Hai mươi lăm primer ngẫu nhiên đã được sử dụng để phân tích đa hình DNA của 18 giống bưởi nghiên cứu. Kết quả phân tích sản phẩm PCR-RAPD trên gel agarose 1,4% cho thấy tổng cộng có 298 band DNA được tạo ra. Primer có số band DNA khuếch đại nhiều nhất là L17 (22 band), tiếp đến là C05 (21 band) và A02 (20 band). Hai primer có số band DNA khuếch đại ít nhất là B05 và AD10 (4 band). Trong số 25 primer sử dụng có 8 primer (A02, A18, B10, C02, C08, AD10, AT14, N06) cho sản phẩm khuếch đại ở tất cả 18 giống bưởi, tiếp theo là sáu primer (A04, C09, B17, AA10, N09, K16) với 17 giống được khuếch đại. Primer có số giống bưởi khuếch đại ít nhất là A01 (14 giống) (Bảng 3.2).
Bảng 3.2. Số cây khuếch đại và số band khuếch đại của từng primer
STT Primer Số cây khuếch đại Tổng số band DNA của từng primer Phạm vi kích thước band DNA (bp) Số band DNA đa hình (%) Số band DNA duy nhất 1 A01 14 6 346-838 100 0 2 A02 18 20 429-2.194 95,0 2 3 A04 17 12 287-1.431 100 1 4 A09 16 12 540-1.667 100 4 5 A11 16 16 476-2.079 100 4 6 A15 16 13 436-3.836 100 0 7 A18 18 6 359-2.353 83,33 2 8 AA10 17 9 429-2.259 100 2 9 AD10 18 4 400-982 100 1 10 AT14 18 12 335-1.997 91,67 2 11 B04 15 13 320-1.702 100 4 12 B05 16 4 630-1.187 100 0 13 B10 18 8 360-1.444 100 3 14 B17 17 6 471-1.779 100 1 15 C02 18 16 444-2.169 100 3 16 C04 16 11 352-1.733 100 3 17 C05 16 20 422-2.770 100 3 18 C08 18 10 346-1.317 100 3
19 C09 17 15 418-2.467 100 120 M20 16 15 313-1.913 100 1 20 M20 16 15 313-1.913 100 1 21 N02 16 12 302-1.932 100 3 22 N06 18 10 348-1.045 100 4 23 N09 17 12 497-1.813 100 4 24 L17 16 22 381-2.873 100 0 25 K16 17 13 425-2.525 100 4 Tổng 298 295 55
Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy, tất cả các primer đều biểu hiện sự đa hình, số lượng band khuếch đại là từ 4 đến 22 band tùy primer và mẫu DNA. Kích thước của các band khoảng từ 287 bp đến 3.836 bp. Trong số 298 band DNA tạo thành có 295 band là đa hình (98,99%), tỷ lệ band đa hình trên mỗi primer là 11,8; cao hơn so với nghiên cứu trên một số giống bưởi trồng ở Việt Nam của Nguyễn Xuân Thụ và cs (9,54) [17]. Tỷ lệ các band đa hình cao chứng tỏ các giống bưởi nghiên cứu có quan hệ di truyền xa nhau.
Trong số 295 band đa hình có đến 55 band DNA duy nhất, chiếm 18,46%. Các band DNA này chỉ xuất hiện ở một giống bưởi mà không xuất hiện ở các giống bưởi còn lại, do đó chúng rất có ý nghĩa trong nghiên cứu nhằm phân biệt các giống bưởi khác nhau. Trong 18 giống bưởi nghiên cứu có 14 giống được đặc trưng bởi ít nhất 1 band DNA duy nhất khi thực hiện phản ứng PCR-RAPD với 25 primer, trong đó nhiều nhất là giống bưởi Đường lá goắn tạo thành 9 band từ 6 primer, tiếp đến là giống bưởi Thái Lan có 5 band từ 5 primer và bưởi Trắng có 5 band từ 4 primer. Như vậy có thể bước đầu nhận định rằng ba giống bưởi này có sự sai khác đáng kể so với các giống còn lại. Bốn giống bưởi không tạo thành band duy nhất với tất cả primer sử dụng là bưởi Da xanh, bưởi Bành, bưởi Tàu và bưởi Hồng da xanh. Bảng 3.3 biểu thị các chỉ thị RAPD đặc hiệu cho 14 trong
Bảng 3.3. Các chỉ thị RAPD đặc trưng cho các giống bưởi nghiên cứu
Giống Chỉ thị RAPD đặc trưng
Bưởi Thanh trà C09-1.289, AT14-589, AT14-335, N06-443 Bưởi Năm roi AA10-740, B10-360, N09-880, N09-540 Bưởi Phúc Trạch A09-1.667, AD10-500, M20-542
Bưởi Láng A04-287, A18-726, N02-836, N06-655 Bưởi Trẹm A11-674, A18-1.811
Bưởi Thanh du K16-2.027
Bưởi Đỏ B04-1.143, C04-890, N02-325, N02-302 Bưởi Cốm A02-2.194, B04-520, B04-320
Bưởi Trắng A11-782, C04-1.041, C08-630, C08-477, N06-885 Bưởi Thái Lan A02-1.031, A09-1.092, A11-1.002, B17-471, C08-675 Bưởi Trụ lông C02-680, B10-1.094, B10-855
Thanh trà Tiên Phước A11-476, C02-771, K16-1.222, K16-737
Bưởi Đường lá goắn A09-1.372, A09-1.166, AA10-882, C02-1.004, C05-2.027, C05-811, N09-1.099, N09-904, K16-818
Bưởi Hải Phòng N06-762, B04-1.702, C04-352, C05-706
Hình 3.2. Hình ảnh điện di PCR-RAPD với primer A04
416 bp780 bp 780 bp 23130 bp 4361 bp 2027 bp 564 bp 287 bp 1237 bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Hình 3.2 biểu thị kết quả điện di sản phẩm PCR-RAPD của 18 giống bưởi nghiên cứu với primer A04, trong đó có band A04-287 đặc trưng cho giống bưởi Láng.
Trong số 25 primer sử dụng có 21 primer có khả năng tạo thành ít nhất 1 band DNA duy nhất đặc trưng cho một giống bưởi nào đó. Có 6 primer tạo thành nhiều band DNA duy nhất (4 band) là B04, A11, A09, N09, K16 và N06. Kết quả điện di với primer N06 (Hình 3.3) gồm có 4 band DNA duy nhất, đặc trưng cho các giống là bưởi Trắng (N06-885), bưởi Hải Phòng (N06-762), bưởi Láng (N06-665) và bưởi Thanh trà (N06-443).
Hình 3.3. Hình ảnh điện di PCR-RAPD với primer N06
Như vậy, tùy thuộc vào giống bưởi xác định cần nghiên cứu có thể sử dụng primer thích hợp để phân biệt nó với các giống còn lại. Ví dụ như sử dụng primer AA10 để xác định bưởi Năm roi (AA10-742) và bưởi Đường lá goắn (AA10-882); primer B04 xác định bưởi Đỏ (B04-1.143), bưởi Cốm (B04-520 và
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 348 bp 348 bp 23130 bp 4361 bp 2027 bp 564 bp 443 bp 1045 bp 590 bp
B04-320) và bưởi Hải Phòng (B04-1.702); primer B17 xác định bưởi Thái Lan (B17-471);…
Một số công trình của nhiều tác giả nhằm xác định sự đa dạng di truyền của các giống thuộc chi Citrus cũng đã xác định được các chỉ thị đặc hiệu cho các mẫu thí nghiệm, như Filho và cs (1998) trong nghiên cứu sự tương đồng di truyền trên 35 mẫu quýt đã xác định đươc các chỉ thị RAPD đặc hiệu cho một số mẫu như ‘Shekwasha’ (OPA01-1.720, OPH15-1.260, OPA14-690), ‘Murcott’ (OPH15-950) và ‘Heennaran’ (OPN14-2.000) [31]; Corazza-Nunes và cs (2002) trong nghiên cứu đa dạng di truyền của 38 mẫu bưởi chùm (Citrus paradisi Macf.) và 3 mẫu bưởi (C. maxima (Burm.) Merr..) đã xác định được các chỉ thị đặc hiệu cho ‘Siamesa-Filipinas’ (OPB17-1.640), ‘do Cabo’ (OPC6-1.285) và ‘Pernambuco’ (OPB7-447) [32].
Kết quả điện di sản phẩm PCR-RAPD của cả 25 primer chỉ tạo thành 3 band đơn hình, đó là các band A02-1.454, A18-359 và AT14-782. Số lượng các band đơn hình thấp cho thấy 18 giống bưởi nghiên cứu rất khác biệt về mặt di truyền. Hình ảnh điện di của các giống nghiên cứu bởi primer A18 được trình bày ở hình 3.2. Trong số 6 band DNA được tạo thành có 5 band đa hình (2 band duy nhất) và 1 band đơn hình (A18-359). Mặc dù số band DNA tạo thành không nhiều nhưng tính đa hình giữa các mẫu nghiên cứu được thể hiện khá rõ. Kết quả này tương tự với kết quả của Shaanban và cs (2006) khi sử dụng primer A18 nhằm xác định sự đa dạng di truyền của 7 mẫu cam địa phương. Có tổng cộng 50 band DNA được tạo thành và tất cả đều là band đa hình, thể hiện sự khác biệt giữa các mẫu nghiên cứu [60].
23130 bp 359 bp 359 bp 525 bp 726 bp 1221 bp 2353 bp 564 bp 2027 bp 4361 bp
Hình 3.4. Hình ảnh điện di PCR-RAPD với primer A18
Như vậy, trong tổng số 25 primer chúng tôi sử dụng để nghiên cứu có 8 primer cho sản phẩm khuếch đại ở tất cả 18 giống bưởi là A02, A18, B10, C02, C08, AD10, AT14 và N06. Primer có số giống bưởi khuếch đại ít nhất là A01 (14 giống). Primer có số band DNA khuếch đại nhiều nhất là L17 (22 band), hai primer có số band DNA khuếch đại ít nhất là B05 và AD10 (4 band). So với một số nghiên cứu khác trên các loài thuộc chi Citrus, kết quả nghiên cứu của chúng tôi có sự khác biệt, chẳng hạn như Elisiario và cs (1999) đã thu được 12 band DNA từ quýt Carvalhais với primer AD10 [35], Cevik và cs (2007) khi xây dựng bản đồ di truyền liên kết cho các loài thuộc chi Citrus đã thu được 10 band với primer B05 [28].
Đối với phản ứng PCR-RAPD, việc sàng lọc các primer ngẫu nhiên để chọn ra primer phù hợp cho từng đối tượng cụ thể là rất cần thiết. Nguyen Thanh Nhan và cs (2003) khi nghiên cứu đa dạng di truyền các loài thuộc chi Citrus ở
Việt Nam đã sàng lọc 15 primer thích hợp trong số 150 primer [53]; Cai và cs (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(1994) đã chọn lọc được 69 primer trong 140 primer để xây dựng giản đồ phả hệ của chi Citrus [26]. Qua kết quả nghiên cứu, chúng tôi xác định được 5 primer vừa có khả năng khuếch đại DNA ở cả 18 giống bưởi vừa có thể tạo thành nhiều band là A02 (20 band), C02 (18 band), AT14 (12 band), C08 và N06 (10 band). Các primer này rất phù hợp cho mục đích nghiên cứu sự đa hình giữa các giống bưởi và xác định khoảng cách di truyền giữa chúng.
Bảng 3.4. Số band khuếch đại của các cây với từng primer
Primer Số band của từng primer
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 A02 5 7 7 8 6 7 6 7 7 6 5 8 6 7 3 4 6 6 A04 4 3 6 3 9 8 8 8 11 9 7 5 5 5 1 1 0 4 A18 1 1 3 4 4 4 3 4 3 3 3 4 2 2 1 1 1 1 A15 0 2 3 10 12 12 11 11 11 11 11 5 11 4 0 3 5 2 C09 1 1 3 7 8 7 2 7 8 9 7 4 4 2 0 4 2 3 B05 2 2 2 3 3 3 3 2 2 2 2 2 2 1 0 0 1 1 B10 3 2 3 2 2 2 2 1 1 2 2 2 1 2 3 2 2 2 B17 1 1 2 4 4 4 2 2 4 3 3 1 1 2 0 1 1 1 C02 7 8 9 9 10 10 9 8 10 10 10 8 8 8 1 8 8 8 C04 3 3 4 4 7 6 4 4 6 8 6 4 5 4 0 2 0 4 B04 0 0 3 7 6 7 5 3 4 8 6 6 3 3 0 5 3 4 C05 0 4 2 9 11 11 11 10 13 13 11 10 10 11 0 10 8 9 C08 1 3 2 2 1 1 1 1 2 2 2 3 3 4 1 3 2 2 AA10 3 4 3 4 3 3 4 4 2 4 5 4 4 4 0 1 3 3 AD10 2 3 3 3 3 3 3 2 3 3 2 2 2 2 2 1 1 2 A11 0 9 6 10 10 10 10 11 10 10 10 7 9 7 0 7 7 10 A09 2 1 4 8 4 3 3 5 5 3 0 2 4 6 0 3 6 4 A01 0 0 1 5 5 4 3 1 4 3 3 3 1 1 0 0 1 1 AT14 5 4 4 8 9 8 7 8 9 8 9 7 8 4 1 5 4 4 N09 2 3 3 3 4 3 2 3 3 3 4 4 4 4 0 4 4 3 L17 0 4 6 15 16 17 14 11 15 17 17 7 12 8 0 11 4 8 M20 0 2 5 10 10 9 7 5 8 10 8 6 8 7 0 7 7 8 K16 1 5 4 6 6 5 6 5 6 5 5 3 3 3 0 6 6 3 N06 3 3 4 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 3 1 4 3 4 N02 2 3 2 7 7 8 7 7 8 9 8 7 7 7 0 4 4 0 Tổng cộng 48 78 94 154 163 159 137 134 159 165 150 118 127 111 14 97 89 97
Theo bảng 3.4, giống có nhiều band DNA khuếch đại nhất với các primer sử dụng là bưởi Đỏ (165 band), chiếm tỷ lệ 55,37% tổng số band DNA tạo thành,
tiếp đến là bưởi Bành (163 band), bưởi Láng và bưởi Thanh du (cùng 159 band). Số band DNA lớn nhất mà một giống bưởi có thể tạo thành với một primer là 17 band, đó là bưởi Đỏ và bưởi Hồng da xanh cùng tạo thành 17 band với primer L17 (hình 3.5)
Hình 3.5. Hình ảnh điện di PCR-RAPD với primer L17
Trong 18 giống bưởi nghiên cứu, hầu hết đều cho kết quả khuếch đại tốt với 25 primer sử dụng, chỉ có bưởi Thanh trà và bưởi Trụ lông cho hiệu quả khuếch đại kém hơn với 48 và 14 band tạo thành. Bưởi Trụ lông chỉ tạo thành sản phẩm khuếch đại trong phản ứng PCR-RAPD ở 9/25 primer (A02, A04, A18, B10, C02, C08, AD10, AT14 và N06), trong đó 6 primer có sản phẩm tạo thành chỉ gồm 1 band, một primer tạo thành 2 band và 2 primer tạo thành 3 band. Nếu so sánh với sản phẩm PCR-RAPD của các giống bưởi còn lại thì đây là giống bưởi có sự khác biệt lớn nhất. Kết quả điện di sản phẩm PCR-RAPD của 18 giống bưởi bởi primer AT14 được trình bày ở hình 3.6. Primer này tạo thành 12 band khi thực hiện phản ứng PCR-RAPD với 18 giống bưởi nghiên cứu, trong đó có 3 giống tạo thành 9 band (bưởi Bành, bưởi Thanh du và bưởi Hồng da xanh). Giống bưởi Trụ lông chỉ tạo thành duy nhất band AT14-782.
602 bp 381 bp 381 bp 960 bp 1344 bp 2547 bp 564 bp 2027 bp 4361 bp 23130 bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Hình 3.6. Hình ảnh điện di PCR-RAPD với primer AT14