Nghiên cứu đa dạng di truyền một số giống gấc (momordica cochinchinensis (lour ) spreng) thu thập ở việt nam bằng chỉ thị phân tử DNA

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tôi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2016 Tác giả luận văn Phùng Thị Hương i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn, nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy cô giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc TS Nguyễn Văn Khiêm TS Nguyễn Xuân Cảnh tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian tạo điều kiện cho suốt trình học tập thực đề tài Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới anh chị, cán công tác Bộ môn Giống Công Nghệ Sinh Học – Trung tâm Nghiên cứu Trồng Chế biến thuốc Hà Nội – Viện Dược Liệu, Ban giám đốc Trung tâm, tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ trình làm luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học toàn thể thầy, cô giáo truyền đạt cho kiến thức, kĩ quý báu suốt thời gian học tập rèn luyện Học Viện Nông nghiệp Việt Nam Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán viên chức, anh chị em công tác Bộ môn Đa dạng sinh học nông nghiệp – Trung tâm tài nguyên thực vật- Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện tốt cho trình công tác nghiên cứu khoa học vừa qua Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè động viên, giúp đỡ, làm động lực cho trình học tập, nghiên cứu khoa học sống Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2016 Học viên Phùng Thị Hương ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN .ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1.2 MỤC ĐÍCH, Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU .4 2.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY GẤC 2.2 CÁC CHỈ THỊ TRONG ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN .8 Vùng gen ITS (Internal transcribed spacer) 12 2.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU GẤC TRÊN THẾ GIỚI 14 2.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU GẤC Ở VIỆT NAM 17 Một số nghiên cứu xác định trình tự vùng ITS gen ribosome DNA nhân Chẳng hạn, Nhân Dũng Đỗ Tấn Khang (2009) nghiên cứu đa dạng di truyền 36 giống soài Việt Nam Thái Lan phân tích trình tự vùng ITS gen ribosome nhân AFLP .20 PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 21 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .29 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 iii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Danh sách nguồn gốc mẫu giống gấc nguồn gốc thu thập.Error: Reference source not found Bảng 3.2 Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu Error: Reference source not found Bảng 3.3 Thành phần nồng độ chất cho phản ứng PCR Error: Reference source not found Bảng 4.1 Hàm lượng DNA tổng số mẫu giống gấc Error: Reference source not found Bảng 4.2 Mức độ tương đồng giống gấc giải trình tự gen ITS Error: Reference source not found Bảng 4.3 Mức độ tương đồng giống gấc giải trình tự gen rbcL.Error: Reference source not found Bảng 4.4 Mức độ tương đồng giống gấc giải trình tự gen rpl20 Error: Reference source not found Bảng 4.5 Mức độ tương đồng giống gấc giải trình tự gen psbA Error: Reference source not found Bảng 4.6 Mức độ tương đồng giống gấc giải trình tự gen trnL Error: Reference source not found iv DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Hình thái gấc (bên trái), hoa gấc (ảnh phải) Error: Reference source not found Hình 2.2 Phân biệt gấc nếp, gấc tẻ Error: Reference source not found Hình 2.3 Các công dụng gấc Error: Reference source not found Hình 2.4 Sơ đồ vùng ITS gen ribosome DNA nhân thực vật bậc cao Error: Reference source not found Hình 2.5 Mô hình không gian RuBisCO với tiểu phần lớn, tiểu phần nhỏ Error: Reference source not found Hình 2.6 Cấu trúc hóa học β-carotene lycopen gấc Error: Reference source not found Hình 4.1 Ảnh điện di sản phẩm DNA tổng số giống gấc Error: Reference source not found Hình 4.2 Ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen ITS mẫu giống gấc M1-M14) M: DNA Marker Error: Reference source not found Hình 4.3 Ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen rbcL mẫu giống gấc (M1-M14) M: DNA Marker Error: Reference source not found Hình 4.4 Ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen rbl20 mẫu giống gấc (M1-M14) M: DNA Marker Error: Reference source not found Hình 4.5 Ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen psbA mẫu giống gấc khác (M1-M14) M: DNA Marker Error: Reference source not found Hình 4.6 Ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen trnL mẫu giống gấc khác (M1-M14) M: DNA Marker Error: Reference source not found Hình 4.7 Trình tự gen đích mẫu giống gấc M1 máy đọc trình tự (A): ITS, (B): rpl20, (C): psbA, (D): trnL, (E): rbcL Error: Reference source not found Hình 4.8: Kết Blast mẫu M1 với gen đích khác (A): Blast gen ITS, (B): Blast gen rbcL, (C): Blast gen rpl20, (D): Blast gen psbA, (E): Blast gen trnl Error: Reference source not found Hình 4.9 Căn trình tự gen ITS .Error: Reference source not found Hình 4.10 Cây phát sinh di truyền giống gấc dựa trình tự ITS .Error: Reference source not found Hình 4.11 Căn trình tự gen rbcL .Error: Reference source not found v Hình 4.12 Cây phát sinh di truyền giống gấc dựa trình tự gen rbcl Error: Reference source not found Hình 4.13 Căn trình tự gen psbA Error: Reference source not found Hình 4.14 Cây phát sinh di truyền giống gấc dựa trình tự gen psbA Error: Reference source not found Hình 4.15 Căn trình tự gen rpl20 .Error: Reference source not found Hình 4.16 Cây phát sinh di truyền giống gấc dựa trình tự gen rpl20 Error: Reference source not found Hình 4.17 Căn trình tự gen trnL .Error: Reference source not found Hình 4.18 Cây phát sinh di truyền giống gấc dựa trình tự gen rpl20 Error: Reference source not found vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT bp: Base pair (Cặp bazơ) CS: cộng DNA: Deoxyribonucleic axit dNTPs: Deoxyribonucleotide triphosphates kb: Kilobase RNA: Ribonucleic axit PCR: Polymerase chain reaction PCR-RFLP: Polymerase chain reaction – Restriction fragment length polymorphism OD: Mật độ quang Na2EDTA: Ethylene diamine tetra acetate sodium SDS: Sodium dodecyl sulfate TE: Tris EDTA TAE: Tris Acetate EDTA BLAST: Basic Local Alignment Search Tool vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Nghiên cứu đa dạng di truyền số giống gấc (Momordica cochinchinensis (Lour.) Spreng) thu thập Việt Nam thị phân tử DNA” Gấc loại giàu dinh dưỡng loại dược liệu tốt, nhu cầu sản xuất dược liệu từ gấc ngày cao đời sống Gấc trồng chủ yếu từ nguồn gen hỗn tạp địa phương nên suất, chất lượng chưa cao Hiểu biết thông tin di truyền sở cho chiến lược chọn tạo giống gấc nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen gấc nước ta quan tâm Từ thực tế đó, tiến hành đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền số giống gấc (Momordica cochinchinensis (Lour.) Spreng) thu thập Việt Nam thị phân tử DNA” Đề tài đánh giá đa dạng di truyền 14 mẫu giống gấc sở phân tích trình tự gen DNA nhân ITS, DNA lục lạp trnL, rpl20, rbcL, psbA; từ hỗ trợ công tác chọn giống gấc suất cao, chất lượng tốt phục vụ ngành sản xuất, chế biến gấc Việt Nam Kết nghiên cứu khuếch đại giải trình tự thành công vùng gen 14 mẫu giống gấc ITS kích thước 727 bp, rbcL kích thước 703 bp, rpl20 kích thước 765 bp, psbA kích thước 277-279 kb trnL kích thước 939 bp Các mẫu giống giải trình tự tương đồng với loài Momordica cochinchinensis Phân tích trình tự mẫu giống gấc cho thấy có đa dạng di truyền cao mẫu nghiên cứu: M13 (Gia Lai) khác biệt so với mẫu giống lại, có trình tự psbA giống hệt M14 (TP.HCM) M14 (TP.HCM) M5 (Từ Sơn, Bắc Ninh) có trình tự ITS rbcL giống Điều cho thấy mẫu giống có nguồn gốc chung M2, M4, M5, M6, M8, M9, M11, M12, M13 có trình tự pspA rpl20 giống M7 có nhiều sai khác so với mẫu giống lại lại có vị trí sai khác giống hệt so với M2 trình tự ITS, nên coi mẫu giống gần M8 (Hải Dương), M9 (Hà Nam) gần THESIS ABSTRACT viii RESEARCH ON GENETIC DIVERSITY OF SOME VARIETIES GAC (MOMORDICA COCHINCHINENSIS (LOUR.) SPRENG) IN VIETNAM BY DNA MOLECULAR MARKERS Gac (Momordica cochinchinensis) is a nutritious fruit and is also a good medicine Gac is grown in Vietnam using mainly from the local resources with high heterogeneity Threrefore, the productivity, the quality is not high Understanding about genetic information of gac genetic resources is important for breeding research However, up to now there is not much about genetic information in our country other countries From this fact, we have carried out the project "Research on genetic diversity of some varieties Gac (Momordica cochinchinensis (Lour.) Spreng.) in Vietnam by DNA molecular markers" Genetic diversity of 14 isolates collected from 12 provinces in Vietnam analyzed on the basis of the DNA sequence of genomic DNA such as ITS region, and chloroplast DNA such as trnL, rpl20, rbcL, psbA genes These genes were isolated, amplified and sequenced from isolates ITS region is 727 bp, genes such as rbcL is 703 bp, rpl20 is 765 bp, psbA is 277-279 bp and trnLis 939 bp in length All genes sequences are matched with genes sequences of Momordica cochinchinensis, that submitted on NCBI, respectively M13 (derived from Gia Lai province) is different compared with the other isolates, but identical sequences of psbA of M14 (derived from HCM city) M14 and M5 (from Tu Son, Bac Ninh province) have ITS region and rbcL gene sequence of similarity M5 (from Tu Son, Bac Ninh) and M6 (from Thuan Thanh, Bac Ninh province) have identical sequences of psbA gene This suggests that they could be have common origin M2, M4, M5, M6, M8, M9, M11, M12, have sequence similarity of rpl20 and pspA genes M7 is different from other isolates based on ITS region Our sequence analysis results have showed that high genetic diversity among Gac isolates in Vietnam ix PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Cây gấc với tên khoa học Momordica cochinchinensis (Lour.) Spreng thuộc họ Cucurbitaceae, loại thực vật có nguồn gốc Việt Nam nước Đông Nam Á Gấc loại giàu dinh dưỡng loại dược liệu tốt Tại Việt Nam, thịt gấc sử dụng chủ yếu để nhuộm màu xôi gọi xôi gấc, từ cách lâu, dân gian ta biết dùng gấc để giúp sáng mắt phòng ngừa bệnh mắt nhức mỏi mắt, khô mắt Quả gấc có hàm lượng lycopen cao, chất chống oxy hóa liên quan đến việc ngăn chặn phát triển tế bào ung thư thể người Gần đây, gấc bắt đầu tiếp thị khu vực châu Á dạng nước ép trái bổ dưỡng, dầu gấc có chứa hàm lượng tương đối cao dinh dưỡng Gấc đặc biệt giàu lycopene Theo tỷ lệ khối lượng, chứa nhiều lycopene gấp 70 lần cà chua Người ta phát thấy chứa β-caroten nhiều gấp 10 lần cà rốt khoai lang Ngoài ra, carotenoit có mặt gấc liên kết với axít béo mạch dài, tạo kết có tính hoạt hóa sinh học cao Một nghiên cứu gần cho thấy gấc chứa loại protein ngăn cản phát triển tế bào ung thư (Ishida et al., 2004) Với nhận thức công dụng gấc mang lại cho người, nhu cầu sản xuất dược liệu từ gấc để sản xuất thuốc thực phẩm chức ngày cao đời sống Gấc trồng nhiều tỉnh phạm vi nước để phục vụ nhu cầu nước xuất Các nghiên cứu cho thấy suất chất lượng gấc phụ thuộc nhiều vào giống, canh tác, vùng sản xuất Gấc trồng nước ta chủ yếu lấy từ nguồn gen hỗn tạp địa phương Nhìn chung, giống gấc chưa tuyển chọn, chọn lọc suất, chất lượng chưa cao Tuy nhiên, nghiên cứu đánh giá, chọn lọc giống gấc cho suất hàm lượng hoạt chất cao theo phương pháp cổ điển tốn nhiểu thời gian cho kết xác phụ thuộc vào ngoại cảnh Vấn đề đặt cần tuyển chọn giống gấc có tiềm năng suất hàm lượng hoạt chất cao phục vụ nhu cầu thị hiếu người tiêu dùng xuất Hiểu biết thông tin di truyền quan trọng, làm sở cho chiến lược chọn tạo giống gấc Nói chung nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen gấc nước ta quan tâm PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết so sánh trình tự ITS mẫu giống gấc Mẫu M1 Mẫu M2 Mẫu M4 62 Mẫu M5 Mẫu M6 Mẫu M7 Mẫu M8 63 Mẫu M10 Mẫu M11 Mẫu M13 Mẫu M14 64 Phụ lục 2: Kết so sánh trình tự rbcL mẫu giống gấc Mẫu M1 Mẫu M3 Mẫu M4 Mẫu M5 Mẫu M6 65 Mẫu M7 Mẫu M8 Mẫu M9 Mẫu M13 Mẫu M14 66 Phụ lục 3: Kết so sánh trình tự rpl20 mẫu giống gấc Mẫu M1 Mẫu M3 Mẫu M4 Mẫu M5 67 Mẫu M6 Mẫu M7 Mẫu M8 Mẫu M9 68 Mẫu M10 Mẫu M11 Mẫu M12 69 Phụ lục 4: Kết so sánh trình tự psbA mẫu giống gấc Mẫu M1 Mẫu M2 Mẫu M3 Mẫu M4 Mẫu M5 70 Mẫu M6 Mẫu M7 Mẫu M8 Mẫu M9 Mẫu M10 71 Mẫu M11 Mẫu M12 Mẫu M13 Mẫu M14 72 Phụ lục 5: Kết so sánh trình tự trnl mẫu giống gấc Mẫu M1 Mẫu M3 Mẫu M4 Mẫu M5 Mẫu M6 73 Mẫu M7 Mẫu M8 Mẫu M9 Mẫu M10 Mẫu M11 74 Mẫu M12 Mẫu M13 Mẫu M14 75 [...]... truyền một số giống gấc (Momordica cochinchinensis (Lour. ) Spreng) thu thập ở Việt Nam bằng chỉ thị phân tử DNA Đề tài sẽ đánh giá đa dạng di truyền các giống gấc trên cơ sở phân tích trình tự các gen ở DNA nhân như ITS, và DNA lục lạp là trnL, rpl20, rbcL, psbA; từ đó hỗ trợ cho công tác chọn giống gấc năng suất cao, chất lượng tốt phục vụ cho ngành sản xuất, chế biến gấc ở Việt Nam 1.2 MỤC ĐÍCH, Ý NGHĨA... cơ sở biểu hiện của kiểu hình Một số nghiên cứu đã xác định trình tự vùng ITS của gen ribosome DNA nhân Chẳng hạn, Nhân Dũng và Đỗ Tấn Khang (200 9) đã nghiên cứu đa dạng di truyền 36 giống soài ở Việt Nam và Thái Lan bằng phân tích trình tự vùng ITS của gen ribosome nhân và AFLP Với hiểu biết của chúng tôi, có ít nghiên cứu ở nước ta về nghiên cứu đa dạng di truyền DNA của các giống gấc trên cơ sở trình... 2.2.3 Chỉ thị phân tử DNA Chỉ thị phân tử DNA là đoạn DNA hoặc trình tự gen nằm trên NST của nhân hoặc ty thể, lạp thể liên kết với gen hoặc tính trạng (Srivatsava et al, 200 9) Chỉ thị phân tử DNA có chính xác và tin cậy cao bởi vì thông tin di truyền là duy nhất không phụ thu c vào tuổi, các điều kiện sinh lý và môi trường Chỉ thị phân tử DNA là công cụ rất hữu ích trong nghiên cứu phân loại, nhận dạng, ... thu thập ở Việt Nam Hệ số tương tự di truyền dao động từ 0,63-0,90% và cho thấy có thể sử phân biệt cây cái và đực bằng chỉ thị DNA và khẳng định biểu hiện giới tính ở gấc có liên quan đến chỉ thị PCR-RAPD Hyun et al (201 2) đã nghiên cứu sàng lọc những gen liên quan sinh tổng hợp carotenoid ở gấc Bharathi et al (201 1) đã phân tích phân loại tế bào học một số loài trong chi Momordica đang được trồng ở. .. được một số vùng gen đặc thù của các giống gấc như ITS, trnL, rpl20, rbcL, psbA và đánh giá được mối quan hệ di truyền giữa các giống gấc thu thập từ một số tỉnh khác nhau ở Việt Nam 1.1.2 Ý nghĩa khoa học Gấc là loài cây đặc hữu của Việt Nam, tuy nhiên cho đến nay có ít nghiên cứu về các vùng gen ở cây gấc Nghiên cứu thành công của đề tài góp phần đánh giá quan hệ di truyền, nhận dạng các giống gấc. .. đã nghiên cứu phân tích bổ sung thành phần carotenoid trong quả gấc và sử dụng trong lâm sàng để phục vụ nhu cầu phòng bệnh và điều trị vết thương, đề phòng ung thư gan nguyên phát (Vuong, 200 0) Một số nghiên cứu về sinh học phân tử ở gấc đã được thực hiện Bootprom và cs (201 2) đã nghiên cứu mối quan hệ di truyền 25 mẫu giống gấc trong đó có 23 mẫu giống gấc thu thập ở Thái Lan và 2 mẫu giống gấc thu. .. loài Momordica cochinchinensis là nhị bội có 2n=28 NST Mặc dù có rất nhiều nghiên cứu về gấc nhưng chưa có nghiên cứu nào phân tích mối liên hệ giữa các giống gấc bằng phân tích trình tự vùng ITS để từ đó chọn lọc ra các giống gấc có năng suất và hàm lượng hoạt chất cao Cho đến nay đã có một số nghiên cứu xác định trình tự vùng ITS, đánh giá đa dạng di truyền, mối liên quan hệ di truyền các giống và... giữa các giống cây trồng) thì các sản phẩm biểu hiện gen (protein, enzyme ) không cho sự đa hình rõ ràng Đây là một nhược điểm của chỉ thị hóa sinh cùng với tính không độc lập với điều kiện môi trường (do quá trình biểu hiện gen thay đổi ở các điều kiện sinh trưởng khác nhau) và số lượng chỉ thị đa hình không phong phú Bởi vậy trong hầu hết những nghiên cứu đa dạng di truyền ngày nay, chỉ thị DNA được... cây thu c Li et al (201 2) đã nghiên cứu xác định đa dạng di truyền trong 8 quần thể của loài ngưu tất (Achyranthes bidentata) họ Amaranthaceae thu thập từ 8 vùng của 3 tỉnh của Trung Quốc trên cơ sở trình tự vùng ITS của gen ribosome DNA nhân, làm cơ sở bảo tồn và chọn tạo giống ngưu tất Choudhary et al (201 1) đã nghiên cứu đa dạng di truyền trong các quần thể loài cây thu c Persicaria barbata (L .) H... và phân bố cây gấc Cây gấc có nguồn gốc ở Việt Nam và các nước Đông Nam Á với tên khoa học là Momordica cochinchinensis (Lour. ) Spreng, họ Cucurbitaceae Hiện nay, gấc cũng được trồng ở một số nước châu Á như Bangladesh (Hasan et al., 198 7), Trung Quốc (Iwamoto et al., 198 5), và Ấn Độ (Shadeque and Baruah, 198 4) Tuy nhiên, gấc trồng ở miền Bắc Việt Nam cho năng suất, chất lượng cao (Vuong, 200 0) Gấc