BÁO CÁO KHOA HỌC: "NGHIÊN CỨU SỰ ĐA HÌNH DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT THU THẬP TỪ MÃ ĐÀ VÀ CÁT TIÊN (TỈNH ĐỒNG NAI)" pptx

Trong một công trình công bố gần đây [4], chúng tôi đã phát hiện thấy có những sai khác về hoạt độ một vài enzym bảo vệ oxy hoá cũng như phổ băng ADN giữa các... Để tiếp tục đóng góp nhữ

NGHIÊN CỨU SỰ ĐA HÌNH DI TRUYỀN CỦA MỘT

SỐ LOÀI THỰC VẬT THU THẬP TỪ MÃ ĐÀ VÀ CÁT TIÊN (TỈNH ĐỒNG NAI)

Hà Thị Phúc, Đặng Quang Hưng, Phạm Bảo Yên,

Nguyễn Quang Huy, Nguyễn Vũ Minh Hạnh, Phan

Tuấn Nghĩa

Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội

1 MỞ ĐẦU

Lâm trường Mã Đà thuộc tỉnh Đồng Nai là một trong

những khu vực chịu nhiều tác động của các yếu tố môi

trường khắc nghiệt, đặc biệt là các tác động của chiến tranh hoá học Tuy vậy, cho đến nay vẫn còn rất ít công trình nghiên cứu về các tác động này lên các sinh vật có mặt ở đây Trong một công trình công bố gần đây [4], chúng tôi

đã phát hiện thấy có những sai khác về hoạt độ một vài enzym bảo vệ oxy hoá cũng như phổ băng ADN giữa các

mẫu ốc Bradybaena similaris thu thập được từ khu vực này

so với mẫu ốc cùng loài thu thập được từ Vườn Quốc gia Cát Tiên (Tỉnh Đồng Nai) là nơi có điều kiện sinh thái

tương tự Mã Đà nhưng ít bị tác động của chiến tranh hoá học Để tiếp tục đóng góp những dẫn liệu cho việc đi sâu đánh giá về tác động của điều kiện môi trường lên hệ gen các loài sinh vật ở vùng này, chúng tôi đã mở rộng nghiên cứu tìm hiểu về những khác biệt trong phổ băng ADN giữa một số loài thực vật thu thập từ hai vùng vừa nêu Bài báo này giới thiệu một phần các kết quả thu được

2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU

2.1.Nguyên liệu

Các mẫu thực vật dùng cho nghiên cứu bao gồm các loài:

Trung quân (Ancistocladus tectorius), Quế bì

(Cinnamomum cassia), Săng mây (Segeraea elliptica) và Lộc Vừng (Barringtonia acutangula) Mẫu được thu thập

thành từng cặp loài từ Lâm trường Mã Đà và rừng Quốc gia

Cát Tiên, được TS Trần Đình Nghĩa giúp định tên khoa học

Các oligonucleotide (mồi) được mua của Operon

Technologies Inc (Mỹ), các hoá chất còn lại dùng cho nghiên cứu đều đạt độ tinh khiết phân tích

Bảng 1: Các mồi ngẫu nhiên được sử dụng trong các phản

ứng RAPD

2.2.Phương pháp

- Tách chiết ADN tổng số từ các mẫu thực vật theo quy trình của Stacey và Isaac [7] có cải tiến

- Định lượng ADN bằng đo độ hấp phụ tử ngoại ở bước sóng 260 nm (A260)

- Phân tích phổ băng ADN bằng phương pháp các đoạn ADN đa hình được nhân bản ngẫu nhiên (RAPD) bằng kỹ thuật PCR Một phản ứng RAPD-PCR bao gồm đệm PCR 1x và nồng độ cuối cùng của các chất thành phần là: MgCl2 2,5 mM, dNTPs 0,2 mM, mồi ngẫu nhiên 0,5 mM, 2,5 đơn

vị Taq ADN polymerase và 10-20 ng ADN khuôn Phản ứng được thực hiện qua 45 chu kì lặp lại của 3 bước chính: biến tính ADN khuôn ở 940C, 35 giây, gắn mồi ở 370C, 30 giây và kéo dài chuỗi ở 720C, 1 phút Sản phẩm của RAPD sau đó được điện di trên gel agarose 2%, nhuộm băng bằng ethidium bromide và chụp ảnh để phân tích

3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Xây dựng quy trình tách chiết ADN từ mẫu thực

vật

Để tách chiết ADN từ các mẫu thực vật chúng tôi đã sử dụng qui trình của Stacey và Issac [7], là qui trình đã được dùng với nhiều đối tượng thực vật khác nhau Tuy vậy khi

áp dụng qui trình tách chiết này, chúng tôi không thu được ADN, vì vậy chúng tôi đã thay đổi một số thành phần đệm tách chiết, cụ thể là tăng nồng độ EDTA trong hệ đệm lên

50 mM nhằm loại trừ hoàn toàn tác động phân cắt ADN bởi các nuclease nội bào, tăng nồng độ NaCl từ 0,7M lên gấp đôi nhằm hạn chế sự tạo phức giữa ADN và CTAB, bổ

sung thêm polyvinyl pirrolidone (PVP) và sodium dodecyl sulfate (SDS) để làm tăng khả năng giải phóng ADN cũng như tăng kết tủa một số hợp chất polyphenol, polysacharide

và protein

Qui trình tách chiết tóm tắt gồm các bước: mẫu lá được nghiền với nitơ lỏng, sau đó bổ sung đệm nghiền (Tris HCl

100 mM, pH 8.0, EDTA 50 mM pH8.0, NaCl 1,4 M;

CTAB 2%; PVP 2%; SDS 2%; beta-mecaptoethanol 2%)

đã được làm nóng tới 650C Hỗn hợp được ủ ở 650C trong 1

giờ kết hợp lắc nhẹ Sau khi để nguội đến nhiệt độ phòng,

bổ sung một thể tích tương đương hỗn hợp phenol:

chloroforrm: isoamylalcohol (trộn theo tỷ lệ 25:24:1 về thể tích), lắc mạnh mẫu trong 5 phút và ly tâm ở 6000 vòng/ phút ở 250C trong 10 phút để thu phần dịch trên tủa Bổ sung tiếp 0,1 thể tích tương ứng NaCl 3M cùng hai thể tích ethanol tuyệt đối và chuyển nhanh sang ủ ở –200C trong 1 giờ Ly tâm hỗn hợp để thu tủa ADN ở 14.000 vòng/phút ở

40C trong 15 phút Hoà tan kết tủa trong TE (Tris-HCl 10

mM pH 8,0 có chứa EDTA 2 mM), loại ARN bằng RNAse, tái kết tủa ADN bằng 0,7 lần thể tích isopropanol và hoà tan trở lại trong đệm TE

Kết quả đo độ hấp phụ ở bước sóng 260 nm (A260) và 280

nm (A280) của các chế phẩm ADN thu được (bảng 2) chứng

tỏ sự có mặt của ADN, tỷ số A260/A280 của cả 4 đối tượng đạt khoảng 1,9 đến 2,1 Khi phân tích chất lượng ADN

bằng điện di trên gel agarose (hình 1) cho thấy tất cả 4 mẫu thực vật chọn nghiên cứu thu ở Mã Đà hay Cát Tiên đều chỉ chứa một băng ADN có kích thước lớn, không lẫn

ARN Các kết quả phân tích về độ hấp thụ tử ngoại và điện

di khẳng định qui trình với các cải tiến về thành phần cũng như bước tách chiết kể trên đã cho phép thu được chế phẩm ADN có chất lượng tốt

Bảng 2: Độ hấp phụ ở bước sóng 260 nm và 280 nm của các chế phẩm ADN thực vật

Hình 1: Điện di gel agarose các chế phẩm ADN thực vật

A: Trung Quân , B: Quế Bì, C: Lộc Vừng, D: Săng Mây

M: Thang chuẩn ADN l HindIII MĐ: Mã Đà, CT: Cát Tiên

2 Nghiên cứu phổ băng ADN của các mẫu thực vật thu thập từ Mã Đà và Cát Tiên

Để thu nhận phổ băng ADN của 4 loài thực vật đã lựa chọn chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật RAPD- PCR với các mồi ngẫu nhiên khác nhau có ký hiệu và trình tự được ghi trong bảng 1 Kết quả điện di sản phẩm RAPD-PCR của cả 4 loài với các mồi khác nhau (hình 2, 3, 4 và 5) đều cho thấy có tính đồng hình cao về phổ băng ADN giữa các mẫu cùng loài thu nhận từ Mã Đà và Cát Tiên Tuy vậy, chúng tôi cũng đã bước đầu phát hiện được một số băng đa hình giữa các mẫu cùng loài thu được từ hai vùng này

Khi sử dụng các mồi D5, D6, D7, OPA4, OPA10 và

OPA12 để tìm hiểu phổ băng của loài Trung Quân (hình 2)

chúng tôi đã phát hiện thấy rằng mồi D6 cho kết quả đa hình rõ nét nhất, trong đó có 2 băng với kích thước khoảng 0,8 kb và 1,8 kb chỉ thấy ở mẫu Mã Đà và các băng có kích thước khoảng 0,8 kb và 1,0 kb chỉ xuất hiện ở mẫu Cát

Tiên Ngoài ra mồi D7 cho 2 băng với kích thước khoảng 1,3 kb và 1,4 kb chỉ có ở mẫu Mã Đà Tương tự, mồi

OPA12 cho một băng đa hình với kích thước khoảng 1,3 kb chỉ có ở mẫu Cát Tiên

Đối với loài Quế bì, chúng tôi cũng đã phát hiện được 2 băng đa hình với kích thước khoảng 1,4 kb với mồi OPA4

và OPA12, một băng có kích thước khoảng 1,6 kb với mồi OPA10 Các băng này chỉ có ở mẫu Mã Đà, không có ở Mẫu Cát Tiên (hình 3)

Các mồi OPA4, OPA10 và OPA12 khi được sử dụng với loài Lộc Vừng và Săng Mây đã không có băng nhân bản điển hình vì vậy chúng tôi đã sử dụng các mồi P4, P10, Z16, Z17, Z18 và Z19 Kết quả thu được với loài Lộc Vừng (hình 4) cho thấy có 3 băng đa hình được thể hiện, trong đó các băng có kích thước khoảng 2 kb với mồi Z17 và 1 kb

với mồi Z18 chỉ thấy ở mẫu Mã Đà còn băng 1 kb với mồi Z19 chỉ có ở mẫu Cát Tiên

Tương tự, chúng tôi cũng đã phát hiện được 4 băng đa hình

ở mẫu Săng Mây (hình 5), cụ thể các băng có kích thước khoảng 1,3 kb, 1,5 kb với mồi P4 và băng 1,7 kb với mồi Z18 chỉ thấy ở mẫu Mã Đà còn băng có kích thước khoảng 1,4 kb với mồi P4 chỉ xuất hiện ở mẫu Cát Tiên

4 THẢO LUẬN

Qua nghiên cứu này chúng tôi đã xây dựng được một qui trình tách chiết ADN cải tiến cho các mẫu thực vật Mặc dầu cho đến nay đã có rất nhiều qui trình tách chiết ADN khác nhau từ nguyên liệu thực vật [5, 7], nhưng sự đa dạng

về tính chất của mẫu thực vật, đặc biệt là với mẫu có chứa hàm lượng cao các chất polyphenol, polysacharide thì những qui trình thông thường ít khi cho kết quả Chính vì vậy, những cải tiến trong qui trình mà chúng tôi thiết lập như loại bỏ sự phân cắt của nuclease, kết tủa chọn lọc các tạp chất thông qua sự phối hợp CTAB và nồng độ NaCl

cũng như bổ sung SDS đã cho phép chúng tôi thu nhận

được chế phẩm ADN chất lượng tốt từ 4 mẫu thực vật khác nhau và qui trình được thiết lập có thể dùng cho việc tách chiết ADN từ nhiều mẫu thực vật khác

RAPD là kỹ thuật đã được sử dụng khá phổ biến trong

nghiên cứu tính đa hình di truyền của các loài sinh vật [1,

2, 3, 6, 8], đặc biệt khi mà hệ gen của chúng còn ít được nghiên cứu về trình tự [4, 8] Bằng việc sử dụng kỹ thuật

này, chúng tôi [4] đã phát hiện thấy loài ốc cạn Bradybaena similaris được thu từ Mã Đà có những sai khác về phổ băng

ADN so với phổ băng của cùng loài ốc này nhưng được thu được từ Cát Tiên Ngoài ra, chúng tôi cũng đã phát hiện thấy có sự khác biệt về hoạt độ của enzym catalase,

superoxit dismuatse, NADH oxidase cũng như phổ băng protein giữa hai loại mẫu ốc này

Các số liệu thu được về phổ băng ADN của Trung Quân, Quế Bì, Lộc Vùng và Săng Mây trên đây là những dẫn liệu

bổ sung về những sai khác trong hệ gen của các sinh vật cùng loài nhưng sống trong các điều kiện môi trường khác

nhau Tuy vậy, liệu những sai khác này có liên quan và liên quan như thế nào đến các yếu tố môi trường hay không là vấn đề cần được tiếp tục nghiên cứu Xác định trình tự của những đoạn ADN sai khác cũng như nghiên cứu các

protein được biểu hiện có thể là cơ sở tốt nhất để trả lời câu hỏi vừa nêu

Hình 2: Điện di gel agarose các sản phẩm RAPD-PCR của mẫu Trung Quân với các mồi D5, D6, D7, OPA4, OPA10

và OPA12 M: Thang chuẩn ADN 1 kb, MĐ: Mã Đà, CT: Cát Tiên

Hình 3: Điện di gel agarose sản phẩm RAPD-PCR của mẫu

Quế Bì với các mồi OPA4, OPA10 và OPA12

M: Thang chuẩn ADN 1 kb, MĐ: Mã Đà, CT: Cát Tiên

Hình 4: Điện di gel agarose sản phẩm RAPD-PCR của mẫu

Lộc Vừng với các mồi P4, P10, Z16, Z17, Z18 và Z19 M: Thang chuẩn ADN 1 kb, MĐ: Mã Đà, CT: Cát Tiên

Hình 5: Điện di gel agarose sản phẩm RAPD-PCR của mẫu Săng Mây với các mồi P4, P10, Z16, Z17, Z18 và Z19 M: Thang chuẩn ADN 1 kb, MĐ: Mã Đà, CT: Cát Tiên

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Alberto, F., Santos, R (1997) DNA extraction and

RAPD markers to assess the genetic similarity among

Gelidium sesquipedale population J Phycol 33:706-710

2 Bazzicalupo, M and Renato, F (1996) The Use of RAPD for generating specific DNA probes for

microorganisms In: Species Diagnostics Protocols Ed Clapp, J.P Humana Press Inc New Jersey pp: 155-175

3 Drrelkl, L E., Kevin, D R and Srodney, L H (1993) Artifactual variation in RAPD banding patterns

Biotechniques, 14: 214-217,

4 Đặng Quang Hưng, Nguyễn Quang Huy, Phan Tuấn Nghĩa (2004) So sánh hoạt độ của một số enzyme bảo vệ tổn thương oxy hoá và phổ băng ADN của ốc Bradybaena similaris thu thập từ Mã Đà và Cát Tiên, Tỉnh Đồng Nai Tạp

chí Di truyền và ứng dụng: số 2: 32-38

5 Mien, T G van de Ven, Partrick G L., and Rex, M B., (1996) Isolation and purification of plant nucleic acids: Genomic and Chloroplast DNA In Species Diagnostics Protocols, 1, ed Clapp, J.P., Humana Press Inc New

Jersey pp

01-14

6 Quyền Đình Thi, Đào Thị Tuyết, Lê Thị Thu Giang, Nguyễn Thị Thảo, Phạm Anh Tuấn (2003) Sử dụng

microsatterlite, mtRFLP và RAPD để phân tích tính đa hình tôm sú Tạp chí Công nghệ Sinh học, 1: 287-298

7 Stacey, J and Isaac, P G (2000).Isolation and

purification of DNA from plants Nucleic Acid Protocols Handbook, Ed Rapley, R Humana Press Inc New Jersey

pp 13-16

8 Wyss, P (1996) The use of RAPD for isolate

identification of Arbuscular Mycorrhizal fungi In Species Diagnostics Protocols Ed Clapp, J.P., Humana Press Inc New Jersey pp: 199-208

SUMMARY

Investigation of DNA polymorphism of some plant

species collected from mada and catien regions (in

Dongnai province)

A modified protocol for isolation of DNA from some plants was reported Modifications consisted of i) the buffer

composition with high concentrations of EDTA (up to 50 mM) and NaCl up to 1.4M, addition of polyvinyl

pirrolidone (PVP), sodium dodecyl sulfate and ii) change in the way to collect the DNA from isolation mixture Four

plant species: Ancistocladus tectorius, Cinnamomum

cassia, Segeraea elliptica and Barringtonia acutangula

were collected from Mada and Catien regions for the study

to compare DNA banding patterns between each pair of the species by using RAPD-PCR techniques The obtained

results showed that all the four species collected from

Mada region showed some difference in DNA banding

patterns compared to those of the same species collected from Catien region, indicating possible effects of

environmental factors on the genome of the species

However, further investigation is needed to elucidate the relations between the change in their genome and

influencing environmental factors

Người thẩm định nội dung khoa học: PGS TS Trịnh Đình Đạt