Nghiên cứu đa dạng di truyền và hàm lượng huperzin a của loài thạch tùng răng cưa thu từ sapa và đà lạt

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Hoàng Đình Hòa Bộ môn công nghệ sinh học - Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội TS Lê Thị Bích Thủy - Phòng Di truyền Tế bào thực vật - Viện công nghệ sinh học- Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn cho trình nghiên cứu suốt thời gian qua Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, anh chị, bạn sinh viên phòng Di truyền Tế bào thực vật - Viện công nghệ sinh học- Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Namđã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho trình thực đề tài Cuối xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè ngƣời thân động viên, khuyến khích giúp vƣợt qua khó khăn suốt thời gian nghiên cứu thực đề tài Hà Nội, ngày 22 tháng 03 năm 2016 Phạm Thị Hạnh HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Kết luận văn kết nghiên cứu đƣợc thực dƣới hƣớng dẫn khoa học GS.TS Hoàng Đình Hòa Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội TS Lê Thị Bích Thủy Trƣởng phòng Di truyền Tế bào thực vật – Viện công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, với giúp đỡ cán sinh viên làm việc phòng Di truyền Tế bào thực vật Viện công nghệ sinh học- Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Nội dung luận văn có tham khảo sử dụng tài liệu, thông tin đƣợc đăng tải tác phẩm, tạp chí trang web theo danh mục tài liệu kham khảo Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm với cam đoan Hà Nội, ngày 22 tháng 03 năm 2016 Phạm Thị Hạnh HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG MỞ ĐẦU CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây Thạch tùng cƣa hoạt chất Huperzin A 1.1.1 Cây Thạch tùng cƣa 1.1.1.1 Giới thiệu chung Thạch tùng cƣa 1.1.1.2 Thành phần hoạt chất có Thạch tùng cƣa 1.1.2 Hoạt chất Huperzin A 1.1.2.1 Tính chất hóa học thuộc tính hóa lý Huperzin A 1.1.2.2 Dƣợc động học Huperzin A 1.1.2.3 Đặc tính chữa bệnh Alzheimer Huperzin A 1.2 Chỉ thị phân tử RAPD 10 1.3 Tình hình nghiên cứu Thạch tùng cƣa Huperzin A 11 1.3.1 Các nghiên cứu Thạch tùng cƣa 11 1.3.2 Các nghiên cứu Huperzin A 14 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị máy móc 16 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 16 2.1.2 Hóa chất thiết bị 18 2.1.2.1 Hóa chất 18 2.1.2.2 Thiết bị 18 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 18 2.2.1 Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số Thạch tùng cƣa 18 2.2.2 Kỹ thuật PCR với mồi RAPD 20 2.2.3 Phân tích số liệu đa dạng di truyền 22 HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI 2.2.4 Phƣơng pháp tách chiết Huperzin A 24 2.2.5 Phƣơng pháp sắc ký mỏng 25 2.2.6 Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 25 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Kết tách DNA tổng số 27 3.2 Kết đánh giá đa dạng di truyền mẫu Thạch tùng cƣa 29 3.2.1 Kết đánh giá mức độ đa hình 29 3.2.2 Kết phân tích mối quan hệ di truyền 33 3.3 Kết định tính định lƣợng Huperzin A 35 3.3.1 Kết định tính Huperzin A mẫu Thạch tùng cƣa thu từ địa điểm lấy mẫu 36 3.3.2 Kết định lƣợng Huperzin A mẫu Thạch tùng cƣa thu từ địa điểm lấy mẫu 37 3.3.3 Kết định tính Huperzin A từ phận thời điểm lấy mẫu Thạch tùng cƣa khác 39 3.3.4 Kết định lƣợng Huperzin A từ mẫu Thạch tùng cƣa 41 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DNA : Deoxyribonucleic acid RNA : Axit ribonucleotide CTAB : Cetyltrimethyl amoniumbromide dNTP : Deoxynucleosid triphosphat EDTA : Ethylene diamin tetra acetate Kb : Kilo base PCR : Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase chain reaction) RAPD : DNA đa hình đƣợc nhân ngẫu nhiên ( Random Amplyfied Polymorphic DNA) SSR : Các trình tự lặp lại đơn giản (Simple Sequence Repeats) AFLP: : Đa hình đọ dài nhân chọn lọc (Amplified Fragment Length Polymorphism) RFLP : Đa hình độ dài đoạn cắt hạn chế (Restriction Fragment Length Polymorphism UPLC - MS : Sắc ký lỏng siêu cao áp ghép đầu dò khối phổ (Ultra Performance Liquid Chromatography -mass spectrometry ) MMSE : Mini – mental state examination Taq Polymerase : Thermus aquaticus Polymerase TBE : Tris base, Boric acid, EDTA TE : Tris EDTA H serrata : Huperzia serata ACh : Acetylcholine BuChE : Butyrylcholinesterase AChE : Acetylcholinesterase HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI TLC : Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng) HPLC : High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) ACN : Acetonitrile LC/MS : Sắc ký lỏng khối phổ MeOH : Methanol HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cây thạch tùng cƣa Hình 1.2 Đại diện cho nhóm hợp chất Lycopodium alkaloids thu từ H serrata: Fawcettimine (A), lycodine (B),Lycopodine (C),phlegmarine (D) Hình 1.3 Hai dạng đồng phân quang học Huperzin A Hình 1.4 Cấu trúc tƣơng tự Huperzin A ACh Hình 2.1 Bản đồ vị trí lấy mẫu Sa Pa 17 Hình 2.2 Bản đồ vị trí lấy mẫu Đà Lạt 17 Hình 3.1 Kết điện di tách chiết DNA tổng số từ mẫu Thạch tùng cƣa 27 Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm PCR-RAPD với mồi OPC1 30 Hình 3.3 Kết điện di sản phẩm PCR-RAPD với mồi OPC8 30 Hình 3.4 Kết điện di sản phẩm PCR-RAPD với mồi OPC18 31 Hình 3.5 Kết điện di sản phẩm PCR-RAPD với mồi OPC20 31 Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm PCR-RAPD với mồi OPB6 31 Hình 3.7 Kết điện di sản phẩm PCR-RAPD với mồi OPB10 32 Hình 3.6 Quan hệ di truyền mẫu Thạch tùng cƣa nghiên cứu 35 Hình 3.7 Hình ảnh chạy sắc ký mỏng Huperzin A từ mẫu Thạch tùng cƣa 36 Hình 3.8 Đƣờng chuẩn định lƣợng Huperzin A 38 Hình 3.9 Hình ảnh chạy sắc ký mỏng Huperzin A từ Thạch tùng cƣa thu DL1 40 Hình 3.10 Hình ảnh chạy sắc ký mỏng Huperzin A từ Thạch tùng cƣa thu SP1 41 Hình 3.11 Sắc kí đồ HPLC (UV 310 nm) phát Huperzin A 42 Hình 3.12 Phổ ESI- MS positive pic ion phân tử 243,0 [M+H]+ Huperzin A 42 HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Địa điểm lấy mẫu sử dụng nghiên cứu 16 Bảng 2.2 Trình tự nucleotide mồi RAPD sử dụng nghiên cứu 22 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR-RAPD 22 Bảng 2.4 Bảng gradient nồng độ rửa giải 26 Bảng 3.1 Kết đo độ hấp thụ bƣớc sóng 260 nm, 280 nm nồng độ DNA tổng số mẫu Thạch tùng cƣa nghiên cứu 28 Bảng 3.2 Tổng hợp kết phân tích mẫu Thạch tùng cƣa với mồi RAPD cho đa hình 33 Bảng 3.3 Hệ số tƣơng đồng di truyền mẫu Thạch tùng cƣa 34 Bảng 3.4 Các thang nồng độ đƣờng chuẩn định lƣợng Huperzin A 37 Bảng 3.5 Kết phân tích định lƣợng mẫu Thạch tùng cƣa 39 Bảng 3.6 Kết phân tích định lƣợng Huperzin A mẫu Thạch tùng cƣa Sa Pa 43 HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI MỞ ĐẦU Ngày nay, với phát triển kinh tế, ngƣời có xu hƣớng ăn uống sinh hoạt không điều độ dẫn tới khả dễ mắc số bệnh già làm giảm tuổi thọ Có nhiều bệnh nguy hiểm gây tử vong ngƣời già Alzeimer chứng bệnh gây tử vong ngƣời cao tuổi đứng hàng thứ Đây bệnh thoái hóa não không hồi phục, gây chứng sa sút trí tuệ ngƣời cao tuổi Tổn thƣơng tế bào thần kinh vỏ não cấu trúc xung quanh làm sa sút trí nhớ, giảm phối hợp vận động, giảm cảm giác, nhận cảm sai…, cuối trí nhớ chức tâm thần, khó khăn đứng Xuất phát từ ảnh hƣởng tiêu cực bệnh Alzeimer, có nhiều công trình nghiên cứu đƣợc tiến hành nhằm tìm nguyên nhân cách chữa trị chứng bệnh Các nhà khoa học Mỹ mở tia hy vọng cho bệnh nhân Alzheimer với công trình khoa học khẳng định việc "bắt chết" enzym liên quan đến bệnh Alzheimer Huperzin A chất thuộc nhóm Alkaloide có Thạch tùng cƣa có khả xuyên qua hàng rào mạch máu não tác động trực tiếp lên não với liều lƣợng thấp tính microgram Chính vậy, theo nhà khoa học, Thạch tùng cƣa cần đƣợc quan tâm nghiên cứu khai thác ứng dụng điều trị bệnh rối loạn trí nhớ, Alzheimer Đối với nƣớc Việt Nam chúng ta, tỷ lệ ngƣời cao tuổi ngày gia tăng rối loạn trí nhớ phát triển, dẫn đến nhu cầu chữa bệnh tăng lên Trong nhà khoa học giới phát công dụng đặc biệt loài Thạch tùng cƣa có nhu cầu lớn để tách chiết hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên nhằm giảm thiểu tác dụng phụ, Việt Nam Thạch tùng cƣa phát đƣợc Sa Pa (Lào Cai) Đà Lạt (Lâm Đồng) Ở Lào Cai loài lại số nơi rừng tự nhiên Ở Đà Lạt số sở nhân giống nhà nƣớc nhƣ tƣ nhân tạo đƣợc vài vƣờn giống loài với mục đích thƣơng mại, vƣờn chƣa HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI nhiều bố trí chƣa Tại số Viện, Trung tâm nghiên cứu nuôi cấy mô Việt Nam lƣu giữ đƣợc điều kiện nuôi cấy invitro loài Thạch tùng cƣa Huperzia serrata, nhiên dừng lại mức độ nghiên cứu lƣu giữ nhân phòng thí nghiệm Hoàn toàn chƣa có công bố nghiên cứu Thạch tùng cƣa nƣớc Chính vậy, thực đề tài: “Nghiên cứu đa dạng di truyền hàm lượng Huperzin A loài Thạch tùng cưa thu từ Sa Pa Đà Lạt” nhằm phục vụ cho việc khai thác phát triển nguồn gen Thạch tùng cƣa Việt Nam Mục tiêu đề tài : - Đánh giá đƣợc mức độ đa dạng di truyền thị phân tử loài Thạch tùng cƣa sinh trƣởng Sa Pa Đà Lạt, Việt Nam - Nghiên cứu định tính định lƣợng Huperzin A Thạch tùng cƣa Việt Nam Nội dung nghiên cứu: - Đánh giá đa dạng di truyền thị phân tử RAPD với xuất xứ Thạch tùng cƣa - Xác định hàm lƣợng Huperzin A Thạch tùng cƣa thời điểm vùng sinh thái khác HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Thạch tùng cƣa Kết tƣơng tự với kết nghiên cứu Ma X cộng (2005)[22] Ở hình B vết sắc ký mẫu mùa Thu đậm hẳn vết mẫu mùa xuân nhiên sắc ký đồ mẫu vệt dài số vạch vị trí khác Nhƣ kết luận sơ bộ, chiết đƣợc Huperzin A từ mẫu Thạch tùng cƣa hai mùa Xuân Thu, dịch chiết lẫn nhiều tạp chất lƣợng Huperzin A tách chiết từ mẫu mùa Thu nhiều mùa Xuân Mẫu mùa Xuân mùa Thu đƣợc sử dụng để tiến hành định lƣợng phƣơng pháp sắc ký hiệu cao HPLC Hình 3.9 Hình ảnh chạy sắc ký mỏng Huperzin A từ Thạch tùng cƣa thu DL1 A Mẫu mùa Xuân (1: Huperzin A chuẩn, 2: dịch chiết từ lá, 3: dịch chiết từ thân, 4: dịch chiết từ rễ) B Mẫu mùa Thu (1: Huperzin A chuẩn, 2: dịch chiết từ lá, 3: dịch chiết từ thân, 4: dịch chiết từ rễ) Đối với mẫu Thạch tùng cƣa mùa Thu mùa Xuân thu từ Sa Pa, hàm lƣợng Huperzin A nhỏ tiến hành tách chiết Huperzin A từ để chạy TLC (hình 3.10) Tuy nhiên, sắc ký đồ TLC mẫu mùa Xuân HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047 40 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI không xuất vệt đốm vàng có Rf trùng với mẫu chất chuẩn Đối với mẫu mùa Thu vệt đốm vàng mờ Hình 3.10 Hình ảnh chạy sắc ký mỏng Huperzin A từ Thạch tùng cƣa thu SP1 (1: Huperzin A chuẩn, 2: mẫu mùa Xuân, 3: mẫu mùa Thu) Từ kết TLC kết luận sơ hàm lƣợng Huperzin A mẫu thutừ Sa Pa nhỏ nên việc thực TLC cho vệt sắc ký bị mờ Để tiến hành định lƣợng Huperzin A mẫu Thạch tùng cƣa thu Sa Pa, tiến hành định lƣợng mẫu Thạch tùng cƣa mùa Thu HPLC 3.3.4 Kết định lƣợng Huperzin A từ mẫu Thạch tùng cƣa Kết phân tích định lƣợng mẫu Thạch tùng cƣa Đà Lạt thể hình 3.11 HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047 41 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Hình 3.11 Sắc kí đồ HPLC (UV 310 nm) phát Huperzin A[chất thị Huperzin A (A), mẫu Thạch tùng mùa Xuân (B) mẫu Thạch tùng mùa Thu (C)] Hình 3.12 Phổ ESI- MS positive pic ion phân tử 243,0 [M+H]+ Huperzin A Dựa vào đƣờng chuẩn định lƣợng tính đƣợc kết hàm lƣợng Huperzin A mẫu Thạch tùng cƣa mùa Xuân thu từ DL1 75,4 (µg.g-1 mẫu khô), mùa Thu 92,5 (µg.g-1 mẫu khô) Từ kết định lƣợng phƣơng HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047 42 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI pháp HPLC, nhận thấy hàm lƣợng Huperzin A mẫu Thạch tùng cƣa mùa Thu cao so với mẫu mùa Xuân 17,1 (µg.g-1 mẫu khô) Kết định lƣợng hàm lƣợng Huperzin A mẫu Thạch tùng cƣa thu vào mùa Thu mùa Xuân DL3 cho kết hàm lƣợng Huperzin A thu vào mùa Thu cao mùa Xuân Nhƣ vậy, thời điểm khác năm hàm lƣợng Huperzin A Thạch tùng cƣa có khác Kết phù hợp với nghiên cứu Ma cộng kết luận hàm lƣợng Huperzin A thay đổi rõ rệt thời điểm khác năm, giảm dần bắt đầu vào mùa đông tăng dần vào mùa hè, với hàm lƣợng cao vào mùa Thu thấp vào đầu mùa Xuân [22] So sánh hàm lƣợng Huperzin A Thạch tùng cƣa Đà Lạt Trung Quốc (80,2- 182,6 µg.g-1) cho thấy gần tƣơng đƣơng Tuy nhiên, hàm lƣợng lại thấp khoảng lần so với mẫu Huperzia elmeri Philippines (608 µg.g-1) thấp khoảng lần so với mẫu Huperzia carinata Queensland, Australia (1030 µg.g-1)[11] Cây Thạch tùng cƣa Đà Lạt có hàm lƣợng Huperzin A gần tƣơng đƣơng với loài Trung Quốc nhỏ nhiều so với chi Huperziaceae nhƣng khác loài Australia Philippines Định lượng Huperzin A từ mẫu Thạch tùng cưa thu Sa Pa: mẫu Thạch tùng cƣa thu Sa Pa từ tháng năm 2015 thu địa điểm đƣợc sấy 50ºC nghiền nitơ lỏng, tách chiết Huperzin A MeOH tiến hành chạy LC/MS Định lƣợng Huperzin A cho kết bảng 3.6 Bảng 3.6 Kết phân tích định lƣợng Huperzin A mẫu Thạch tùng cƣa Sa Pa Mẫu phân tích Hàm lƣợng chất phân tích /mẫu (µg/g) SP1 12,571 SP5 11,304 HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047 43 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Từ kết định lƣợng hàm lƣợng Huperzin A cho thấy hàm lƣợng Huperzin A mùa Thu địa điểm Sa Pa dao động từ 11,304 đến 12,571 µg/g, thấp khoảng lần hàm lƣợng Huperzin A thu vào mùa Thu Đà Lạt đƣợc thu chiết xuất điều kiện HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047 44 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN 4.1 Kết luận Kết đánh giá đa dạng di truyền mẫu cho thấy hệ số tƣơng đồng di truyền mẫu gần dao động từ 0,71 đến 0,89, đƣợc chia thành nhóm Hai cặp mẫu có quan hệ di truyền gần DL1 DL2; SP1 SP3.Trong số mồi RAPD sử dụng có mồi thể tính đa hình Hệ số PIC trung bình cao 0,593 Đã định tính đƣợc Huperzin A mẫu Thạch tùng cƣa thu Sa Pa Đà Lạt TLC chiết HCl 0,5% hệ dung môi chạy sắc ký chloroform- isopropanol- ethyl acetate- ammonia (4- 1,5- 4- 0,1) Định lƣợng Huperzin A hệ thống LC/MS chọn đƣợc mẫu Thạch tùng cƣa có hàm lƣợng Huperzin A cao SP1, SP5, DL1 DL3 Kết định lƣợng Huperzin A rễ, thân cho thấy hàm lƣợng Huperzin A mẫu cao MẫuThạch tùng cƣa Đà Lạt (mùa Thu 92,5µg.g-1 mẫu khô; mùa Xuân 75,4 µg.g-1 mẫu khô) cao gấp khoảng lần lƣợng Huperzin A mẫu thu Sa Pa (cao vào mùa Thu 12,571µg.g-1 mẫu khô) 4.2 Kiến nghị Cần tiếp tục thực đánh giá đa dạng di truyền với nhiều mồi RAPD để tăng tính tin cậy kết nghiên cứu Từ kết nghiên cứu định tính định lƣợng Huperzin A, tiếp tục khảo sát tìm phƣơng pháp tối ƣu tách chiết để thu hồi Huperzin A phục vụ y học HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047 45 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Khuất Hữu Thanh (2012) KỸ THUẬT GEN: Nguyên lý ứng dụng Nxb Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Nguyễn Đức Thành (2014) Các kỹ thuật thị DNA nghiên cứu chọn lọc thực vật Tạp chí sinh học, 36 (3), 265-294 Nguyễn Đức Thành (2015) Các kỹ thuật thị DNA nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen chọn giống thực vật Hà Nội: Nxb Khoa học Tự nhiên Công nghệ TÀI LIỆU TIẾNG ANH Ana Ferreira, Marcio Rodrigues, Ana Fortuna, Amilcar Falcao, Gilberto Alves (2014) Huperzin A from Huperzia serrata: a review of its sources, chemistry, pharmacology and toxicology Phytochemistry Rev , 1-35 Bai D (2007) Development of Huperzin A and B for treatment of Alzheimer’s disease Pure Appl Chem, 79, 469–479 Bialer M, Johannessen SI, Kupferberg HJ et al (2007) Progress report on new antiepileptic drugs: a summary of the eighth Eilat conference (EILAT VIII) Epilepsy Res, 73, 1–52 Bialer M, Johannessen SI, Levy RH et al (2010) Progress report on new antiepileptic drugs: a summary of the tenth Eilat conference (EILAT X) Epilepsy Res, 92, 89–124 De - Li Wang, Yao Dong Qui, Jin - Dong Feng and Jian - He Wei (2011) An Efficient Regeneration Pattern via Gemmae for Huperzia serrata (Thunb ex Murray) Trev in Hainan Province, China American Fern Journal 101(3),182-192 Ding R, Sun B-F, Lin G-Q (2012) An efficient total synthesis of (-)Huperzin A Org Lett, 44, 4446–4449 HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047 46 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI 10 Foolad, Arusekar, Rodriguer (1995) Application of polymerase Chain Reation (PCR) to plant genome analysis, In: Tissue and organ culture, Fundamenatal methods Springer Verlag Berlin, Heuidelerg 281-289 11 Goodger JQD, Whincup AL, Field AR, Holtum JAM, Woodrow LE (2008) Variation in Huperzin A and B in Australasian Huperzia species Biochemical Systematics and Ecology, 36 (8), 612- 618 12 Ha GT, Wong RK, Zhang Y (2011) Huperzin A as potential treatment of Alzheimer’s disease: an assessment on chemistry, pharmacology, and clinical studies Chem Biodivers, 8, 1189–1204 13 Ha GT, Wong RK, Zhang Y (2011) Huperzin A as potential treatment of Alzheimer’s disease: an assessment on chemistry, pharmacology, and clinical studies Chem Biodivers, 8, 1189–1204 14 Haudrechy A, Chassaing C, Riche C, Langlois Y (2000) A formal synthesis of (+)Huperzin A Tetrahedron, 56, 3181–3187 15 Ji Huang, Chengzhong He (2010) Population structure and genetic diversity of Huperzia serrata (Huperziaceae) based on amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers Biochemical Systematics and Ecology, 38, 1137-1147 16 Kan’ichiro Ishiuchi , Jeong-Jin Park, Robert M Long, David R Gang (2013) Production of Huperzin A and other Lycopodium alkaloids in Huperzia species grown under controlled conditions and in vitro Phytochemistry, 91, 1-256 17 Kozikowski AP, Tu¨ckmantel W (1999) Chemistry, pharmacology, and clinical efficacy of the chinese nootropic agent Huperzin A Acc Chem Res, 32 , 641–650 18 Liang H (2010) "Establishment of the tissue culture system of Huperzia Serrataand effects of phytohormones on multiple shoot growth and Huperzin A accumulation" Hefei Univ Tech., Hefei HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047 47 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI 19 Lim WH, Goodger JQ, Field AR, Holtum JA, Woodrow IE (2010) Huperzin Alkaloids from Australasian and southeast Asian Huperzia Pharm Biol, 48 (9), 1073-1078 20 Liu JS, Yu CM, Zhou YZ et al (1986) Study on the chemistry of HuperzineA and huperzine-B Acta Chim Sin, 44, 1035-1040 21 Ma X, Tan C, Zhu D et al (2007) Huperzin A from Huperzia species-an ethnopharmacolgical review J Ethnopharmacol, 113, 15–34 22 Ma X, Tan C, Zhu D, Gang DR (2005) Is there a better source of Huperzin A than Huperzia serrata? Huperzin A content of Huperziaceae species in China J Agric Food Chem, 53, 1393–1398 23 M Maridass, G Raju, R Mahesh, K Muthuchelian, K Dharmar and Abiya Chelliah (2011) Ex situ conservation of endemic fern allies, Huperzia hilliana (Spring) R.D Dixit International Journal of Applied Bioresearch 16 24 Nei M (1973) Analysis of gene diversity in subdivided population Proc Natl Acad Sci, 70, 3321-3323 25 Qian BC, Wang M, Zhou ZF et al (1995) Pharmacokinetics of tablet Huperzine A in six volunteers Acta Pharmacol Sin , 16, 396–398 26 Rishuang Bao, Peipei Yin, et al (2012) "Effects of different media on the transplantation of Huperzia serrata (Thunb.) Trev." Full Length Research Paper 27 Saghai – Maroof, MA, Soliman K, Jorgensen RA and Allard RW (1984) Ribosomal DNA Spacer – length polymorphism in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics Proc Natl Acad Sci USA 81: 8014 - 8019 28 Szypula W, Pietrosiuk A, Suchocki P (2005) “Somatic embryogenesis and in vitro culture of Huperzia selago shoots as a potential source of Huperzin A” [J] Plant Sci.,168(6):1443-1452 HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047 48 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI 29 Wang Y, Chu D, Gu J et al (2004) Liquid chromatographictandemmass spectrometric method for the quantitation of Huperzin A in dog plasma J Chromatogr B 803 , 375–378 30 Wang YE, Feng J, Lu WH, Tang XC (1988) Pharmacokinetics of Huperzin A in rats and mice Acta Pharmacol Sin , 9, 193–196 31 Wen Yun Gao, Yi Ming Li, Bao De Wang, Da Yuan Zhu (1999) Huperzin A, a New Lycopodium Alkaloid from Huperzia serrata chinese chemical letter , 10 (6), 463-466 32 Wu Q, Gu Y (2006) Quantification of Huperzin A in Huperzia serrata by HPLC-UV and identification of the major constituents in its alkaloid extracts by HPLC-DAD-MS-MS J Pharm Biomed Anal, 40, 993–998 33 Wu T-Y, Chen C-P, Chen C-P, Jinn T-R (2011) Traditional Chinese medicines and Alzheimer’s disease Taiwan J Obs Gynecol, 50, 131–135 34 Yang Y-B, Yang X-Q, Xu Y-Q et al (2008) A New Flavone Glycoside from Huperzia serrata Chin J Nat Med, 6, 408–410 35 Zhang Jingcai et al (2013) Detarmination of Huperzin A in the extract of Huperzia serrata by high performance liqid chromatography Chinese Journal of Chromatogaraphy , 31, 79-82 TRANG WEB 36 www.Irc-hueuni.edu.vn/dongy/thuocdongy/Thachtungrangcua 37 https://vi.wikipedia.org/wiki/Chân_sói_(Cây) HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047 49 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI PHỤ LỤC Phụ Lục 1: Sắc ký đồ định lƣợng mẫu Thạch tùng cƣa từ địa điểm lấy mẫu Huperzin A A B Huperzin A C Huperzin A D Huperzin A HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047 i LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI E Huperzin A F Huperzin A G Huperzin A H Huperzin A HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047 ii LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Huperzin A I Ghi chú: A: mẫu chất chuẩn, B: mẫu SP1, C: mẫu SP1, D: mẫu SP3, E: mẫu SP4, F: mẫu SP5, G: mẫu DL1, H: mẫu DL2, I: mẫu DL3 Phụ lục 2: Sắc ký đồ định lƣợng Huperzin A Thạch tùng cƣa thu hái vào mùa xuân mùa thu DL3 A Huperzin A B Huperzin A Ghi chú: A: mẫu thu hái vào mùa Thu DL3, B: mẫu thu hái vào mùa Xuân DL3 HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047 iii LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Phụ lục 3: Sắc ký đồ định lƣợng Huperzin A Thạch tùng cƣa thu hái vào mùa Thu SP1 SP5 Huperzin A B Huperzin A C Huperzin A Ghi chú: A: mẫu chất chuẩn, B: mẫu SP5, C: mẫu SP1 HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047 iv LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047 TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI v ... độ a dạng di truyền thị phân tử loài Thạch tùng c a sinh trƣởng Sa Pa Đà Lạt, Việt Nam - Nghiên cứu định tính định lƣợng Huperzin A Thạch tùng c a Việt Nam Nội dung nghiên cứu: - Đánh giá a dạng. .. đề tài: Nghiên cứu a dạng di truyền hàm lượng Huperzin A loài Thạch tùng c a thu từ Sa Pa Đà Lạt nhằm phục vụ cho việc khai thác phát triển nguồn gen Thạch tùng c a Việt Nam Mục tiêu đề tài... đổi di truyền, xác định loài, xác định lai 1.3 Tình hình nghiên cứu Thạch tùng c a Huperzin A 1.3.1 Các nghiên cứu Thạch tùng c a Từ xa x a y học cổ truyền Trung Quốc sử dụng Thạch tùng c a thu c