Nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn giống lúa chất lượng bản địa việt nam bằng chỉ thị phân tử SSR

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/truyền tập đoàn giống lúa chất lượng bản địa Việt Nam bằng chỉ thị phân tử SSR microsatellite’’ nhằm đánh giá đa dạng di truyền,

Trang 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

VIỆN SINH THÁI TÀI NGUYÊN SINH VẬT

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Khuất Hữu Trung

HÀ NỘI, 2013

Trang 2

Cảm ơn Ban Chủ Nhiệm Để Tài Nghị định thư Việt Nam và Vương quốc Anh cùng toàn thể các thành viên tham gia Đề tài đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành tốt bản luận văn

Và cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn sự động viên, giúp đỡ của gia đình, bạn bè và các bạn đồng nghiệp trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện bản luận văn này

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày… tháng… năm 2013

Học viên

Nguyễn Thị Ly

Trang 3

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, dưới sự chỉ bảo của thầy hướng dẫn và giúp đỡ của tập thể cán bộ nghiên cứu Bộ môn

Kỹ thuật Di truyền – Viện Di truyền Nông nghiệp Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa từng được công bố trong bất kì nghiên cứu nào khác

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên

Nguyễn Thị Ly

Trang 4

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ii

LỜI CAM ĐOAN iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC BẢNG x

DANH MỤC HÌNH xi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1.Vài nét sơ lược về cây lúa 4

1.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố của cây lúa 4

1.1.2 Phân loại lúa 6

1.2 Tài nguyên di truyền lúa Việt Nam 10

1.3 Các giống lúa chất lượng trên thế giới và ở Việt Nam 12

1.3.1 Các yếu tố cấu thành đặc tính chất lượng của lúa 14

1.3.2 Một số nghiên cứu về lai tạo các giống lúa chất lượng trên thế giới và ở Việt Nam 15

1.3.2.1 Trên thế giới 15

1.3.2.2 Ở Việt Nam 18

1.4 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền lúa bằng chỉ thị DNA 19

1.4.1 Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism - đa hình đoạn phân cắt giới hạn) 19

Trang 5

1.4.2 Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction

, PCR) 20

1.4.2.1 Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism - đa hình chiều dài đoạn nhân bội) 20

1.4.2.2 Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA - DNA đa hình được nhân bội ngẫu nhiên) 21

1.4.2.3 Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeats) 21

1.5 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền lúa trên thế giới và ở Việt Nam 24

1.5.1 Trên thế giới 24

1.5.2 Ở Việt Nam 27

1.6 Một số nghiên cứu sử dụng Marker phân tử trong nghiên cứu xác định gene thơm 29

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.1 Vật liệu nghiên cứu 34

2.1.1 Vật liệu 34

2.1.2 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 34

2.2 Phương pháp nghiên cứu 39

2.2.1 Tách chiết DNA tổng số 39

2.2.2 Phản ứng PCR 39

2.2.3 Chu trình PCR 40

2.2.4 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR 40

2.2.5 Phân tích và xử lý số liệu 41

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42

Trang 6

3.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số 423.2 Hệ số PIC, số allele và tổng số băng DNA thể hiện trên

từng cặp mồi 423.3 Tỷ lệ khuyết số liệu (M) và tỷ lệ dị hợp tử (H) của các

giống lúa chất lượng nghiên cứu 453.4 Xác định các allele hiếm xuất hiện trong tập đoàn lúa chất

lượng nghiên cứu 473.5 Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền của các giống lúa

chất lượng nghiên cứu 53

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

Trang 7

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ISSRs Inter - Simple Sequence Repeats

Trang 8

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

Taq polymerase Thermus aquaticus Polymerase

TGMS Temperature-sensitive genic male sterility

Trang 9

Trang 10

DANH MỤC BẢNG

Trang Bảng 1.1 Phân loại chi Oryza (Nguồn: Vaughan, 1994) 8

Bảng 1.2 Đặc trƣng hình thái và sinh lý tổng quát của 3 nhóm giống lúa 9

Bảng 2.1 Danh sách 50 giống lúa thu thập dùng trong nghiên cứu 34

Bảng 2.2 Thông tin về các cặp mồi trong nghiên cứu 35

Bảng 3.1 Số allele thể hiện và hệ số PIC của 31 cặp mồi SSR 42

Bảng 3.2 Tỷ lệ khuyết số liệu (M) và tỷ lệ dị hợp tử (H) của các giống

lúa chất lƣợng nghiên cứu

44

Bảng 3.3.Tổng hợp các allele hiếm xuất hiện ở các locus khác nhau

với các giống lúa khác nhau

47

Bảng 3.4: Mối quan hệ di truyền giữa 50 giống lúa chất lƣợng 55

Trang 11

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1.Sơ đồ tiến hoá của hai loài lúa trồng (Khush, 1997) 5 Hình 1.2.Vị trí gene thơm trên nhiễm sắc thể số 8 29 Hình 3.1 Sản phẩm DNA tổng số của 50 giống lúa nghiên cứu 40 Hình 3.2 Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa chất

lƣợng nghiên cứu với cặp mồi RM245 (M: marker

GeneRulerTM DNA Ladder Ultra low)

43

Hình 3.3 Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa chất

lƣợng nghiên cứu với cặp mồi RM337 (M: marker

GeneRulerTM DNA Ladder Ultra low)

43

Hình 3.4 Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa chất

lƣợng với cặp mồi RM135 (M: marker GeneRulerTM

DNA Ladder Ultra low)

48

Hình 3.5.Ảnh điện di sản phẩm PCR của 50 giống lúa chất

lƣợng với cặp mồi RM515 (M: marker GeneRulerTM

48

Hình 3.6 Ảnh điện di sản phẩm PCR của 50 giống lúa nghiên

cứu với cặp mồi RM153(M: marker GeneRulerTM

49

cứu với cặp mồi RM17 (M: marker GeneRulerTM

50

51

Hình 3.10 Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa các 54

Trang 12

giống lúa chất lƣợng nghiên cứu

Trang 13

MỞ ĐẦU

Lý do chọn đề tài

Lúa gạo là một trong những loại cây lương thực chủ yếu trên thế giới,

có vai trò rất quan trọng trong cả lĩnh vực kinh tế và vấn đề an ninh lương thực, là nguồn cung cấp lương thực chủ yếu ở châu Á và cho khoảng 2/3 dân

số thế giới Khi bắt đầu thực hiện cuộc cách mạng xanh, hầu hết các chương trình đều tập trung phát triển các giống lúa có tính trạng chống chịu sâu bệnh

và cho năng suất cao Bởi vậy, các giống lúa thơm đặc sản của địa phương nhưng năng suất thấp đã không được ưu tiên đưa vào sản xuất, thay vào đó là các giống lúa lai ngắn ngày, kháng sâu bệnh, năng suất cao và không thơm

(Bhattacharjeeet al., 2002) [24] Điều này dẫn đến sự tổn hại về mặt đa dạng

di truyền của các giống lúa thuần, đặc biệt là gây thất lạc một số giống lúa

thơm địa phương (Berneret al., 1986; Ghareyazieet al., 1997; Singhet al.,

2000) [23], [41], [71]

Tuy nhiên, trong vài thập kỷ gần đây, nhu cầu thị trường và thị hiếu của người tiêu dùng đã thay đổi, tập trung nhiều vào các sản phẩm gạo có chất lượng và hương thơm Do đó, các chương trình chọn tạo giống lúa luôn được chú trọng, đặc biệt nhu cầu về các giống lúa chất lượng cao ngày càng gia tăng trong những thập kỷ gần đây Gạo có chất lượng cao được xác định bởi nhiều yếu tố như hình dạng hạt, giá trị dinh dưỡng, hương thơm, chất lượng sau khi chế biến…Trong đó, hương thơm được xem là một trong những đặc tính quan trọng nhất Chọn tạo giống lúa nói chung, lúa chất lượng nói riêng đòi hỏi phải có các thông tin chính xác và các mẫu vật liệu ban đầu Những hiểu biết về đa dạng di truyền nguồn gene là điều kiện rất quan trọng

và cần thiết trong nghiên cứu chọn tạo giống cũng như trong sản xuất lúa chất

lượng Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đa dạng di

Trang 14

truyền tập đoàn giống lúa chất lượng bản địa Việt Nam bằng chỉ thị phân

tử SSR (microsatellite)’’ nhằm đánh giá đa dạng di truyền, nhận dạng chính

xác một số nguồn gene lúa bản địa quý, phục vụ cho công tác bảo tồn, khai thác và sử dụng có hiệu quả các nguồn gene lúa chất lượng bản địa của Việt

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Ý nghĩa khoa học

Hiểu biết về đa dạng di truyền của các nguồn gene lúa chất lượng tạo

cơ sở lý luận cho việc chọn lọc, phục tráng để nâng cao tiềm năng di truyền của các giống chất lượng trong sản xuất

Phát hiện sai khác di truyền của các giống lúa chất lượng có ý nghĩa quan trọng trong việc xác định các allele hiếm, allele đặc trưng để nhận dạng chính xác các nguồn gene ưu tú phục vụ nghiên cứu lai tạo giống và định hướng cho công tác thu thập bảo tồn đa dạng nguồn gene lúa chất lượng ở mức phân tử

Ý nghĩa thực tiễn

Trang 15

Nghiên cứu đa dạng di truyền thông qua các chỉ thị phân tử góp phần nâng cao hiệu quả công tác bảo tồn, chọn và lai tạo giống lúa có phẩm chất gạo tốt, năng suất cao

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng

Đối tượng nghiên cứu là tập đoàn 50 giống lúa chất lượng của Việt Nam Các giống này đang được lưu giữ và bảo tồn tại ngân hàng gene Cây trồng Quốc gia (Trung tâm Tài nguyên Thực vật) và ngân hàng gene của Viện Lúa đồng bằng sông Cửa Long

Phạm vi nghiên cứu

Đề tài nghiên cứu, đánh giá nguồn gene ở mức phân tử bằng chỉ thị SSR Các thí nghiệm được tiến hành tại Bộ môn Kĩ thuật Di truyền - Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam

Đề tài được thực hiện trong khuôn khổ nội dung của đề tài Nghị định thư Việt Nam và Vương Quốc Anh: “Nghiên cứu giải mã genome một số giống lúa địa phương của Việt Nam”

Trang 16

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.Vài nét sơ lược về cây lúa

1.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố của cây lúa

Tổ tiên cây lúa đã tồn tại từ đầu kỷ Phấn trắng Vào giữa kỷ này, xuất

hiện một trong những loại nguyên thuỷ nhất thuộc tộc Oryzae, đó là loại Streptochasta Schrad Đến cuối kỷ Phấn trắng xuất hiện loại tre (Bambusa) và loại lúa (Oryza) Một số loại khác xuất hiện muộn hơn vào kỷ thứ ba, thời kỳ phát triển mạnh nhất của họ Hoà thảo (Gramineae) Các loài lúa Oryza spp

có cùng tổ tiên chung vào thời địa cầu Gondwanaland, sau khi trái đất tách rời thành năm lục địa [19]

Theo Chang (1985), lúa trồng Oryza sativa được tiến hoá từ cây lúa dại hàng năm Oryza nivara Do thích ứng với điều kiện khí hậu, đặc biệt là nhiệt độ, lúa Oryza sativa tiếp tục tiến hoá theo ba nhóm: Indica thích hợp với khí hậu nhiệt đới, Japonica thích ứng với khí hậu lạnh và cho năng suất cao, Javanica có đặc tính trung gian [30] Theo một số tác giả khác, Oka (1988), lại cho rằng Oryza sativa có nguồn gốc từ cây lúa dại lâu năm Oryza rufipogon [60]; Cheng (2003), khi nghiên cứu di truyền tiến hoá của 101 giống lúa, bao gồm cả lúa trồng và lúa dại cho thấy loài lúa trồng Oryza sativa chia thành hai nhóm tương ứng với hai loài phụ là Indica và Japonica Trong khi đó Oryza rufipogon chia thành bốn nhóm, một nhóm là Oryza rufipogon hàng niên

và ba nhóm Oryza rufipogon đa niên Tác giả đã kết luận các giống lúa Japonica

có quan hệ gần gũi với một nhóm Oryza rufipogon đa niên, còn các giống lúa Indica có quan hệ gần với nhóm lúa Oryza rufipogon hàng niên [35]

Trang 17

Ở Châu Phi xuất hiện cả hai loài lúa dại Oryza longistaminata (đa niên) và Oryza brevigulata (hàng niên), do đó nhiều tác giả cho rằng Oryza breviligulata là nguồn gốc của Oryza glaberrima

Cho đến nay, nhiều nhà khoa học có cùng ý kiến cho rằng lúa Glaberrima và lúa Sativa có cùng chung nguồn thủy tổ vào thời kỳ lục địa nguyên thuỷ Gondwanaland, nhưng sau khi các lục địa tách rời nhau, lúa Sativa và Glaberrima tự tiến hoá từ các loài lúa dại bản địa ở hai châu lục

là Châu Á và Châu Phi (hình 1.1) Khush G (1997) [47]

Lục địa Gondwanalands

Tổ tiên chung

Nam và Đông Nam Á ây châu Phi

Lúa dại đa niên O rufipogon O longistaminata

Lúa dại hàng niên O nivara O breviligulata

Lúa trồng O sativa O sativa O glaberrima

Indica Japonica

Ôn đới Nhiệt đới

Hình 1.1.Sơ đồ tiến hoá của hai loài lúa trồng (Khush, 1997)

Việc thuần hoá cây lúa diễn ra ở bán đảo Trung Ấn được bắt đầu khoảng 10.000 - 15.000 năm trước, còn cây lúa trồng đã xuất hiện ở Châu Á cách đây khoảng 8.000 năm (Chang T, 1985; Lu Y, 1995) [30], [52] Từ trung tâm phát sinh, cây lúa theo thời gian đã được di thực đi nhiều vùng

Trang 18

sinh thái mới Qua quá trình chọn lọc tự nhiên và nhân tạo, cây lúa có khả năng thích nghi ngày càng rộng Hiện nay, cây lúa được trồng trong những điều kiện sinh thái và khí hậu rất khác nhau Lúa được trồng ở Tây Bắc Trung Quốc (500 vĩ Bắc), ở miền Trung Xumatra trên đường xích đạo và ở

cả New South Wales, Châu Úc (350 vĩ Nam) Lúa cũng được trồng từ những vùng thấp hơn mực nước biển, ở Kerala (Ấn Độ) đến những vùng

có độ cao 2000 mét ở Kasmia (Ấn Độ) và có thể trồng trên cạn, hay ở điều kiện nước sâu tới 1,5 - 5 mét (Phạm Đồng Quảng, 2005) [14] Lúa Châu Phi xuất hiện ở miền Tây Phi, trải dài từ Senegal đến miền bắc Cameroon Tác giả Porteres đưa ra giả thuyết rằng loại lúa này xuất phát từ châu thổ sông Niger (Sudan) cách đây khoảng 3.500 năm Ngoài ra, còn hai trung tâm xuất xứ phụ ở Nio du Rip trên dòng sông Gambia và trên núi Guinea (Trần Văn Đạt, 2005) [3]

1.1.2 Phân loại lúa

Cây lúa trồng thuộc họ Poaceae, trước đây gọi là họ Hòa thảo (Gramineae), họ phụ Pryzoideae, tộc Oryzae, chi Oryza, loài Oryza sativa và Oryza glaberrima Oryza có khoảng 20 loài phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới

ẩm của Châu Phi, Nam và Đông Nam Châu Á, Nam Trung Quốc, Nam và Trung Mỹ và một phần ở Châu Úc Trong đó, chỉ có 2 loài là lúa trồng, còn lại là lúa hoang hàng niên và đa niên Loài lúa trồng quan trọng nhất, thích

nghi rộng rãi và chiếm đại bộ phận diện tích lúa thế giới là Oryza sativa L

Loài này hầu như có mặt ở khắp nơi từ đầm lầy đến sườn núi, từ vùng xích đạo, nhiệt đới đến ôn đới, từ khắp vùng phù xa nước ngọt đến vùng đất cát

sỏi ven biển nhiễm mặn, phèn … Một loài lúa trồng khác là Oryza glaberrima Steud, chỉ được trồng giới hạn ở một số quốc gia Tây Châu Phi và hiện đang bị thay thế dần bởi Oryza sativa L [38]

Trang 19

Năm 1928 - 1930, các nhà nghiên cứu Nhật Bản đã đưa lúa trồng thành

2 loài phụ: “Indica” và “Japonica” trên cơ sở phân bố địa lý, hình thái cây và

hạt, độ bất dục khi lai tạo và phản ứng huyết thanh (Serological reaction)

Các nhà nghiên cứu Nhật Bản sau đó đã thêm một nhóm thứ 3 “Javanica” để

đặt tên cho giống lúa cổ truyền của Indonesia là “bulu” và “gundil”;

Từ “Janvanica” có gốc từ chữ Java là tên của một đảo của Indonesia

Từ “Japonica” có lẽ xuất xứ từ chữ Japan là tên nước Nhật Bản Còn

“Indica” có lẽ có nguồn gốc từ India (Ấn Độ) Như vậy, tên gọi của 3 nhóm

thể hiện nguồn gốc xuất phát của các giống lúa từ 3 vùng địa lý khác nhau (bảng 1.2) [31]

Năm 1963, các nhà khoa học đã thống nhất chia chi Oryza thành 19

loài Sau đó, căn cứ trên các phát kiến mới về tế bào học và di truyền cây lúa;

năm 1967, các nhà khoa học khẳng định lại rằng chi Oryza có 22 loài trong

đó có 20 loài lúa dại và hai loài lúa trồng Chang (1985) [30] Sau này, Vaughan

(1994), phát hiện thêm một loài lúa dại mới ở Papua New Ginea là loài Oryza rhizomatis, đưa số loài của chi Oryza lên 23 loài và chia thành bốn nhóm genome Danh sách phân loại chi Oryza được trình bày ở (bảng 1.1) [79]

Ngày nay, các nhà phân loại học đều nhất trí là chi Oryza có 23 loài trong đó 21 loài hoang dại và hai loài lúa trồng là Oryza sativa và Oryza glaberrima thuộc loại nhị bội 2n = 24 có bộ gene AA Loài Oryza glaberrima phân bố chủ yếu ở Tây và Trung Phi, còn loài Oryza sativa được gieo trồng khắp thế giới và được chia thành hai loài phụ là Indica và Japonica

Theo tác giả Nguyễn Văn Hoan (2006) và Trần Văn Minh (2004),

trong quá trình tiến hoá của cây lúa, ngoài hai loài phụ Indica và Japonica còn có nhiều loại hình trung gian như Javanica [4], [9] Trên cơ sở giải mã

Trang 20

trình tự DNA của 10 gene ở nhân tế bào của lúa, tác giả Zhu (2007), cho rằng quá trình thuần hoá liên quan chặt chẽ với quá trình giảm đa dạng di

truyền của các giống lúa dại Đa dạng di truyền của lúa Japonica thấp hơn 2 lần so với đa dạng di truyền của lúa Indica [89]

Bảng 1.1 Phân loại chi Oryza (Nguồn: Vaughan, 1994)

Nhóm Oryzae

Breviligulata A Chev

Punctata Kotschy 24, 48 BB, BBCC Châu Phi

Nhóm Angustifoliae

Trang 21

et Roehr

Nhóm Coarctatae

Trang 22

Bảng 1.2 Đặc trưng hình thái và sinh lý tổng quát của 3 nhóm giống lúa

Đặc

Thân -Thân cao -Thân cao trung bình -Thân thấp

Chồi -Nở bụi mạnh -Nở bụi thấp -Nở bụi trung bình

có đuôi dài -Trấu có lông dài -Ít rụng hạt

-Hạt tròn, ngắn -Hạt không đuôi tới

có đuôi dài -Trấu có lông dài và dầy

-Ít rụng hạt Sinh

1.2 Tài nguyên di truyền lúa Việt Nam

Rất nhiều nhà khoa học trên thế giới cho rằng Việt Nam là một trong những trung tâm khởi nguyên của cây lúa trong vùng Đông Nam Á, Ấn Độ, Miến Điện và Đông Dương

Theo Dao T.T (1996), trên lãnh thổ Việt Nam tồn tại ba nhóm giống lúa cổ truyền có các đặc tính di truyền khác nhau: nhóm giống lúa Việt - Thái (phân bố ở vùng núi phía Bắc, chủ yếu là lúa nương, nhóm giống lúa này có

sự đa dạng di truyền cao nhất thế giới); nhóm giống lúa Việt (phân bố ở vùng

Trang 23

đồng bằng sông Hồng, bao gồm các giống lúa Chiêm có những nguồn gene quý như gene kháng đạo ôn, gene chịu đất chua phèn, chịu đất nghèo lân, gene chịu rét thời kỳ mạ và thời kỳ lúa trỗ); nhóm lúa Việt - Kh’mer (phân bố

ở vùng ĐBSCL) [37]

Theo Watanabe, những nghiên cứu trên đất gạch bằng trấu ở Ấn Độ và dọc theo sông Cửu Long như Myanma, Thái Lan, Lào, Campuchia và Việt Nam phát hiện rằng cây lúa trồng ở Đông Dương phát triển theo hai con đường: Từ Lào theo sông Cửu Long đi xuống phương Nam có đặc tính cây lúa

Japonica nhiệt đới Một đường khác, từ Ấn Độ qua vịnh Bengal đến bờ biển Đông Dương, với đặc tính cây lúa Indica (trích dẫn bởi Trần Văn Đạt, 2004) [2] Tác giả Loresto (1996), cùng ý kiến cho rằng, có hai con đường mà loài O Sativa di chuyển vào lục địa của Việt Nam và Trung Quốc: một là từ Nepal

qua Myanmar, Vân Nam đến vùng đồng bằng sông Hồng và một đường khác từ Việt Nam đến đồng bằng sông Dương Tử [50]

Theo Phạm Đồng Quảng (2004; 2005), trong giai đoạn 2000 - 2001 trên cả nước có 680 giống lúa được gieo trồng trong sản xuất (chưa kể các giống địa phương và giống lúa cạn) [11], [12]

Hiện nay, tại Ngân hàng gene cây trồng Quốc gia đang lưu giữ trên 6.200 giống lúa, trong đó phần lớn là các giống địa phương Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long lưu giữ 1.836 giống (Trần Văn Đạt, 2004) [2]

Từ đó, cho thấy rằng Việt Nam với khí hậu nhiệt đới có thể là một trong những trung tâm xuất hiện của tổ tiên các loài lúa trồng và lúa được xem như một loài cây trồng bản địa của Việt Nam (Trần Văn Đạt, 2005) [3] Bởi, nguồn tài nguyên di truyền lúa rất đa dạng và phong phú, bao gồm tài nguyên lúa dại, lúa trồng và tài nguyên lúa đặc sản Theo các nghiên cứu

Trang 24

khoa học gần đây, ở Việt Nam hiện có bốn loài lúa dại, đó là: Oryza rufipogon (phân bố ở vùng Điện Biên Phủ, tỉnh Lai Châu, vùng duyên hải

Thừa Thiên Huế, một số vùng ở Tây Nguyên và đồng bằng sông Cửu Long);

Oryza nivara (phân bố ở hồ Lak tỉnh Đắc Lắk và dọc theo biên giới Việt Nam - Campuchia); Oryza officinalis (tồn tại khá phổ biến dọc các bờ kênh rạch và vườn cây ăn quả ở đồng bằng sông Cửu Long) và Oryza granulata

(tồn tại phổ biến ở các tỉnh vùng Tây Bắc và một số nơi ở Tây Nguyên) (Yu

et al., 2005) [86] Riêng về lúa chất lượng, theo tác giả Trần Văn Đạt (2005),

Việt Nam có nguồn gene lúa thơm phong phú bao gồm các giống lúa Mùa thơm ở miền Nam và các giống lúa Tám Thơm ở miền Bắc [3]

1.3 Các giống lúa chất lượng trên thế giới và ở Việt Nam

Lúa chất lượng là giống lúa không những có kích thước, hình dạng thon dài mà còn có phôi nhũ, hàm lượng amyloza cao và đặc biệt các giống lúa chất lượng có mùi thơm đặc trưng

Các giống lúa thơm thường được trồng phổ biến ở châu Á, riêng giống lúa Basmati được gieo trồng khoảng 2 triệu ha chủ yếu ở các nước Ấn Độ, Pakistan và Nepan Gạo thơm có hạt nhỏ, thon và dài từ 6,8 đến 7,0 mm, tỷ lệ chiều dài và chiều rộng từ 3,5 đến 3,7 và có hàm lượng amyloza trung bình

20 - 22%

Ở Ấn Độ có hàng trăm giống lúa thơm địa phương, tuy nhiên chỉ có giống lúa thơm Basmati được ưa chuộng nhất Gạo thơm Basmati có hai đặc tính quan trọng hơn hết đó là mùi thơm và cơm nở dài, có từ 22 - 25% amyloza, gạo vẫn giữ được đặc tính này sau khi nấu Ở Thái Lan có hai giống lúa thơm nổi tiếng là Khao Dak Mali và Jasmine 85 Gạo thơm Khaw Dawk

Trang 25

Mali có ít hơn 20% amyloza nên hạt sau khi nấu hạt còn hơi dính vào nhau (Khush G.S, 2001) [48]

Các giống lúa thơm ở Myanmar được gieo trồng nhiều ở các tỉnh miền Trung và chủ yếu được tiêu thụ ở trong nước Một số giống lúa chất lượng đang được gieo trồng phổ biến ở đây như: Namathalay, Basmati, Paw San Bay Gyar (Chaudhary, 2001) [32]

Ở Philippin có giống Milsagrosa và ở Trung Quốc có các giống Bắc thơm, Quế hương chiêm, Qua dạ hương và Chi ưu hương là các giống lúa chất lượng nổi tiếng trên thế giới

Giống lúa Koshihikari là giống lúa cổ truyền của Nhật, thuộc loài phụ

Japonica, có chất lượng cao, hương vị rất được ưa thích trong những bữa ăn

chính của người Nhật Giống lúa Koshihikari được xem như là lúa Basmati của Nhật với diện tích gieo trồng chiếm khoảng 30% tổng diện tích trồng lúa

tìm thấy nữa Lúa thơm ở Tây Nguyên có trọng lượng hạt cao (tính cho 1000

Trang 26

hạt), trên 25 gr (Nguyễn Hữu Nghĩa, 2001 b) [10] Ngoài ra, còn có các giống lúa thơm khác như Bake dẻo, Cúc thơm, Thái thơm, Tám thơm Thanh Hóa,…

1.3.1 Các yếu tố cấu thành đặc tính chất lượng của lúa

Chất lượng của lúa phụ thuộc nhiều yếu tố như hàm lượng amyloza,

dạng nội nhũ, hàm lượng protein và đặc biệt là hương thơm…

Hương thơm của lúa thường có mùi thơm nhẹ hoặc thơm ngát của các loại lúa Basmati hoặc Jasmine Phân tích hóa học trên một phổ rộng các giống lúa thơm và không thơm cho thấy có rất nhiều các thành phần khác nhau và có sự thay đổi của các thành phần này trong quá trình bảo quản Những nghiên cứu trước đây đã chứng minh mùi vị của gạo có liên quan tới thời gian bảo quản, trong lúa mới thu hoạch được xác định có các hợp chất tạo thành mùi thơm 1- butanal, 1- hexanal, 1- heptanal, methyl ethyl ketone,

1 pentalnal và propanal, sau một thời gian bảo quản chỉ thấy còn butanal và 1- heptanal Hàm lượng của hexanal trong gạo cân bằng tuyến tính với nồng

độ của axit linoleic đã oxi hóa trong gạo (Shin MG, 1986) [68], khi được bảo quản ở nhiệt độ 35oC trong hai tuần, một vài loại gạo đã giảm hàm lượng pentanal, hexanal và petanol đáng kể so với các loại gạo khác (Suzuki, 1999)

[75]

Tuy nhiên, trong những nghiên cứu gần đây đã cho thấy đặc tính mùi thơm của lúa chủ yếu do hợp chất 2 acetyl - 1- pyrroline tạo thành Quá trình tổng hợp chất 2-AP phụ thuộc gián tiếp vào hoạt tính của enzym Betain Aldehyde Dehydrogenase 2 (BAD2) Khi BAD2 hoạt động mạnh sẽ cạnh tranh cơ chất với enzyme sinh tổng hợp 2-AP làm hàm lượng 2-AP bị giảm đến mức lúa sẽ không có mùi thơm Sử dụng các phân tích bằng cảm quan và

Trang 27

phương pháp sắc kí khí (Butterry et al.,1986) đã xác định 2 acetyl - 1 -

pyrroline (2AP) là một chất mặc dù có hàm lượng rất thấp trong các loài lúa thơm nhưng là chất khởi đầu tạo hương thơm ở các giống lúa Jasmine và Basmati [28] Một nghiên cứu khác cũng cho thấy 2AP có mặt trong các giống lúa không thơm nhưng có hàm lượng thấp hơn so với các giống lúa thơm từ 10 - 100 lần (Widjaja R, 1996; Wilkie K, 2004) Để cảm nhận được 2AP có trong gạo thơm, nồng độ 2AP thường cao hơn khoảng 3000 lần so với ngưỡng nồng độ tan trong nước và chỉ cao gấp 30 lần ở gạo không thơm

những cặp lai đầu tiên, giữa giống lúa Basmati 370 và các dòng lúa Indica cải

tiến có hàm lượng amyloza trung bình và nhiệt độ hóa hồ trung bình Những dòng thấp cây từ quần thể con lai được chọn lọc, những dòng này có mức độ hữu thụ khác nhau và dạng cây khác nhau Sau khi tiến hành lai chéo các dòng này thu được các dạng cây và độ hữu thụ khác nhau Những cây có dạng khỏe và độ hữu thụ cao được chọn ra để phân tích hàm lượng amyloza, nhiệt độ hóa hồ và hương thơm Những dòng có dạng cây xấu, độ hữu thụ thấp, chất lượng hạt kém và độ thơm thấp được loại bỏ qua các thế hệ Sau một số chu kỳ lai và chọn lọc những dòng có dạng cây khỏe, thấp cây, đáp ứng được các đặc điểm về chất lượng như Basmati được chọn lọc và tiến hành khảo nghiệm tại IRRI, Ấn Độ và Pakistan [32]

Trang 28

Với sự phát hiện ra cây lúa dại có hạt phấn bất thụ vào 1970, các nhà khoa học Trung Quốc, Ấn Độ và IRRI đã tạo ra một số dòng CMS - bất dục đực thuộc tế bào chất (A), dòng bảo tồn thích ứng (B), và dòng phục hồi (R) thích hợp để sản xuất ra những tổ hợp lúa lai đa dạng Những tổ hợp lai 3 dòng đầu tiên của Trung Quốc gồm có Wei-you 2, Wei-you 3, Wei-you 6, Shan-you 2, Shan-you 3, Shan-you 6, Nam-you 2, Nam-you 3, Si-you 2, Si-you 3 và Si-you 6 (Mao CX, 1993) [55]

Dựa trên đặc tính quang cảm và nhiệt cảm của cây lúa để tạo lúa lai 2 dòng Những giống lúa quang cảm trở nên bất thụ đực khi được trồng trong những ngày dài có ánh sáng từ 14 giờ trở lên, được gọi dòng PGMS (Photoperiod-sensitive genic male sterility) Những giống lúa trở nên bất thụ đực khi được trồng ở những nơi có nhiệt độ hơi thấp, từ 280

C trở xuống, được gọi là dòng TGMS (Temperature-sensitive genic male sterility) Năm 1983, dòng PGMS được tìm thấy ở tỉnh Hubei, Trung Quốc và trong 1987 gene

tương hợp lúa dại giữa lúa Japonica và lúa Indica được nghiên cứu ở Nhật

Bản Trong thời gian qua, các nghiên cứu về kỹ thuật tạo lúa lai 2 dòng đã có những kết quả khả quan, chủ yếu là ở Trung Quốc [88]

Sau khi tạo ra những dòng CMS với loại WA (wild - abortive), những dòng CMS khác cũng lần lượt được tạo ra như Zhenshan 97A, V20A, Erjiu

Ai 4A, Erjiu Nan 1A, V41A Ở Philippines, IRRI đã dùng các CMS từ V20A,

Kaliya 1 ARC, Gambiaka, … để tạo ra các CMS thích hợp với khí hậu nhiệt

đới, như: IR8025A, IR68275A, IR68281A, IR68273A, IR68888A, IR68891A, IR68893A,… Tương tự, dòng CMS được tạo ra từ các nguồn tế

bào chất của O perennis (IR66707A) và O rufipogon (OMS1) (Nguyen Tri

Hoan, 2002) Như vậy, nền tảng di truyền của các dòng CMS đã được đa dạng hóa và gia tăng ngày càng nhiều hơn [58]

Trang 29

Các loại lúa lai được đưa ra đồng ruộng đầu tiên của Trung Quốc có năng suất cao, nhưng chất lượng kém Gần đây, các tổ hợp 3 dòng như Boyou

64, Xieyou 63 và Xieyou 64 có chất lượng cao Các tổ hợp You I63 và You I64 có hạt gạo dài và trung bình Các CMS có gạo thơm cũng được tạo ra, như Xiang A và B và các tổ hợp thơm như XiangA/PH 137, Xiang A/F50 và Xiang A/F 117 có năng suất tương tự như các tổ hợp không thơm và được đưa ra sản xuất (Zhu, 2003) [88] Các tổ hợp lai của IRRI, Ấn Độ, Philippines, Bangladesh, Indonesia và Việt Nam đều có chất lượng tương đối cao

Lúa lai một dòng hay còn gọi apomixis (sinh sản vô tính) có thể giúp nông dân sử dụng chính hạt giống của mình cho vụ mùa kế tiếp, mà không bị ảnh hưởng phân ly của lúa lai 2 hoặc 3 dòng Tuy nhiên, nghiên cứu lúa lai một dòng trong 3 thập niên qua chưa có triển vọng nhiều

Một phương pháp lai tạo giống khác đã được các nhà chọn giống Myanma và Thái Lan thực hiện đó là phương pháp chọn lọc liên kết với chỉ thị phân tử (MAS) Để cải tiến giống lúa Manawthukha, một giống không thơm và hàm lượng amyloza cao được trồng với một diện tích lớn ở Myanma Các nhà nghiên cứu đã sử dụng giống Basmati 370 là dòng bố mẹ

để lai nhập các gene mùi thơm vào giống Manawthukha bằng phương pháp Marker Assisted Backcrossing (MAB) Bốn dòng lai nghịch và một dòng gốc được làm vật dẫn truyền để chuyển các alelle badh2 và Wx từ giống Basmati vào giống Manawthukha Hai mươi dòng lúa ở thế hệ BC4F2 đã chọn lọc mang các alelle đồng hợp của giống Basmati, được trồng ở các địa điểm khác nhau ở Myanma và Thái Lan và được kiểm tra các đặc điểm nông học, chất lượng gạo Lúa thu hoạch được ở các dòng cải tiến đã có đặc tính mùi thơm

và chất lượng gạo tương tự như giống Basmati nhưng có đặc điểm nông học

Trang 30

giống như giống Manawthukha ban đầu Các dòng lúa cải tiến có đặc điểm cây cao trung bình, đẻ nhánh tốt, bông dày, chống đổ và có năng suất cao

1.3.2.2 Ở Việt Nam

Chương trình lúa lai được bắt đầu thực hiện vào những năm 1980 dưới

sự chỉ đạo trực tiếp của Bộ Nông nghiệp Một số tổ hợp lai của Trung Quốc như Sán Ưu 63 (Shanyou 63), Sán Ưu Quế (Shanyou gui 99), Nhị Ưu 63 (Jinyou 63), Nhị Ưu 838, Bác Ưu 64 (Boyou 64), Bác Ưu 693, Bồi Tạp Sơn Thanh (Peiai 64S/Sơn Thanh) và Bồi Tạp dòng 49 (Peiai 64S/Dòng 49), Trang Nông 15 đã được trồng đại trà trong nước Những tổ hợp lai tạo bản xứ như HR1, HYT56, HYT57, VN01/D212, AMS24A/Que 99, MS24A/IR9761-

Các nhà chọn giống lúa Việt Nam đã cố gắng lai tạo giống cao sản có hương thơm với các vật liệu bố mẹ cho gene thơm từ giống Basmati và Khao Dawk Mali vẫn chưa thành công Có một số ứng dụng đột biến gene trên giống Nàng thơm Chợ Đào, Tám thơm, hoặc sử dụng chúng làm bố mẹ trong lai tạo Có thể do khả năng kết hợp kém nên việc chọn lọc con lai rất khó khăn Đặc biệt trong trường hợp tổ hợp lai OM1262 = MTL61/Basmati 370, OM1277 = OM86-9/Basmati, OM1262 = IR66/Basmati, con lai được chọn ở thế hệ thứ 10, 11 vẫn chưa cho quần thể ổn định, mặc dù dạng hình chấp

Trang 31

nhận (PACP) khá tốt, hàm lượng amyloza trung bình, gạo hạt thon dài (Lê Vĩnh Thảo, 2004) [17]

1.4 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền lúa bằng chỉ thị DNA

Để đánh giá bản chất di truyền của các cá thể dựa vào hệ gene của chúng, các marker DNA đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu của sinh học phân tử như: Xây dựng thư viện bộ gene, xác định cây phát sinh chủng loại, đánh giá đa dạng di truyền, xác định quan hệ họ hàng Các marker DNA phổ biến trong nghiên cứu đa dạng di truyền: RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), Microsatellite hay còn gọi SSR (Simple Sequence Repeat), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) và ISSRs (Inter - Simple Sequence Repeats) (Semagn, 2006) [67]

1.4.1 Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism - đa hình đoạn phân cắt giới hạn)

Phương pháp xác định có hiệu quả tính biến dị của DNA là sử dụng một nhóm enzyme đặc hiệu gọi là enzyme giới hạn Những enzyme này sản sinh ra từ nhiều loại vi sinh vật khác nhau Chúng có khả năng nhận biết những vị trí "đích" hay còn gọi là những vị trí giới hạn, chứa một trật tự nucleotide đặc thù trong DNA và sau đó cắt DNA tại trật tự đó Vì vậy, một đoạn lớn của phân tử DNA sau khi được xử lý bởi enzyme này sẽ bị cắt thành nhiều mảnh nhỏ có kích thước khác nhau Sự khác nhau về kích thước các đoạn được tạo ra do xử lý enzyme giới hạn đối với các phân tử DNA được gọi là đa dạng chiều dài đoạn giới hạn (Restriction Fragment Length

Polymorphisms - RFLP) Kỹ thuật này được tác giả Botstein et al., (1980) sử

Trang 32

dụng như là chỉ thị trực tiếp vào năm 1980 [25] RFLP được sử dụng để lập bản đồ di truyền, phân tích quan hệ di truyền tiến hoá, phân loại (Miller, 1990) [56]

Kỹ thuật RFLP có nhiều hạn chế do phải sử dụng một lượng lớn DNA cho việc cắt giới hạn, lai Southern (Southern blotting and hybridization), kỹ thuật phức tạp và tốn kém

1.4.2 Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction , PCR)

Phản ứng chuỗi polymerase do Mullis PK phát minh năm 1985 và ông

đã được trao giải thưởng Nobel về hoá học năm 1993 cho phát minh này Đây

là phương pháp in vitro để nhân bội nhanh một đoạn DNA nào đó mà chỉ cần

một lượng mẫu ban đầu rất nhỏ PCR dựa trên sự xúc tác của enzyme để nhân bội một đoạn DNA nhờ hai đoạn mồi oligonucleotit tương hợp với hai đầu 3'

ở cả hai mạch của đoạn DNA đích (Lê Duy Thành, 2001) [16] Hiện nay có rất nhiều chỉ thị DNA dựa trên PCR đang được áp dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền nhưng phổ biến nhất là một số chỉ thị sau:

1.4.2.1 Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism - đa hình chiều dài đoạn nhân bội)

Tác giả Vos et al., (1995), lần đầu tiên phát triển kỹ thuật AFLP DNA

genome được cắt thành các phân đoạn có kích thước khác nhau, trong số đó

sẽ có các phân đoạn mang các đầu mút giống nhau Nếu như sử dụng một đoạn nối (adaptor) như nhau có gắn thêm một số oligonucleotide được chọn lọc trước để định hướng cho việc gắn của các cặp mồi PCR, thì tất cả những đoạn DNA có đầu mút giống nhau sẽ được nhân bội Khi thay đổi số lượng

và trật tự các oligonucleotide được chọn lọc ở các đầu nối ta có thể nhận được những đoạn DNA khác nhau [80]

Trang 33

Kỹ thuật này ra đời mang lại nhiều thuận lợi cho phân tích di truyền và lập bản đồ AFLP kết hợp được sự chính xác của RFLP và sự tiện lợi của PCR vì vậy AFLP đã nhanh chóng trở thành một kỹ thuật được sử dụng phổ biến hiện nay

1.4.2.2 Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA - DNA đa hình được nhân bội ngẫu nhiên)

Tác giả Welsh (1990) và Williams (1990), độc lập phát triển kỹ thuật RAPD Kỹ thuật này cho phép phát hiện đa hình các đoạn DNA được nhân bội ngẫu nhiên bằng việc dùng một mồi đơn chứa một trật tự nucleotide ngẫu nhiên Các mồi đơn gắn vào hai điểm khác nhau của hai mạch đơn đối diện của đoạn DNA khuôn Nếu các điểm gắn mồi nằm trong khoảng cách có thể nhân bội được (thường từ 200 - 2000 nucleotitde) thì đoạn DNA đó được nhân lên Ưu điểm chính của kỹ thuật này là không cần phải biết trình tự nucleotide ở DNA được nhân bội, kỹ thuật tương đối đơn giản, nhanh và dễ thực hiện [82], [85]

Chỉ thị RAPD thường được dùng để phân tích và xác định quan hệ di truyền giữa các cá thể trong công tác lai tạo hay phân loại Chúng cũng được

sử dụng để xác định các gene kiểm soát hoặc liên quan đến một tính trạng nào đó của cây trồng Tuy nhiên, kỹ thuật RAPD không ổn định khi tiến hành thí nghiệm ở các điều kiện khác nhau

1.4.2.3 Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeats)

SSR hay còn gọi là vi vệ tinh, là những đoạn trình tự DNA đơn giản lặp lại nối tiếp và chỉ gồm 1- 6bp Hiện tượng các SSR trong cơ thể sinh vật nhân chuẩn là khá phổ biến ở động vật và thực vật Tuy nhiên, tùy từng loài

mà số lượng các nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ một

Trang 34

đến hàng chục và số lượng đơn vị lặp lại có thể biến động từ hai đến hàng chục lần hoặc nhiều hơn Thông thường có các kiểu lặp lại [49], [44]

- Lặp lại hoàn toàn: các đơn vị lặp lại sắp xếp nối tiếp nhau

- Lặp lại không hoàn toàn: xen kẽ vào các đơn vị lặp lại là một hoặc một

số nucleotide khác

- Lặp lại phức tạp: xen kẽ giữa các đơn vị lặp lại khác nhau

Thông thường, các SSR có mặt chủ yếu ở các vùng dị nhiễm sắc của nhiễm sắc thể như vùng tâm động hoặc các đầu mút, chúng giữ vai trò quan trọng trong việc điều hoà phiên mã đối với các gene hoạt động ở vùng nguyên nhiễm sắc, góp phần làm tăng tính ổn định cơ học của nhiễm sắc thể trong các quá trình phân bào và có thể chứa đựng những thông tin di truyền

liên quan đến sự xác định giới tính ở cả động vật và thực vật

Bản chất đa hình của SSR có thể được sinh ra do sự nhân bội từ DNA tổng số của hệ gene nhờ sử dụng hai đoạn mồi bổ trợ với trình tự gần kề hai đầu của vùng lặp lại Sự khác nhau về độ dài ở locus SSR được phát hiện bởi sự nhân đoạn DNA nhờ phản ứng PCR Kích thước của sản phẩm PCR được xác định một cách chính xác bằng điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide với sự khác nhau về độ dài có thể rất nhỏ (2bp) Chỉ thị SSR dùng để đánh giá đa dạng di truyền, xác lập quan hệ di truyền của cây trồng, chọn lọc tính kháng bệnh, một số tính trạng có quan hệ chặt chẽ với năng suất ở cây lúa, lập bản đồ, nghiên cứu locus tính trạng số lượng (QTL)

Ưu điểm và hạn chế của chỉ thị SSR

Thuận lợi to lớn của phân tích SSR là phương pháp này biểu hiện số lượng lớn sự đa hình Hơn nữa, khả năng phân biệt các cá thể khi có sự kết

Trang 35

hợp các locus được kiểm tra làm cho phương pháp này rất hữu dụng trong các thí nghiệm dòng chảy gene, xác định cây trồng và phân tích mối quan hệ

di truyền (Hokanson et al., 1998) [43]

SSR là marker đồng trội, do đó dị hợp tử có thể dễ dàng được xác định trong quá trình thực nghiệm Tính đồng trội của SSR sẽ gia tăng sự hiệu quả và độ chính xác của những phép tính toán di truyền quần thể dựa trên những marker này so với những marker khác, như AFLP và RAPD Hơn nữa, việc xác định dị hợp tử ở thế hệ F1 sẽ làm cho những phân tích

phả hệ, sự lai giống, dòng chảy gene trở nên dễ dàng hơn (Schlotterer et al.,

1994) SSR là công cụ hữu hiệu để chọn lọc giống, đa dạng hoá về các vật liệu di truyền và dùng trong thiết lập bản đồ di truyền Chẳng hạn, Tác giả Parasnis phát hiện đoạn lặp lại GATA kích thước 5kb chỉ có ở cây đu đủ đực không có ở cây đu đủ cái bằng marker SSR [66]

Khi các primer SSR đã được xác định, việc sàng lọc các vật liệu sử dụng kỹ thuật này hoàn toàn không đắt tiền Hơn nữa, sự khuếch đại SSR giữa các loài nghĩa là sự xác định những primer SSR thích hợp không cần

thiết trong những loài có quan hệ gần (Guilford et al.,1997; Hokanson et al.,

1998) [42], [43]

Hạn chế của chỉ thị này là quá trình thiết kế primer quá đắt, mỗi loại primer chỉ đặc trưng cho một loài và không thể áp dụng phân tích trên một

hệ thống lớn bao gồm nhiều loài có quan hệ di truyền xa nhau

Hiện nay, đã có khoảng 2.740 chỉ thị SSR cho toàn bộ Bộ gene lúa và

như vậy trung bình cứ 157kb của phân tử DNA có một chỉ thị SSR (Akagi et al.,1996; Chen et al., 1997; Chen et al., 2002; Cho et al., 2000; Coburn et al.,

Trang 36

2002; Paunaud et al.,1996; Temnykhet al., 2000; Temnykhet al., 2001) [22],

[34], [33], [36], [29], [62], [77], [76]

1.5 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền lúa trên thế giới và ở Việt Nam

1.5.1 Trên thế giới

Tác giả Olufowote et al., (1997), đã nghiên cứu biến động di truyền

trong giống của 71 giống lúa bằng cả hai loại chỉ thị SSR và RFLP Kết quả cho thấy các giống lúa địa phương có mức độ đa dạng, hỗn tạp và dị hợp tử cao hơn các giống lúa cải tiến Cả hai phương pháp đều cho thấy số lượng các allele ở các giống lúa địa phương cao hơn hẳn các giống lúa cải tiến Chỉ thị SSR có khả năng phân biệt các cá thể có quan hệ di truyền gần gũi, đồng thời

số lượng các allele cao hơn chỉ thị AFLP Các tác giả cũng chỉ ra rằng chỉ cần chọn chính xác 4 chỉ thị SSR là có thể nghiên cứu các allele dị hợp tử ở lúa [61]

Tác giả Natalya (2000), sử dụng chỉ thị RFLP đánh giá đa dạng di truyền của 342 giống lúa Việt Nam và nhận thấy rằng các giống lúa được thu

thập từ miền Nam Việt Nam thuộc nhóm Indica và các giống lúa thu từ miền Bắc thì phần lớn thuộc nhóm Japonica Sau nghiên cứu tác giả đã đưa ra kết

luận Việt Nam là một nước có đa dạng di truyền lúa thuộc loại cao nhất thế giới [57]

Tác giả Sujatha (2004), nghiên cứu quan hệ di truyền giữa các giống lúa Basmati bằng chỉ thị SSR Nghiên cứu được tiến hành trên 30 giống lúa thơm (bao gồm 22 giống lúa Basmati hạt ngắn và 8 giống Basmati hạt dài) dựa trên 6 chỉ thị SSR Kết quả cho thấy 20 trong số 22 giống lúa thơm hạt ngắn nằm cùng một nhóm lớn, 2 giống lúa thơm hạt ngắn còn lại nằm cùng nhau và tách riêng so với các nhóm khác, tám giống lúa Basmati hạt ngắn

Trang 37

nằm trong cùng một nhóm khác Tác giả đã khẳng định chỉ thị phân tử cung cấp ước lượng đa dạng di truyền chính xác so với các chỉ thị hình thái Kết quả nghiên cứu này cũng giúp cho việc phân biệt và chọn lọc các bố mẹ thích hợp trong công tác lai tạo giống lúa chất lượng [74]

Trong những nghiên cứu gần đây, Bradbury (2005), đã công bố ngiên cứu đa hình quan trọng giữa di truyền các giống lúa thơm và các giống lúa không thơm liên quan đến vùng mã hóa của một gene tương ứng với gene

BAD2 (betaine aldehyde dehydrogenase 2) Tuy nhiên, gene BAD2 có mặt

không phải quy định tính trạng thơm cho tất cả các giống lúa thơm, bởi gene này không quy định tính trạng trội về mùi thơm ở một dòng lúa đột biến SA0420 Tuy vậy, cũng có thể xác định được là trong phần lớn các giống lúa

có hương thơm được điều khiển bởi đơn gene lặn định vị trên NST số 8 của

O Sativa Hoạt động của BADH2 tạo nên những tiền vật chất cần thiết để

tổng hợp 2-AP [26]

Tác giả Mahmoud (2005), tiến hành nghiên cứu biến động và quan hệ

di truyền của 7 giống lúa bằng việc kết hợp của 8 mồi RAPD, 6 mồi SSR và

8 mồi AFLP Kết quả thu được cho thấy mức độ đa hình tương ứng với chỉ thị RAPD, SSR và AFLP là 72,2%, 90% và 67,9% Cũng qua kết quả này, tác giả khẳng định rằng các kỹ thuật nêu trên đều có thể áp dụng tốt cho nghiên cứu đa dạng di truyền cây lúa [53]

Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền của 38 giống lúa thơm bản địa

Basmati bằng chỉ thị SSR của tác giả Raj (Raj et al., 2006) Tác giả đã sử

dụng 32 cặp mồi, kết quả nghiên cứu cho thấy, có 26 cặp mồi đa hình (81,25%), hệ số PIC dao động từ 0,00 (RM259 và RM230) đến 0,83 (RM420) [64]

Trang 38

Tác giả Kibria (2009), phân tích đa dạng di truyền gene thơm của lúa bằng chỉ thị SSR và RAPD Công trình nghiên cứu được thực hiện từ tháng 7 năm 2006 đến tháng 4 năm 2008 tại Viện hạt nhân Nông nghiệp (Bina), Mymensingh, Bangladesh Kết quả chạy SSR của ba mồi (RM223, RM342A

và RM515) thu được kết quả 46 băng, mức trung bình của allele dao động từ 1,78 đến 2,49 [45]

Tác giả Malik Ashiq (2010), đã tiến hành đánh giá đa dạng di truyền

giữa các giống lúa truyền thống và giống lúa đã được cải tiến ở Pakistan Nghiên cứu được thực hiện trên hai giống lúa Basmati thơm và không thơm

thuộc nhóm lúa Indica Tổng số 41 dòng được đưa vào đánh giá bởi 30

marker SSR được phân bố trên khắp bộ gene của lúa Kết quả phân tích thu được tổng số 104 allele và tất cả đều đa hình, hệ số allele dao động 2 - 6 allele, trung bình là 3,5 allele/marker, hệ số PIC dao động từ 0,259 - 0,782 (trung bình là 0,571) Sau khi số liệu được phân tích bằng phần mềm UPGMA, 41 giống lúa đã được chia thành 2 nhóm chính: Nhóm I gồm có 22 giống (15 giống lúa thơm Basmati và 5 giống không thơm, hai giống lúa

Japonica) Nhóm II bao gồm 19 giống lúa không thơm Kết quả nghiên cứu

này cũng cho thấy rằng các marker SSR có thể được sử dụng để phân tích đa dạng di truyền và chỉ ra sự khác biệt giữa giống lúa Basmati thơm và giống lúa Basmati không thơm Hơn nữa, việc xác định giống lúa Basmati truyền thống dựa vào marker SSR có thể giúp ích cho việc duy trì và bảo tồn các giống lúa có chất lượng cao vì lợi ích của cả người nông dân và người tiêu dùng [54]

Theo Singh Balwant (2011), nghiên cứu đa dạng di truyền của 50 giống lúa thơm bằng chỉ thị SSR, hình thái, đánh dấu hóa lý Kết quả SSR marker phân tích cho thấy đa hình khác biệt giữa các giống với 28 mồi và hệ

Trang 39

số PIC có giá trị dao động từ 0,139 - 0,99 với trung bình 0,589 cho mỗi mồi [72]

1.5.2 Ở Việt Nam

Việt Nam được xem là một trong những trung tâm khởi nguyên của cây lúa, tài nguyên di truyền lúa của nước ta được đánh giá là phong phú cả

về số lượng và chất lượng Những công trình nghiên cứu về đa dạng di truyền

và phân loại một cách hệ thống lúa trồng ở Việt Nam còn hạn chế Tuy nhiên, trong những năm gần đây các nhà khoa học đã quan tâm đến vấn đề đánh giá

đa dạng tài nguyên lúa nhiều hơn, đặc biệt là các dòng lúa chất lượng và bước đầu đã có những thành công nhất định

Kết quả Nghiên cứu đa dạng di truyền các giống lúa Tám đặc sản ở 10

xã của 4 huyện thuộc tỉnh Nam Định là Hải Hậu, Giao Thuỷ, Xuân Trường

và Mỹ Lộc trong các năm 1999 và 2000 cho thấy trong số 7 giống lúa Tám đang được gieo trồng phổ biến (bao gồm Tám xoan, Tám ấp bẹ, Tám nghển, Tám Xuân Đài, Tám tiêu, Tám thơm, Tám cổ ngỗng) thì giống Tám xoan có

đa dạng di truyền giống cao nhất Các giống có đa dạng thấp là Tám ấp bẹ và Tám Nghển, đây là những giống đang có nguy cơ bị sản xuất loại trừ (Trần Danh Sửu, 2001) [13]

Tác giả Lê Xuân Đắc và cs (2003), đã sử dụng 10 đoạn mồi RAPD để đánh giá đa dạng di truyền của 20 giống lúa Tám đang lưu giữ tại Ngân hàng gene cây trồng Quốc gia Kết quả thu được tổng số 889 phân đoạn DNA với kích thước từ 0,46 - 2,5 kb, hệ số tương đồng di truyền giữa các lúa Tám lớn hơn 50% và cao nhất là 93% Kết quả phân tích chùm trên sơ đồ hình cây thu được 2 nhóm chính và đặc biệt 2 giống có hệ số tương đồng di truyền sai khác nhiều nhất so với các giống khác là Tám Nhỡ Bắc Ninh (GB0318) với

Trang 40

sự sai khác là 0,35 (1 - 0,65), giống Tám nghệ hạt đỏ (GB0316) với sự sai khác là 0,34 (1 - 0,66) Trong 20 giống lúa Tám nghiên cứu thì 2 giống Tám thơm Hà Đông (GB0310) và Tám xoan Hải Dương (GB0311) tương đồng với nhau ở mức cao nhất là 0,93 [1]

Theo Trần Văn Minh (2004), các giống lúa thuộc loài phụ Japonica có

hạt ngắn, lá ngắn màu đậm và cứng, không có râu đầu hạt thóc, bông ít phân nhánh, độ đóng hạt dày [9]

Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền của 101 giống lúa địa phương bằng 9 locus thuộc 5 enzymes Kết quả cho thấy, trong số các giống thu từ huyện Nho Quan, Ninh Bình và huyện Đà Bắc, Hoà Bình thì có 44 giống

(chiếm 43,6%) thuộc lúa Indica và 57 giống (56,4%) thuộc lúa Japonica

(Trần Danh Sửu, 2004) [15]

Theo tác giả Lưu Ngọc Trình (2007), trong tổng số 6.083 giống lúa đang bảo quản tại Ngân hàng gene cây trồng Quốc gia, Trung tâm Tài nguyên thực vật đã tiến hành đánh giá đầy đủ 60 tính trạng hình thái nông học của 1.819 giống, đánh giá 40 - 50 tính trạng của 1.385 giống và từ 20 - 30 tính trạng của 2.066 giống [14]

Năm 2010, Khuất Hữu Trung và cs đã sử dụng 29 cặp mồi SSR trên 27 giống lúa nếp và lúa nương thu được tổng số 786 allele, thuộc 96 loại allele khác nhau, trung bình 3,310 allele/mồi Hệ số PIC dao động từ 0 đến 0,808, trung bình 0,474 Các giống lúa nếp và lúa nương có độ thuần di truyền rất khác nhau, tỷ lệ dị hợp của các mẫu nghiên cứu dao động từ 0% đến 25% Hệ

số tương đồng di truyền giữa các giống dao động trong khoảng từ 0,06 đến 0,84 Tập đoàn 27 giống lúa nếp và lúa nương nghiên cứu được chia thành 2

nhóm lớn [19]

Định dạng
Số trang	83
Dung lượng	1,64 MB