BÁO CÁO KHOA HỌC: "NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN HIỆU QUẢ NUÔI CẤY BAO PHẤN NGÔ BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAI HỮU TÍNH" doc

NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN HIỆU QUẢ NUÔI CẤY BAO PHẤN NGÔ BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAI HỮU TÍNH Lê Huy Hàm Viện Di truyền nông nghiệp ĐẶT VẤN ĐỀ Một trong những khó khăn cơ bản hạn chế ứng dụng rộng

NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN HIỆU QUẢ NUÔI CẤY BAO PHẤN NGÔ BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAI HỮU TÍNH

Lê Huy Hàm

Viện Di truyền nông nghiệp

ĐẶT VẤN ĐỀ

Một trong những khó khăn cơ bản hạn chế ứng dụng rộng rãi nuôi cấy bao phấn trong chọn tạo giống ngô là tính phụ thuộc vào giống Mặc dù có những tiến bộ rất lớn trong thời gian qua nhưng nuôi cấy bao phấn chỉ được ứng dụng

có hiệu quả đối với một số giống Đối với các giống Việt nam quy trình này kém hiệu quả do các nguyên nhân sau:

- Giống không phản ứng hay phản ứng rất thấp với môi trường, số phôi tạo thành quá ít

- Khả năng tái sinh của phôi thành cây thấp Tái sinh qua

callus gây nhiều dị thường (Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh, Trần Duy Quý, Buter, 1999)

Các nghiên cứu về di truyền đã cho thấy rằng có ít nhất 9 locut trên các nhiễm sắc thể khác nhau liên qua đến phản ứng của ngô trong nuôi cấy bao phấn (Beckert, 1994)

Trong nghiên cứu này chúng tôi đã khắc phục hiện tượng phụ thuộc vào giống bằng cách lai hữu tính các giống ngô Việt nam có phản ứng thấp trong nuôi cấy bao phấn với các giống ngô có phản ứng cao nhằm chuyển các gen phụ trách

về phản ứng trong nuôi cấy bao phấn của các giống có phản ứng cao vào các giống ngô Việt nam

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Các giống ngô Việt Nam có mức độ phản ứng thấp khác nhau trong nuôi cấy bao phấn đã được sử dụng làm các

dòng mẹ để lai với các giống ngô có phản ứng cao trong nuôi cấy bao phấn Đó là các giống ngô ETH - M82, M24 Việc lai tạo được tiến hành theo phương pháp truyền thống

sử dụng cho ngô trên đồng ruộng

Vì phản ứng của các giống ngô trong nuôi cấy bao phấn là một đặc tính chịu ảnh hưởng của điều kiện khí hậu, đặc điểm thổ nhưỡng và điều kiện gieo trồng, cho nên để tiện

so sánh, các giống mẹ và con lai được gieo đồng thời, các chế độ chăm bón, thu hoạch và xử lý cờ đảm bảo hoàn toàn giống nhau Mỗi giống mẹ và con lai được gieo 20-30 hạt,

từ đó thu được từ 15 - 20 hoa đực Sau khi xử lý lạnh 7 ngày, từ mỗi hoa đực được tách ít nhất 120 bao phấn để nuôi cấy trong 4 đĩa petri với mật độ 30 bao phấn/đĩa Phản ứng trong nuôi cấy bao phấn của từng cá thể của mỗi cặp lai được ghi nhận và phản ứng của con lai được đánh giá trên cơ sở phản ứng trung bình của 15 - 20 cá thể Môi

trường và quy trình nuôi cấy được thực hiện như đã mô tả trong các công bố trước đây (Lê Huy Hàm và CS 1997; 1998; 1999)

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Kết quả nghiên cứu phản ứng của con lai được trình bày ở bảng 1, biểu đồ 1 Trên bảng: dòng trên là phản ứng của

cây mẹ, dòng dưới là phản ứng của con lai Trên biểu đồ: cột bên trái là phản ứng của giống Việt nam, cột liền kề bên phải là phản ứng của con lai Ta thấy, so với giống mẹ

(ngô Việt Nam) tất cả các con lai đều có phản ứng trong nuôi cấy bao phấn cao hơn hẳn Nếu phản ứng của tập đoàn ngô Việt Nam chỉ ở vào khoảng 0% - 12% (Le Huy Ham at all, 1998) thì phản ứng của con lai đạt từ 30% đến 67%

Bảng 1: Phản ứng nuôi cấy bao phấn của một số giống ngô

Việt Nam và con lai

Biểu đồ 1: Phản ứng trong nuôi cấy bao phấn của giống

ngô mẹ (Việt Nam) và con lai

So sánh phản ứng của con lai và giống mẹ của từng cặp lai

ta được kết quả như sau:

F1 của cặp LVN18 x M82 phản ứng cao hơn LVN18 từ 9 -

10 lần

F1 của cặp LVN4 x M82 phản ứng cao hơn LVN4 từ 7 - 8 lần

F1 của cặp LVN17 x M24 phản ứng cao hơn LVN17 nhiều lần

F1 của cặp LVN5 x M82 phản ứng cao hơn LVN5 nhiều lần

F1 của cặp LVN20 x M82 phản ứng cao hơn LVN20 từ 11 -

12 lần

Như vậy ta thấy rằng trong tất cả các cặp lai, các con lai đều có phản ứng cao hơn giống mẹ hàng chục lần Điều đó thể hiện ở cả hai chỉ số quan trọng là số phôi tạo thành và

số cây tái sinh Các giống bố M24, M82 là những giống có nguồn gốc ôn đới, thích nghi kém trong điều kiện Việt

Nam, các giống mẹ là các giống ngô Việt Nam có tiềm

năng sinh trưởng và năng suất cao Các con lai ở đây đều sinh trưởng rất khoẻ, tương đương hoặc hơn giống mẹ Với

tỷ lệ tạo phôi và tái sinh cao, các con lai này ngay từ giai đoạn này có thể dùng để sản xuất các dòng thuần để cung cấp cho chọn giống

Theo Beckert (1994) Tính phản ứng trong nuôi cấy bao phấn là một đặc tính đa gen, nó được kiểm soát bởi ít nhất

9 locut khác nhau, nằm trên các nhiễm sắc thể khác nhau Các nghiên cứu đã tiến hành ở các nước như Thuỵ Sỹ,

Pháp, Thái Lan đã chứng minh rằng, tính phản ứng trong nuôi cấy bao phấn là một đặc tính di truyền và bằng

phương pháp lai có thể chuyển được các locut phụ trách các giai đoạn khác nhau trong chuỗi dây chuyền phản ứng của tiểu bào tử trong nuôi cấy sang các dòng mong muốn

(Buter, 1993; Saisingtong at all, 1996; Jumpatong at all, 1996) Các kết quả chúng tôi thu được chứng tỏ rằng đây là phương pháp rất có hiệu quả để tạo ra các giống ngô có phản ứng cao trong nuôi cấy bao phấn để phục vụ cho sản xuất các dòng thuần

Nghiên cứu phản ứng cá thể của các giống ngô con lai

Để hiểu rõ bản chất tính phản ứng cao trong nuôi cấy bao phấn của các con lai thu được, chúng tôi đã tiến hành

nghiên cứu phản ứng của từng cá thể Ba con lai có phản ứng tương đối cao đã được chọn làm thí nghiệm là LVN18

x M82, LVN17 x M82, LVN4 x M82

Mỗi giống ngô trên được gieo 20 - 25 hạt và thu được từ 15

- 20 hoa đực Trong số các hoa đực thu được mỗi con lai được chọn 11 cá thể để nghiên cứu Từ mỗi hoa, chúng tôi

đã tách khoảng 240 bao phấn để kiểm tra phản ứng trong nuôi cấy bao phấn Bao phấn của từng cá thể được theo dõi

tuyệt đối riêng rẽ để đánh giá mức độ phản ứng riêng của mỗi cá thể Môi trường nuôi sử dụng là môi trường IM lỏng không có giá thể (xem Le Huy Ham at all 1998) Bao phấn được giữ trong môi trường trong suốt thời gian nuôi, chỉ những phôi tạo thành được chuyển sang môi trường tái sinh sau khi chúng đạt kích thước 2 - 3mm Mức độ phản ứng được đánh giá bằng tỷ lệ giữa số phôi tạo thành và số bao phấn theo dõi, biểu diễn bằng %

Kết quả thu được trình bày ở bảng 2, biểu đồ 2

Ta thấy mức độ phản ứng của các cá thể trong cùng một giống là rất khác nhau

Bảng 2: Phản ứng cá thể của các con lai

Trong tổng số 11 cá thể được nghiên cứu ở giống LVN18 x

M82, 9 cá thể (81,8%) có tạo phôi trong môi trường nuôi

cấy phản ứng Số cá thể phản ứng cao hơn 100% là 4,

chiếm 36,7% Số cá thể không phản ứng là 2 cá thể chiếm

18,2% Mức độ phản ứng trung bình của cả giống là 71,2%

Đây là một mức độ phản ứng cao trong nuôi cấy bao phấn

Như vậy, ta thấy tuy giống có phản ứng cao nhưng mức độ

phản ứng của các cá thể khác nhau là rất khác nhau Biên

độ dao động của đặc tính này ở cặp lai LVN18 x M82 là rất lớn từ 0 - 158%, trong đó có 2 cá thể hoàn toàn không có phản ứng trong cùng một điều kiện nuôi cấy (xem bảng 2, Biểu đồ 2) Sự khác nhau rất lớn trong phản ứng của các cá thể cùng một giống được biểu diễn rất rõ trên đồ thị 3 ( ví

dụ của giống LVN18xM82)

Ở giống LVN4 x M82 cũng quan sát thấy hiện tượng tương

tự Mức độ phản ứng ở các cá thể rất khác nhau Cá thể số

5 và cá thể số 8 có phản ứng đến 122%, trong khi đó cá thể

số 2 lại không phản ứng Thí nghiệm tiến hành với 11 cá thể thì 10 cá thể (10 cờ) có phản ứng, chiếm 90,9% 1 cá thể không phản ứng chiếm 9,1% Tỷ lệ phản ứng lớn hơn 100% quan sát thấy ở 4 cá thể chiếm 36,4% 4 cá thể phản ứng thấp (dưới 15%) chiếm 36,4% Cá thể số 4 và số 10 phản ứng trung bình với tỷ lệ hơn 20 % Mức độ phản ứng trung bình của cả giống là 52,3%

Biểu đồ 2: Phản ứng cá thể của các con lai

Ở giống LVN 17 x M24 mức độ phản ứng của cá thể số 3

là cao nhất - 111,4% và thấp nhất là cá thể số 11 với mức

độ phản ứng là 9% 100% các cá thể được nghiên cứu có phản ứng Trong đó 3 cá thể (27,27%) có mức độ phản ứng dưới 15%, 7 cá thể (63,64%) có mức độ phản ứng từ 20 - 50% Mức phản ứng chung của toàn giống là 35%

Như vậy phản ứng của một giống trong nuôi cấy bao phấn

là kết quả trung bình giữa các yếu tố:

- Mức độ phản ứng của các cá thể riêng rẽ

- Tỷ lệ giữa số cá thể phản ứng và số cá thể không phản ứng

Số cá thể phản ứng càng cao thì phản ứng của giống càng cao, phản ứng của các cá thể càng cao thì phản ứng của giống cũng càng cao Điều này có giá trị quan trọng khi đánh giá phản ứng của giống trong nuôi cấy bao phấn Do

số cá thể và mức độ phản ứng của các cá thể khác nhau, phản ứng của giống cần được đánh giá trên cơ sở đánh giá

số lượng tương đối lớn cá thể Số lượng bao phấn của mỗi

cá thể cũng phải đủ lớn mới đảm bảo đánh giá đúng tiềm năng của giống Điều này đặc biệt quan trọng đối với các giống có phản ứng thấp, mà phần lớn các giống sản xuất đều thuộc vào loại này

Kết quả thí nghiệm này một lần nữa chứng minh rằng tính

di truyền của đặc tính phản ứng trong nuôi cấy bao phấn ở

ngô hoàn toàn được khẳng định Điều đó có nghĩa rằng lai hữu tính trong trường hợp này là một trong những biện pháp quan trọng để nâng cao hiệu quả của nuôi cấy bao phấn trong việc tạo các dòng thuần cho chọn giống Như vậy, bên cạnh việc cải tiến hiệu quả nuôi cấy bao phấn ngô bằng các phương pháp cải tiến môi trường, cải tiến quy trình nuôi cấy, một tiềm năng rất quan trọng để nâng cao hiệu quả của phương pháp này là cải tiến bằng phương pháp lai hữu tính Phương pháp này nhanh chóng, rẻ tiền, không tốn thời gian và công lao động có thể mang lại hiệu quả ngay Phương pháp này đặc biệt hữu hiệu đối với các

cơ sở tạo giống ngô không chuyên về nuôi cấy mô

KẾT LUẬN

Trên cơ sở các kết quả trình bày trên đây, chúng ta có thể rút ra các kết luận sau:

- Lai hữu tính các giống ngô Việt nam với các giống ngô

có phản ứng cao trong nuôi cấy bao phấn có thể làm tăng đáng kể phản ứng của các giống ngô Việt nam Có thể sử

dụng các con lai F1 để sản xuất dòng thuần thông qua nuôi cấy bao phấn

- Mức phản ứng của các con lai rất khác nhau Một số cá thể phản ứng tương đương mức phản ứng của dòng bố, một

số khác phản ứng tương đương mức phản ứng của dòng

mẹ, và các dòng khác có mức phản ứng nằm giữa bố và mẹ

- Bên cạnh biện pháp tăng cường hiệu quả nuôi cấy bao phấn bằng cải tiến quy trình, cải tiến môi trường, lai hữu tính là một biện pháp rất hữu hiệu, có thể giúp cải thiện một cách cơ bản hiệu quả của quy trình nuôi cấy bao phấn ngô

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh, Trần Duy Quý (1999) Một số nghiên cứu tạo dòng đồng hợp tử bằng nuôi cấy bao phấn ngô Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, Hà nội,

tr 902 – 907

2 Le Huy Ham, Do Nang Vinh, Tran Duy Quy, Bueter

B (1998) Study on anther culturability of Vietnamese

maize germplasm Proceeding of National Center for

Science and Technology of Vietnam, V.10, N2, p 74-78

3 Murigneux A, Bentollia S, Hardy T, Baud S, Guitton

C, Jullien H, Ben TS, Freyssinet G, Beckert M (1994) Genotypic variation of quantifative trait loci controlling in-vitro androgenesis in maize Genome 37: 970-976

4 Buter, B (1997) Einflussfaktoren der in vitro

Haploidproduction bei Zea mays Ph.D Thesis No 9725, Swiss Federal Institute of Technology (ETH), Zurich,

Switzerland

5 Beckert, M (1994) Advantages and disadvantages of the use of in vitro/in situ produced DH maize plants In: Bajai, Y.S.P (ed.) Biotechnology in Agritulture and

forestry Springer-Verlag Berlin Heidelberg 25:201-213

SUMMARY

Hybridization approach for improvement of anther culture efficiency in Maize

Genotype dependency in maize limits the application of the method for breeding Some maize genotypes have good response in anther culture giving enough number of

embryos and regenerated plants But most genotype show poor or no response in anther culture Genetics studies

revealed that at least 9 locus located in different

chromosomes have relation to response of genotype in

anther culture In this study, attempts were made to

overcome genotype dependency in maize by crossing high responsive lines with local Vietnamese genotypes to deliver genes responsible for response in anther culture to local genotypes

Two high responsive in anther culture maize lines M82 and M24 of temperate background were crossed with large

number of local genotypes Five crossings were selected for studies Results showed that hybrids of all five crossings have response in anther culture much higher then local

parents This concerned both embryo production and plant regeneration In general response of hybrids in 7-12 time more then local parents Hybrids inherited good

characteristics of both parents: high response in anther

culture from M82 and M24 lines and good adaptation to tropical climate conditions in Vietnam of local parents

Further, response of individual hybrids was investigated It was revealed that although response of the hybrid lines was improved very much, response of individuals within the lines is very different from plant to plant varying from 0 to 158% Thus response of a genotype must be accessed as average response of all it’s individuals

Thus, anther culture efficiency of economically important genotypes can be improved by sexual crossing with high responsive genotypes F1 hybrids of these lines can be used for production of inbred lines through anther culture

Người thẩm định nội dung khoa học: TS Đỗ Năng Vịnh