẫu đậu đen và thể hiện sự sai khác trong cấu trúc DNA hệ gen giữa các giống đậu tương tại 1 vị trí 0.8 kb.
Mồi M2
Hình 3.2. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M2 của 8 mẫu đậu đen
M: Marker 1kb;1.BG1, 2.BG2, 3.BG3, 4.BG4, 5.BG5, 6.BG6, 7.BG7, 8.BG8
Kết quả điện di sản phẩm RAPD với mồi M2 được thể hiện ở hình 3.2. cho thấy, đã có từ 1 đến 4 phân đoạn DNA được nhân bản. Các phân đoạn này có chiều dài ước tính từ 0,25Kb đến 0,9Kb. Cụ thể như sau ở kích thước 0,9Kb có 3 giống xuất hiện phân đoạn DNA là BG3, BG4, BG5. Các giống còn lại không xuất hiện. Ở kích thước 0,75Kb có 5 mẫu xuất hiện phân đoạn DNA nhân bản đó là BG1, BG5, BG6, BG7, BG8, 3 mẫu không xuất hiện là BG2, BG3, BG4. Ở vị trí 0,65Kb có 4 mẫu xuất hiện phân đoạn DNA nhân bản là BG3, BG6, BG7, BG8