, PCR)
1.6. Một số nghiên cứu sử dụng Marker phân tử trong nghiên
định gene thơm
Đa số các tác giả cho rằng hƣơng thơm ở lúa do một gene lặn fgr nằm trên nhiễm sắc thể số 8 kiểm soát và không có sự ảnh hƣởng của tế bào chất. Theo Ahn (1992), sử dụng 126 chỉ thị phân tử để lập bản đồ vị trí của gene thơm fgr trong giống lúa thơm Lemont (thu nhận đƣợc từ giống lúa thơm Della), kết quả đã xác định đƣợc gene ở vị trí 4,5cM trên NST số 8 bằng chỉ thị RFLP (RG28) [21]. Ngƣời ta đã tìm thấy gốc hóa học 2-acetyl-1-pyrroline có trong giống Basmati 370 và Jasmine, nó đƣợc xem là chất quyết định về sự thể hiện mùi thơm trong lúa gạo.
Tác giả Tomar (1997), trong nghiên cứu đã phát hiện 1 gene trội nằm trên NST số 11 kiểm soát tính trạng mùi thơm của giống lúa Baspatri [78]. Trong một nghiên cứu khác, tác giả Siddiq (1986), đã đƣa ra kết luận, định vị đƣợc hai gene lặn liên quan đến tính trạng hƣơng thơm trên NST số 5 và số 9 ở giống lúa T3 của Ấn Độ. Những báo cáo này đã đƣa ra giả thuyết rằng có
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
rất nhiều gene trội hoặc gene lặn liên quan đến tính trạng hƣơng thơm của lúa [70]. Một số tác giả khác khi nghiên cứu sự phân li tính trạng thơm và không thơm của các cá thể ở thế hệ F2, lại cho rằng có 2, 3 thậm chí 4 locus gene kiểm soát tính trạng mùi thơm ở lúa (Dhulappanavar, 1976; Geetha et al., 1994) [39], [40].
Theo Lorieux (1996), đã định vị đƣợc bản đồ của gene fgr khi nhóm nghiên cứu xác định gene fgr đƣợc chặn bởi chỉ thị phân tử RG28 và RG1, ở khoảng cách lần lƣợt là 6,4 ± 2,6 và 5,3 ± 2,7cM. Xác nhận mối liên kết gần giữa RG28 và fgr (5,8cM) trên NST số 8 và xác định hai QTL đối với hƣơng thơm, một trên NST số 4 và 1 trên NST số 12 [51].
Tác giả Shu Xia Sun (2008), tiến hành kiểm tra gene thơm và không thơm trên lúa ở nhiễm sắc thể số 8 bằng kỹ thuật SSR với tám cặp mồi. Kết quả cho thấy rằng cặp mồi Ch - 29B và R2 không đa hình mà chỉ cặp mồi Aro7 đa hình, kích thƣớc của cặp mồi Aro7 đƣợc xác định 302 bp. Ngoài ra, cũng xác định đƣợc mồi RM23097 liên kết với locus hƣơng thơm với khoảng cách là 0,71cM. Các gene thơm (fgr) đƣợc thể hiện giữa marker Aro7 (0,57cM) và RM515 (0,71cM). Dựa trên cơ sở liên kết phân tử và BAC (bacterial artificial chromosome) trên nhiễm sắc thể số 8 đƣợc xây dựng (hình 1.2) [69].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 1.2.Vị trí gene thơm trên nhiễm sắc thể số 8
Tại Việt Nam, những nghiên cứu về giống lúa chất lƣợng bản địa các nghiên cứu chuyên sâu về sự di truyền liên quan đến tính trạng hƣơng thơm cũng đã đƣợc một số tác giả đề cập. Trong đó nghiên cứu di truyền của mùi thơm trên lúa cho thấy gene điều khiển tính trạng mùi thơm là một gene lặn (Nguyễn Thị Lang, 2000) [5]. Phân tích DNA marker liên kết với gene mùi thơm fgr nằm trên đoạn nhiễm sắc thể số 8 của giống lúa Della thông qua kỹ thuật RFLP, đƣợc nghiên cứu trên quần thể dòng gần nhƣ đẳng gene (NILs) ( Bui chi Buu, 2003) [27]. Phân tích bản đồ RFLP cho thấy sự liên kết đơn gene lặn fgr với RG 28 trên nhiễm sắc thể số 8, có khoảng cách di truyền 4,5cM. Marker phân tử liên kết rất chặt với gene điều khiển mùi thơm fgr và từ đó ngƣời ta có thể phát hiện đồng hợp tử và dị hợp tử trong thế hệ phân ly ban đầu, rút ngắn thời gian cải tiến trong chọn giống. Nghiên cứu ứng dụng microsatellite đã thiết kế bản đồ mùi thơm trên nhiễm sắc thể và kết luận RM223 liên kết với fgr khá chặt, giá trị khoảng cách di truyền 1,6 cM ( Lang và cs, 2006) [9].
Theo Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu (2005), đã thông qua kết quả phân tích HPLC trên mẫu gạo IR 64, Azucena, và Basmati, chứng minh pentanol, hexanol, benzaldehyde, và 2-acetyl-1 pyrroline, trong đó 2-acetyl-1 pyrroline là thành phần chính trong mùi thơm của gạo [6].
Tác giả Dƣơng Xuân Tú và cs (2008), đã nghiên cứu và sử dụng chỉ thị phân tử DNA để xác định gene thơm điều khiển tính trạng mùi thơm trong lúa gạo phục vụ công tác chọn tạo giống lúa thơm, công trình đƣợc tiến hành từ năm 2007 đến 2008 tại Viện Cây lƣơng thực và Cây thực phẩm. Kết quả
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
đã lựa chọn đƣợc 2 chỉ thị là L05 và BADH2 gồm 4 mồi: EAP, ESP, IFAP, INSP có thể sử dụng để phân biệt chính xác giữa các giống lúa có mùi thơm do gene fgr điều khiển và giống lúa không thơm (không mang gen fgr). Sử dụng chỉ thị BADH2 để phân biệt các dòng lúa thơm trong tổng số 420 dòng lúa từ các thế hệ F4 đến F6 và các dòng đơn bội kép, kết quả đã chọn ra đƣợc 73 dòng lúa mang gene thơm fgr đồng hợp tử và 91 dòng lúa mang gen thơm
fgr dị hợp tử [21].
Kết quả xác định gene thơm trong tập đoàn từ F4 tới F6 và một số dòng DH (dòng thuần đƣợc tạo ra từ nuôi cấy bao phấn) đƣợc chọn lọc từ các tổ hợp lai giữa các giống lúa thơm và không thơm cho thấy: Trong 420 dòng lúa đƣợc đánh giá có 73 dòng mang gene thơm đồng hợp tử (chiếm 17,4%), có 91 dòng mang gene thơm dị hợp tử (chiếm 21,7%) và 256 dòng không mang gene thơm (chiếm 60,9%). Các dòng lúa mang gene thơm đồng hợp tử là các dòng đã thuần về tính trạng gene thơm fgr sẽ đƣợc đánh giá và đƣa vào so sánh, đánh giá các tính trạng nông học khác, các dòng mang gene thơm dị hợp tử sẽ đƣợc tiếp tục lựa chọn để chọn ra các dòng thuần về gene thơm. Tuy nhiên, tỷ lệ rất cao của các dòng không mang gene thơm trong tập đoàn các dòng lúa mới cho thấy việc cần thiết phải chọn các cá thể và dòng mang gene thơm từ các thế hệ sớm hơn nhƣ F2, F3 để giảm khối lƣợng các dòng cần phải đƣa vào đánh giá và chọn lọc trong các thế hệ về sau.
Tác giả Nguyễn thị Lang và Bùi Chí Bửu (2010), tiến hành xác định kiểu gene thơm của 16 giống lúa địa phƣơng và 49 giống cải tiến. Xác định mục tiêu gene bằng chỉ thị phân tử SSR với mồi RM223 và STS (RG 28Fl- RB). RG28 đƣợc chuyển vào STS và khuếch đại gene bằng kỹ thuật PCR từ các giống lúa khác nhau của gene mùi thơm. Kết quả cho thấy độ chính xác 100% trong việc xác định gene thơm [8].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu
Vật liệu nghiên cứu bao gồm:
Tổng số 50 giống lúa Chất lƣợng đƣợc thu thập ở nhiều địa phƣơng khác nhau, đang đƣợc lƣu giữ và bảo tồn tại Ngân hàng gene hạt của Trung tâm Tài Nguyên Thực vật và Viện Di Truyền Nông Nghiệp (bảng 2.1);
31 cặp mồi SSR đƣợc sử dụng để phân tích thuộc các locus RM đƣợc chọn lọc từ 2240 cặp mồi, do hãng Invitrogen cung cấp dựa vào các thông tin về trình tự, kích thƣớc, số allele chuẩn trên mỗi locus, vị trí phân bố của các locus ở trên 12 NST khác nhau (bảng 2.2).
2.1.2. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệmDụng cụ thí nghiệm Dụng cụ thí nghiệm
Máy li tâm eppendorf, Máy đo pH HANNA, Máy nhân bản gen (PCR), Bộ máy điện di đứng CBS, Bộ máy điện di ngang CBS, Bộ chụp ảnh gel, Tủ sấy memmert, Cân phân tích, Nồi hấp, Tủ bảo quản mẫu 4°C, pipetman, Ống eppendorf,…
Hoá chất sử dụng trong tách chiết DNA
Hoá chất tách chiết DNA bao gồm : Nitơ lỏng, EDTA, Tris, CTAB, chloroform, Ethanol hoặc Isopropanol, Enzym Rnase, Axít nucleic có thể đƣợc hoà tan trong nƣớc cất khử trùng hoặc dung dịch TE;
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Đệm tách chiết DNA tổng số (đệm CTAB): CTAB 1%, Tris-HCl 0,1M, EDTA 0,5M, pH 8,0, NaCl 5M, β-mercapthoethanol 14M, Nƣớc cất;
TBE 5x (Tris-borat buffer): Tris base, Boric acid, EDTA 0,5M, pH 8,0.
Hoá chất sử dụng trong phản ứng PCR:
Đệm PCR 10x + MgCl2 25mM của hãng Quiagen hoặc hãng Invitrogen;
dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) của Fermentas, Invitrogen; Mồi xuôi, mồi ngƣợc 5µM;
Taq polymerase của hãng Fermentas, Invitrogen; Nƣớc cất hai lần khử ion.
Hoá chất sử dụng trong điện di:
Điện di gel agarose:
Pha TAE 50x (1 lít) gồm: 242g Tris base; 57,1ml acetic acid; 100ml 0,5M EDTA PH=8; Chuẩn nƣớc cất cho đến 1 lít.
TAE 1x (Tris-acetat- EDTA acid) 1 lít TAE 1x đƣợc pha 20ml TAE 50x + 980ml nƣớc cất.
Điện di gel polyacrylamide:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bảng 2.1. Danh sách 50 giống lúa thu thập dùng trong nghiên cứu
TT SĐK Tên giống Nguồn gốc Kí hiệu TT SĐK Tên giống Nguồn gốc Kí hiệu
1 233 Tám tức Tây Bắc Tây Bắc T1 26 6240 Tám cao cây - T26
2 259 Tám trắng Vĩnh Phúc Vĩnh Phúc T2 27 1406 Khẩu tan pỏn - T27
3 268 Tám đen Hà Đông Hà Nội T3 28 1801 Nếp cái nƣơng Yên Bái T28
4 287 Tám thơm Hải Dƣơng Hải Dƣơng T4 29 18
98
Khẩu nua nƣơng - T29
5 290 Tám thơm Thái Bình Thái Bình T5 30 1982 Khẩu mƣờng hun Lào Cai T30
6 305 Tám tròn Hải Dƣơng Hải Dƣơng T6 31 1990 Ne nƣơng Quảng Trị T31
7 307 Tám đứng Hải Dƣơng Hải Dƣơng T7 32 1997 Chiêm pua T32
8 313 Tám xoăn có râu Hải Dƣơng Hải Dƣơng T8 33 8260 Blào đang - T33
9 314 Tám xoan Bắc Ninh Bắc Ninh T9 34 3963 Plề lẩu chùa Lai Châu T34
10 316 Tám nghệ hạt đỏ - T10 35 4609 Kháu khỉnh Hoà Bình T35
11 317 Tám xoan Vĩnh Phúc Vĩnh Phúc T11 36 5104 Ka tiêu Lạng Sơn T36
12 1048 Tám xoan Hải Hậu Nam Định T12 37 7021 Khẩu lao - T37
13 2375 Tám thơm ấp bẹ Nam Định T13 38 7186 Tẻ nƣơng - T38
14 5117 Tám Xuân Đài Nam Định T14 39 5912 Mao chệt Quảng Ngãi T39
15 5118 Tám tiêu - T15 40 5927 Nếp ông táo Long An T40
16 5119 Tám Xuân Hồng - T16 41 5825 Nàng thơm đặc sản TPHCM T41
17 5120 Tám Nghĩa Hồng Nam Định T17 42 5857 Nàng thơm chợ đào Long An T42
18 5121 Tám con - T18 43 3486 Lúa nàng thơm Bình Định T43
19 5122 Tám Nghĩa Lạc Nam Định T19 44 3536* OM 3536 Vĩnh Long T44
20 5123 Tám Xuân Bắc - T20 45 + An Giang T45
21 5124 Tám Hải Giang Nam Định T21 46 167 An Giang T46
22 5125 Tám Nghĩa Sơn Nam Định T22 47 + Thơm mắn Lâm Đồng T47
23 6212 Tám cổ rụt - T23 48 + Thơm lùn mùa Cần Thơ T48
24 6238 Tám xoan Nam Định T24 49 + Vàng Ba Danh Bạc Liêu T49
25 6239 Tám nghển - T25 50 + Huyết rồng 4 Bạc Liêu T50
Ghi chú: SĐK: Số đăng ký ở ngân hàng gene Quốc gia; (*
): Mã số trong ngân hàng gene của Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long; (+): Giống lúa mùa địa phương miền Nam; (-): Chưa rõ nguồn gốc
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bảng 2.2. Thông tin về các cặp mồi trong nghiên cứu
TT Tên mồi Trình tự mồi NST Kích thƣớc (bp) 1 RM 13 3’-TCCAACATGGCAAGAGAGAG-5’ 5’-GGTGGCATTCGATTCCAG-3’ 5 124-154 2 RM 30 3’-GGTTAGGCATCGTCACGG-5’ 5’-TCACCTCACCACACGACACG-3’ 6 171-183 3 RM 282 3’-CTGTGTCGAAAGGCTGCAC-5’ 5’ –CAGTCCTGTGTTGCAGCAAG-3’ 3 129-150 4 RM 135 3’-CTCTGTCTCCTCCCCCGCGTCG-5’ 5’-TCAGCTTCTGGCCGGCCTCCTC-3’ 3 119-131 5 RM 142 3’-CTCGCTATCGCCATCGCCATCG-5’ 5’-TCGAGCCATCGCTGGATGGAGG-3’ 4 235-238 6 RM 143 3’-GTCCCGAACCCTAGCCCGAGGG-5’ 5’-AGAGGCCCTCCACATGGCGACC-3’ 3 195-207 7 RM 270 3’-GGCCGTTGGTTCTAAAATC-5’ 5’-TGCGCAGTATCATCGGCGAG-3’ 12 104-117 8 RM 153 3’-GCCTCGAGCATCATCATCAG-5’ 5’-ATCAACCTGCACTTGCCTGG-3’ 5 196-234 9 RM 162 3’ –CAAGGTCTTGTGCGGCTTGCGG-5’ 5’ - GCCAGCAAAACCAGGGATCCGG-3’ 6 210-238 10 RM 171 3’-AACGCGAGGACACGTACTTAC-5’ 5’-ACGAGATACGTACGCCTTTG-3’ 10 310-356 11 RM 172 3’-TGCAGCTGCGCCACAGCCATAG-5’ 5’-CAACCACGACACCGCCGTGTTG-3’ 7 159-165 12 RM 174 3’-AGCGACGCCAAGACAAGTCGGG-5’ 5’-TCCACGTCGATCGACACGACGG-3’ 2 207-222 13 RM 224 3’-ATCGATCGATCTTCACGAGG-5’ 5’-TGCTATAAAAGGCATTCGGG-3’ 11 120-152 14 RM 245 3’-ATGCCGCCAGTGAATAGC-5’ 5’-CTGAGAATCCAATTATCTGGGG-3’ 9 136-146 15 RM 257 3’-CAGTTCCGAGCAAGAGTACTC-5’ 5’-GGATCGGACGTGGCATATG-3’ 9 120-170 16 RM264 3’-GTTGCGTCCTACTGCTACTTC-5’ 5’-GATCCGTGTCGATGATTAGC-3’ 8 148-178 17 RM 316 3’- CTAGTTGGGCATACGATGGC- 5’ 5’-ACGCTTATATGTTACGTCAAC-3 9 186-214
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ TT Tên mồi Trình tự mồi NST Kích thƣớc (bp) 18 RM 284 3’-ATCTCTGATACTCCATCCATCC-5’ 5’-CCTGTACGTTGATCCGAAGC-3’ 8 141-149 19 RM 302 3’-TCATGTCATCTACCATCACAC-5’ 5’-ATGGAGAAGATGGAATACTTGC-3’ 1 120-191 20 RM 309 3’-GTAGATCACGCACCTTTCTGG-5’ 5’-AGAAGGCCTCCGGTGAAG-3’ 12 158-180 21 RM 286 3’-GGCTTCATCTTTGGCGAC-5’ 5’-CCGGATTCACGAGATAAACTC-3’ 11 99-128 22 RM 310 3’ -CCAAAACATTTAAAATATCATG-5’ 5’ –GCTTGTTGGTCATTACCATTC-3’ 8 85-120 23 RM 318 3’-GTACGGAAAACATGGTAGGAAG-5’ 5’-TCGAGGGAAGGATCTGGTC-3’ 2 134-154 24 RM 323 3’-CAACGAGCAAATCAGGTCAG-5’ 5’-GTTTTGATCCTAAGGCTGCTG-3’ 1 241-244 25 RM 337 3’-GTAGGAAAGGAAGGGCAGAG-5’ 5’-CGATAGATAGCTAGATGTGGCC-3’ 8 154-194 26 RM 341 3’-CAAGAAACCTCAATCCGAGC-5’ 5’-CTCCTCCCGATCCCAATC-3’ 2 126-186 27 RM 515 3’-TAGGACGACCAAAGGGTGAG-5’ 5’-TGGCCTGCTCTCTCTCTCTC-3’ 8 205-231 28 RM 17 3’-TGCCCTGTTATTTTCTTCTCTC-5’ 5’-GGTGATCCTTTCCCATTTCA-3’ 12 160-171 29 RM 229 3’-CACTCACACGAACGACTGAC-5’ 5’-CACTCACACGAACGACTGAC-3’ 11 108-140 30 RM 166 3’GGTCCTGGGTCAATAATTGGGTTACC5’ 5’-TTGCTGCATGATCCTAAACCGG-3’ 2 315-421 31 RM 223 3’-GAGTGAGCTTGGGCTGAAAC-5’ 5’-GAAGGCAAGTCTTGGCACTG-3’ 8 139-163
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Tách chiết DNA tổng số
Mẫu lá của từng dòng đƣợc thu thập riêng rẽ và tách chiết DNA tổng số theo phƣơng pháp CTAB của Obara và Kako (1998) [59] có cải tiến, quy trình tách chiết nhƣ sau:
1. Chuẩn bị sẵn dung dịch đệm chiết CTAB ở 600C;
2. Nghiền 0,3 gam mẫu lá bằng chày cối sứ vô trùng trong nitơ lỏng đến khi thành dạng bột mịn;
3. Hoà tan mẫu đã nghiền nhỏ trong 800 l CTAB buffer và 60 l SDS 10%.
4. Ủ mẫu ở 650
C trong bể ổn nhiệt, thời gian 60 phút;
5. Bổ sung hỗn hợp CHCl3-IsoA (24:1) với tỷ lệ 1:1 về thể tích so với dịch mẫu. Lắc nhẹ, ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Hút dung dịch phía trên chuyển sang ống mới;
6. Tiếp tục chiết lần 2 bằng hỗn hợp CHCl3-IsoA (24:1). Thu đƣợc dịch chiết chứa DNA;
7. Tủa DNA bằng ethanol đã làm lạnh. Để ở -200C trong 1 giờ; 8. Ly tâm thu tủa 14000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C;
9. Rửa tủa bằng etanol 70%, ly tâm thu tủa, làm khô và hoà tan trong đệm TE;
10. Độ tinh sạch và nồng độ DNA tổng số đƣợc kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1% cùng với lader DNA 25 g/ l.
2.2.2. Phản ứng PCR
Tổng thể tích của phản ứng PCR là 15 µl bao gồm: 1,5µl Đệm PCR 10X; 1,2 µl MgCl2 25mM; 0,3 µl dNTPs 10mM; 0,3 µl Taq DNA
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
polymerase 5U/µl; 1,5 µl mồi xuôi 10µM; 1,5 µl mồi ngƣợc 10µM; 1µl DNA (30ng/µl); 7,7 µl nƣớc cất hai lần khử ion. 2.2.3. Chu trình PCR Cácbƣớc Nhiệt độ (0C) Thờigian Số chu kỳ I 94 5 phút 1 II 94 1 phút 35 56 45 giây 72 1 phút III 72 7 phút 1 Giữ mẫu ở 40C
2.2.4. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel polyacrylamide 6,0% và đƣợc phát hiện dƣới tia cực tím bằng phƣơng pháp nhuộm ethidium bromide.
+ Gel polyacrylamide bao gồm các thành phần sau (bản gel có kích thƣớc 30cm x 12cm): Nƣớc cất khử ion 22,2ml TBE10X 1,5ml Dung dịch acrylamide 40% 6ml Dung dịch APS 10% 300µl Dung dịch TEMED 25µl Tổng thể tích gel 30ml
Trộn đều hỗn hợp các dung dịch trên và dùng xilanh bơm vào giữa hai tấm kính.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
+ Sau 30 phút gel đƣợc polyme hoá hoàn toàn. Lắp ráp máy điện di, tiến hành điện di sản phẩm PCR cùng với thang marker X174 ở điều kiện 150V.
Thời gian điện di khoảng 50 - 60 phút. Lấy gel ra khỏi kính, nhuộm EtBr nồng độ 0,5% trong 15 phút, rửa lại bằng nƣớc sạch. Soi và chụp ảnh