Đánh giá đa dạng di truyền của một số mẫu giống sen (nelumbo nucifera gaertn ) bằng chỉ thị rapd và issr

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ MẪU GIỐNG SEN (NELUMBO NUCIFERA GAERTN.) BẰNG CHỈ THỊ RAPD VÀ ISSR Hà Nội - 2023 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ MẪU GIỐNG SEN (NELUMBO NUCIFERA GAERTN.) BẰNG CHỈ THỊ RAPD VÀ ISSR Người thực : Nguyễn Thanh Thảo Mã sinh viên : 642224 Khoá : K64-CNSHA Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Giáo viên hướng dẫn : TS Đinh Trường Sơn Hà Nội - 2023 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan khóa luận tốt nghiệp “Đánh giá đa dạng di truyền số mẫu giống sen (Nelumbo nucifera Gaertn.) thị RAPD ISSR” cơng trình nghiên cứu riêng tơi hướng dẫn TS Đinh Trường Sơn Các nội dung nghiên cứu, số liệu kết nghiên cứu trung thực chưa công bố cơng trình Nếu phát gian lận tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm Trong trình nghiên cứu thực khóa luận, tơi kế thừa thành tựu nhà khoa học với trân trọng biết ơn sâu sắc Hà Nội, ngày 12 tháng năm 2023 Sinh viên thực Nguyễn Thanh Thảo i LỜI CẢM ƠN Khoá luận tốt nghiệp với đề tài “Đánh giá đa dạng di truyền số mẫu giống sen (Nelumbo nucifera Gaertn.) thị RAPD ISSR” kết trình cố gắng thân với giúp đỡ tận tình, động viên khích lệ thầy cơ, bạn bè người thân Qua đây, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến người giúp đỡ em thời gian học tập – nghiên cứu khoa học vừa qua Em xin trân trọng gửi đến thầy TS Đinh Trường Sơn, người trực tiếp tận tình hướng dẫn cung cấp tài liệu, thông tin khoa học cần thiết cho luận lời cảm ơn chân thành sâu sắc Em xin cảm ơn quý thầy, cô giáo Bộ môn Công nghệ sinh học Thực vật – Khoa Công nghệ sinh học tạo điều kiện tốt giúp đỡ em suốt trình thực khoá luận tốt nghiệp Em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến Viện Nghiên cứu Rau cung cấp mẫu giống sen để em thực tốt đề tài Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè, người thân ln bên cạnh ủng hộ, khích lệ tinh thần giúp em hồn thành khố luận tốt nghiệp Do giới hạn kiến thức khả lý luận thân nhiều thiếu sót hạn chế, kính mong dẫn đóng góp thầy, để luận em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 12 tháng năm 2023 Sinh viên thực Nguyễn Thanh Thảo ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii TÓM TẮT ix MỞ ĐẦU A Đặt vấn đề B Mục tiêu yêu cầu a Mục tiêu b Yêu cầu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan sen 1.1.1 Nguồn gốc phân loại 1.1.1.1 Nguồn gốc 1.1.1.2 Phân loại phân bố 1.1.2 Đặc điểm sinh học sen 1.1.3 Giá trị sen 1.1.3.1 Giá trị dinh dưỡng 1.1.3.2 Giá trị y học 1.1.3.3 Giá trị văn hóa, thẩm mỹ 11 1.1.4 Tình hình nghiên cứu sen giới Việt Nam 12 iii 1.1.4.1 Tình hình nghiên cứu sen giới 12 1.1.4.2 Tình hình nghiên cứu sen Việt Nam 13 1.2 Chỉ thị phân tử ứng dụng thị phân tử phân tích đa dạng di truyền 14 1.2.1 Khái niệm thị phân tử 14 1.2.2 Chỉ thị DNA - Chỉ thị RAPD 16 1.2.3 Chỉ thị DNA - Chỉ thị ISSR 17 1.3 Một số nghiên cứu đa dạng di truyền chủng giống sen 18 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Đối tượng, địa điểm thời gian nghiên cứu 21 2.2 Vật liệu dùng nghiên cứu 21 2.3 Hóa chất thiết bị dùng nghiên cứu 25 2.4 Nội dung phương pháp nghiên cứu 26 2.4.1 Nội dung nghiên cứu 26 2.4.2 Phương pháp nghiên cứu 26 2.4.2.1 Tách chiết DNA tổng số 26 2.4.2.2 Phương pháp thực phản ứng PCR 28 2.4.2.3 Điện di gel agarose 29 2.4.2.4 Phương pháp đánh giá xử lí số liệu 29 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Kết tách chiết DNA tổng số 31 3.2 Phân tích đa dạng di truyền thị RAPD 33 3.3 Phân tích đa dạng di truyền thị ISSR 44 iv 3.4 Phân tích đa dạng di truyền thị RAPD ISSR 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 A Kết luận 60 B Kiến nghị 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 PHỤ LỤC 68 v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Giá trị dinh dưỡng 100g củ sen hạt sen Bảng 2.1 Danh sách 30 mẫu giống sen nghiên cứu 21 Bảng 2.2 Danh sách thị phân tử RAPD sử dụng nghiên cứu 24 Bảng 2.3 Danh sách thị phân tử ISSR sử dụng nghiên cứu 25 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR 28 Bảng 2.5 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR 28 Bảng 3.1 Kết đo hàm lượng DNA 30 mẫu sen nghiên cứu 31 Bảng 3.2 Kết phân tích 10 mồi RAPD 34 Bảng 3.3 Giá trị PIC Rp 10 mồi RAPD 35 Bảng 3.4 Hệ số tương đồng di truyền 30 mẫu sen dựa thị RAPD 41 Bảng 3.5 Kết phân tích 10 mồi ISSR 45 Bảng 3.6 Giá trị PIC Rp 10 mồi ISSR 46 Bảng 3.7 Hệ số tương đồng di truyền 30 mẫu sen dựa thị ISSR 51 Bảng 3.8 Hệ số tương đồng di truyền 30 mẫu sen phân tích kết hợp hai thị RAPD ISSR 56 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây sen Hình 3.1 Hình ảnh điện di sản phẩm DNA tổng số 30 mẫu sen 33 Hình 3.2 Kết chạy điện di sản phẩm PCR với mồi APH-18 33 Hình 3.3 Kết điện di sản phẩm PCR với mồi OPA-02 34 Hình 3.4 Sơ đồ mức độ tương đồng di truyền 30 mẫu giống sen dựa vào thị RAPD 43 Hình 3.5 Kết điện di sản phẩm PCR với mồi UBC-889 45 Hình 3.6 Sơ đồ mức độ tương đồng di truyền 30 mẫu giống sen dựa vào thị ISSR 53 Hình 3.7 Sơ đồ mức độ tương đồng di truyền 30 mẫu giống sen dựa vào thị RAPD ISSR 58 vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên đầy đủ Từ viết tắt AFLP cs Amplified Fragment Length Polymorphism Cộng DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid Etbr Ethidium bromide ISSR Inter-Simple Sequence Repeats RAPD Random Amplified Polymorphism DNA PCR Polymerase Chain Reaction PIC Polymorphic Information Content RFLP Rp Restriction Fragment Length Polymorphism Resolving power SSR Simple Sequence Repeat TAE Tris base, acetic acid and EDTA viii KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ A Kết luận Đã đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn 30 mẫu giống sen thu thập với 10 mồi RAPD 10 mồi ISSR 20 thị nhân tổng số 3210 băng, 207 locus, tỷ lệ lệ đa hình locus đạt 95,5% Ở hệ số tương đồng di truyền 0,741, 30 mẫu giống sen chia thành nhóm Nhóm I có 15 mẫu, nhóm II có mẫu mẫu FL026, nhóm III có 10 mẫu, nhóm IV có mẫu, nhóm V có mẫu mẫu Kết cho thấy mẫu giống sen thu thập có mức độ đa dạng di truyền cao B Kiến nghị Sử dụng kỹ thuật thị phân tử khác (AFLP, SSR…) để phân tích đa dạng di truyền mẫu giống sen thu thập để phục vụ tốt công tác định hướng bảo tồn, chọn tạo giống sen có chất lượng, mang lại hiệu dược liệu, kinh tế cao cho người dân 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nước Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Nguyễn Đức Tuấn & Trần Hùng (2011) Nghiên cứu thành phần alkaloid tâm sen (Nelumbo nucifera Gaertn Nelumbonaceae) Tạp chí Y học Thành Phố Hồ Chí Minh, 15(1), 606 – 611 Đỗ Tất Lợi (2002) Những thuốc vị thuốc Việt Nam Nhà xuất Y học Hoàng Thị Nga, Nguyễn Thị Ngọc Huệ, Lã Tuấn Nghĩa (2017) Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen sen (Nelumbo nucifera Gaertn.) bảo tồn Trung tâm Tài nguyên thực vật Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam, 8(81), 41-46 Hồng Thị Nga (2016) Nghiên cứu đa dạng nguồn gen sen (Nelumbo nucifera Gaertn.) phục vụ công tác bảo tồn chọn tạo giống Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Phạm Văn Duệ (2005) Giáo trình Kỹ thuật trồng hoa cảnh Nhà xuất Hà Nội, tr111-112 Nguyễn Phước Tuyên (2008) Kỹ thuật trồng sen Nxb Nông nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh, 23 trang Nguyễn Đức Thành (2014) Các kỹ thuật thị DNA nghiên cứu chọn lọc thực vật Tạp chí sinh học, 36(3), 265 – 294 Nguyễn Thị Quỳnh Trang, Hoàng Thị Kim Hồng, Võ Thị Mai Hương, Bùi Ninh & Ngô Quý Thảo Ngọc (2018) Đặc điểm hình thái khả sinh trưởng, phát triển, suất giống sen cao sản trồng Thừa Thiên Huế Tạp chí Khoa học Đại học Huế 127(1C), 193 - 201 https://doi.org/10.26459/hueuni-jns.v127i1c.4923 Nguyễn Thị Nhung (2001) Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành 61 phần hóa học tác dụng sinh học sen (Nelumbo nucifera Gaertn.) họ sen (Nelumbonaceae) Việt Nam Luận án Tiến sĩ Dược học, trường Đại học Dược Hà Nội 10 Trần Cơng Luận (2016) Giáo trình Dược liệu học (dùng cho đào tạo dược sĩ cao đẳng) Trường Đại học Tây Đơ Tài liệu nước ngồi 11 An, N., Guo, H., & Ke, W (2009) Genetic Variation in Rhizome Lotus (Nelumbo nucifera Gaertn ssp nucifera) Germplasms from China Assessed by RAPD Markers Agricultural Sciences in China, 8(1), 31–39 doi:10.1016/s1671-2927(09)60006-7 12 Chen, J., Tang, M., Liu, M., Jiang, Y., Liu, B., & Liu, S (2020) Neferine and lianzixin extracts have protective effects on undifferentiated caffeine-damaged PC12 cells BMC Complementary Medicine and Therapies, 20(1), 76 https://doi.org/10.1186/s12906020-2872-2 13 Chen, Y., Zhou, R., Lin, X., Wu, K., Qian, X., & Huang, S (2008) ISSR analysis of genetic diversity in sacred lotus cultivars Aquatic Botany, 89(3), 311–316 doi:10.1016/j.aquabot.2008.03.006 14 Dhanarasu, S & Al-Hazimi, A (2013) Phytochemistry, Pharmacological and therapeutic applications of Nelumbo Nucifera Asian Journal of Phytomedicine and Clinical Research 1(2), 123 – 136 15 Fu, Y., Liu, F., Li, S., Tian, D., Dong, L., Chen, Y., & Su, Y (2021) Genetic diversity of the wild Asian lotus (Nelumbo nucifera) from Northern China Horticultural Plant Journal, 7(5), 488–500 https://doi.org/10.1016/j.hpj.2021.04.005 16 Guo, L., Wang, S., Zhu, C., Hu, J., Zhang, J., & Du, X (2016) The Impacts of the Entanglement Concentration on the Hydrodynamic 62 Properties of Kudzu and Lotus Rhizome Starch Aqueous Solutions Impacts of the Entanglement Concentration on the Hydrodynamic Properties of Kudzu and Lotus Rhizome Starch Aqueous Solutions Journal of Food and Nutrition Research, 4(11), 750–759 https://doi.org/10.12691/jfnr-4-11-8 17 Guo, H.B (2008) Cultivation of lotus (Nelumbo nucifera Gaertn ssp nucifera) and its utilization in China Genet Resour Crop Evol 56, 323–330 (2009) https://doi.org/10.1007/s10722-008-9366-2 18 Guo, H.B, Li S.M., Ke W.D (2005) Genetic diversity and phylogenetic relationship of flower-lotus cultivars (Nelumbo) by RAPD markers Wuhan Botanical Research Journal, 23(5): 417-421 19 Han, Y.-C., Teng, C.-Z., Zhong, S., Zhou, M.-Q., Hu, Z.-L., & Song, Y.-C (2007) Genetic variation and clonal diversity in populations of Nelumbo nucifera (Nelumbonaceae) in central China detected by ISSR markers Aquatic Botany, 86(1), 69–75 doi:10.1016/j.aquabot.2006.09.007 20 Hajela, S., Srivastava, D R., & Kaur, J (2018) A Review on Health Benefits of Lotus Seeds (Nelumbo nucifera) Journal of Applied Science and Computations, 5(4) https://www.researchgate.net/publication/337856597_A_Review_on _Health_Benefits_of_Lotus_Seeds_Nelumbo_nucifera 21 Hu, J., Pan, L., Liu, H., Wang, S., Wu, Z., Ke, W., & Ding, Y (2012) Comparative analysis of genetic diversity in sacred lotus (Nelumbo nucifera Gaertn.) using AFLP and SSR markers Molecular Biology Reports, 39(4), 3637–3647 https://doi.org/10.1007/s11033-011-1138-y 22 Ku-Lee H., Mun-Choi Y., Ouk-Noh D., Joo-Suh H (2005) Antioxidant effect of Korean traditional Lotus liquor (Yunyupju) 63 International Journal of Food Science & Technology, 40: 709 787 23 Li, Z., Liu, X., Gituru, R W., Juntawong, N., Zhou, M., & Chen, L (2010) Genetic diversity and classification of Nelumbo germplasm of different origins by RAPD and ISSR analysis Scientia Horticulturae, 125(4), 724–732 doi:10.1016/j.scienta.2010.05.005 24 Lin Z, Zhang C, Cao D, Damaris RN, Yang P The Latest Studies on Lotus (Nelumbo nucifera)-an Emerging Horticultural Model Plant Int J Mol Sci 2019 Jul 27;20(15):3680 doi: 10.3390/ijms20153680 PMID: 31357582; PMCID: PMC6696627 25 Liu, F L., Dai, Y L., Hoang, T N., Puripunyavanich, V., Chukiatman, P W., Qin, M., Fu, Y R., Chen, Y C., & Tian, D K (2022) Genetic diversity and inferred ancestry of Asian lotus (Nelumbo nucifera) germplasms in Thailand and Vietnam Plant Diversity, xxxx https://doi.org/10.1016/j.pld.2022.05.004 26 Magness, J.R., G M Markle, C C Compton (1971) Food and feed crops of the United States Interregional Research Project USDA Bulletin 828 27 Mekbib, Y., Huang, S X., Ngarega, B K., Li, Z Z., Shi, T., Ou, K F., Liang, Y T., Chen, J M., & Yang, X Y (2020) The level of genetic diversity and differentiation of tropical lotus, Nelumbo nucifera Gaertn (Nelumbonaceae) from Australia, India, and Thailand Botanical Studies, 61(1) https://doi.org/10.1186/s40529020-00293-3 28 Moro, C F., Yonekura, M., Kouzuma, Y., Agrawal, G K., & Rakwal, R (2013) Lotus – A Source of Food and Medicine: Current Status and Future Perspectives in Context of the Seed Proteomics International Journal of Life Sciences, 7(1), 1–5 https://doi.org/10.3126/ijls.v7i1.6394 64 29 Nguyen.V.Q (2001) Exporting Lotus to Asia – an agronomic and physiological study Rural Industries Research & Development Corporation RIRDC Publication No 01/032 30 Pan, L., Quan, Z W., Hu, J H., Wang, G Y., Liu, S N., He, Y., Ke, W D., & Ding, Y (2011) Genetic diversity and differentiation of lotus (Nelumbo nucifera) accessions assessed by simple sequence repeats Annals of Applied Biology, 159(3), 428–441 https://doi.org/10.1111/j.1744-7348.2011.00509.x 31 Qichao, W and Z Xingyan (2005) Lotus flower cultivars in China China Forestry Publishing House Beijing, China 296 pages 32 Roy, S., Anwar, A., Tabassum, N., & Islam, M N Genotypic Variability Analysis of Lotus (Nelumbo nucifera Gaertn.) from Bangladesh using RAPD and SSR Markers (2022) Plant Tissue Culture and Biotechnology, 32(1), 77–87 DOI: https://doi.org/10.3329/PTCB.V32I1.60474 33 Savolainen, V., Chase, M.W., (2003) A decade of progress in plant molecular phylogenetics Trends Genet, 19, 717–724 DOI: 10.1016/j.tig.2003.10.003 PMID: 14642753 34 Sayre J (2004) Propagation protocol for American Lotus (Nelumbo lutea Willd.) Native plants Journa, 1: 14-17 35 Sheikh, S A (2014) Ethno-medicinal uses and pharmacological activities of lotus (Nelumbo nucifera) Journal of Medicinal Plants Studies JMPS, 2(6), 42–46 36 Sruthi, A., Panjikkaran, S T., Aneena, E R., Pathrose, B and D M (2019) Insights into the composition of lotus rhizome Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 8(3), 3550–3555 37 Tian D (2008) Container production and post-harvest handling of lotus (Nelumbo) and Micropropagation of herbaceous peony 65 (Paeonia) Ph D Dissertation, aubern University, Department of Horticulture 292 pp 38 Tungmunnithum, D., Pinthong, D., & Hano, C (2018) Flavonoids from Nelumbo nucifera Gaertn., a Medicinal Plant: Uses in Traditional Medicine, Activities Phytochemistry Medicines, and Pharmacological 5(4), 127 https://doi.org/10.3390/medicines5040127 39 Warner Orozco-Obando, Ken Tilt, and Bernice Fischman (2009) Is Lotus an ornamental Plant or a Vegetable? Yes! Water Gardeners International online Journal, Vol.4, N0 40 Xueming H (1987) Lotus of China Wuhan Botanical Institue 41 Xue, J., Zhuo, L., & Zhou, S (2006) Genetic diversity and geographic pattern of wild lotus (Nelumbo nucifera) in Heilongjiang Province Chinese Science Bulletin, 51(4), 421–432 https://doi.org/10.1007/s11434-006-0421-0 42 Yoo, J., Park, E., Kim, S H., & Lee, H.-J (2020) Gastroprotective Effects of Fermented Lotus Root against Ethanol/HCl-Induced Gastric Mucosal Acute Toxicity in Rats Nutrients, 12(3), 808–821 DOI:10.3390/nu12030808 43 Zaidi A., Srivastava A.K., Ahmad S (2020) Nutritional And Therapeutic Importance Of Nelumbo Nucifera (Sacred Lotus) Era’s Journal of medical research, 6(2): 98-102 44 Zhu, Hh., Yang, Jx., Xiao, Ch et al Differences in flavonoid pathway metabolites and transcripts affect yellow petal colouration in the aquatic plant Nelumbo nucifera BMC Plant Biol 19, 277 (2019) https://doi.org/10.1186/s12870-019-1886-8 Tài liệu Internet 66 45 TDV (2015) Hồn sen văn hóa người Việt Truy cập ngày 15/11/2022 https://tuoitre.vn/hon-sen-trong-van-hoa-nguoi-viet767217.htm 46 Lotus Flowers: Meaning and Care Truy cập ngày 15/11/2022 tại: https://www.flowerglossary.com/lotus-flowers-meaning/ 47 Hình tượng hoa sen văn hóa người Việt Nam Truy cập ngày 15/11/2022 tại: https://www.vietnamplus.vn/hinh-tuong-hoasen-trong-van-hoa-cua-nguoi-viet-nam/186466.vnp 48 Nguyễn Văn Ngưu (2019) Hoa sen văn hóa Việt Nam Truy cập ngày 15/11/2022 tại: http://viethocjournal.com/2019/07/hoa-sentrong-van-hoa-viet-nam/ 49 Tra cứu dược liệu online Truy cập ngày 15/11/2022 tại: https://tracuuduoclieu.vn/sen-vt.html 50 Dược điển Việt Nam online Truy cập ngày 15/11/2022 tại: https://duocdienvietnam.com/ 51 Zhou Lihua & Yang Cheng (2020) Wuhan presents its fine treasures: Lotus flowers Truy cập ngày 8/2/2023 tại: https://global.chinadaily.com.cn/a/202007/02/WS5efd92d3a3108348 17256d28.html 67 PHỤ LỤC  Kết điện di sản phẩm PCR thị ISSR (1-30 số thứ tự tương ứng mẫu FL001 – mẫu FL030 LD LADDER) Kết điện di sản phẩm PCR với mồi UBC-807 Kết điện di sản phẩm PCR với mồi UBC-808 68 Kết điện di sản phẩm PCR với mồi UBC-811 Kết điện di sản phẩm PCR với mồi UBC-814 Kết điện di sản phẩm PCR với mồi UBC-824 69 Kết điện di sản phẩm PCR với mồi UBC-848 Kết điện di sản phẩm PCR với mồi UBC-873 Kết điện di sản phẩm PCR với mồi UBC-888 70 Kết điện di sản phẩm PCR với mồi UBC-889 Kết điện di sản phẩm PCR với mồi UBC-891  Kết điện di sản phẩm PCR thị ISSR Kết điện di sản phẩm PCR với mồi APH-18 71 Kết điện di sản phẩm PCR với mồi OPA-01 Kết điện di sản phẩm PCR với mồi OPA-02 Kết điện di sản phẩm PCR với mồi OPA-03 72 Kết điện di sản phẩm PCR với mồi OPC-01 Kết điện di sản phẩm PCR với mồi OPC-03 Kết điện di sản phẩm PCR với mồi OPD-02 73 Kết điện di sản phẩm PCR với mồi OPE-04 Kết điện di sản phẩm PCR với mồi OPE-18 Kết điện di sản phẩm PCR với mồi OPG-05 74