Báo cáo khoa học : Nghiên cứu quy trình công nghệ nuôi cấy tế bào sừng tự thân (Keratinocyte) trên màng nền Collagen, để điều trị bỏng sâu và vết thương mất da

- Đánh giá hiệu quả điều trị bỏng sâu và các vết thương mất da bằng tấm TB sừng nuôi cấy đã được tạo ra. - Đánh giá hiệu quả lâm sàng. Xây dựng quy trình công nghệ nuôi cấy tế bào sừng tự thân trên màng nền Collagen; - Đánh giá hiệu quả lâm sàng của màng tế bào sừng da tự thân nuôi cấy trên vết thương bỏng sâu và vết thương mất da. 6. Các sản phẩm chính: - Quy trình công nghệ nuôi cấy tế bào sừng da tự thân trên màng nền Collagen tiêu chuẩn ASEAN; - Màng tế bào sừng tự thân nuôi cấy ( 100 đơn vị, mỗi đơn vị 75 cm2 ); - Bản báo cáo về kết quả lâm sàng của màng tế bào sừng tự thân nuôi cấy trên vết bỏng sâu và vết thương mất da.

CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC10/06-10

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu quy trình công nghệ nuôi cấy tế bào sừng tự thân trên màng nền collagen để điều trị bỏng

sâu và vết thương mất da

MÃ SỐ ĐỀ TÀI: KC10.11/06-10

Chủ nhiệm đề tài Cơ quan chủ trì đề tài

PGS.TS Nguyễn Văn Huệ PGS.TS Nguyễn Gia Tiến

Ban chủ nhiệm chương trình Bộ Khoa học và Công nghệ

HÀ NỘI – 4/2010

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban giám đốc, Phòng sau đại học,

Hệ sau đại học – Học viện Quân y Ban giám đốc, Bộ môn Bỏng - Viện bỏng Quốc gia đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho phép tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

GS TS Lê Năm, Giám đốc Viện bỏng Quốc gia

PGS TS Nguyễn Văn Huệ, CN Bộ môn, PGĐ Viện bỏng Quốc gia PGS TS Nguyễn Gia Tiến, PCN Bộ môn, , PGĐ Viện bỏng Quốc gia

TS Đinh Văn Hân, Chủ nhiệm khoa Labô Viện bỏng Quốc gia

Tôi đặc biệt cảm ơn tới sự hướng dẫn và giúp đỡ tận tình của TS Nguyễn Viết Lượng, Trưởng phòng kế hoạch tổng hợp VBQG đã hướng dẫn giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn

Tôi vô cùng biết ơn các thầy cô giáo, các bạn đồng nghiệp, bệnh nhânđã hợp tác chặt chẽ, chỉ bảo tận tình tôi trong quá trình học tập

Tôi xin gửi lờ cảm ơn tới các bác sĩ, điều dươngx, nhân viên:

Khoa hồi sức bỏng - Viện bỏng Quốc gia

Khoa bỏng người lớn - Viện bỏng Quốc gia

Khoa bỏng trẻ em - Viện bỏng Quốc gia

Khoa Labô - Viện bỏng Quốc gia

Khoa gây mê phẫu thuật - Viện bỏng Quốc gia

Khoa giải phẫu bệnh – Viện 103

Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã cổ vũ động viên, giúp đỡ tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập, hoàn thành luận văn

Tống Thanh Hải

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BN bệnh nhân

CEA tấm tế bào sừng tự thân nuôi cấy :

Cultured Epidermal Autograft CEAl tấm tế bào sừng đồng loại nuôi cấy :

Cultured Epidermal Allograft

CS cộng sự

DTCT diện tích cơ thể

P aeruginosa Pseudômnas aeruginosa

S aureus Staphylococcus aureus

TBS tế bào sừng

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1:TỔNG QUAN TÀI LIỆU 7

1.1 Cấu trúc cơ bản của lớp biểu bì da 7

1.1.1 Cấu trúc cơ bản của da 7

1.1.2 Cấu trúc cơ bản của lớp biểu bì (Epidermis) 8

1.1.2.1 Lớp tế bào mầm (Stratum germinatum) 9

1.1.2.2 Lớp tế bào gai (stratum spinosum) 11

1.1.2.3 Lớp tế bào hạt (stratum granulosum) 12

1.1.2.4 Lớp tế bào trong suốt (stratum lucidum) 12

1.1.2.5 Lớp tế bào sừng (stratum corneum) 13

1.1.3 Đặc điểm chung của tế bào sừng và quá trình biệt hoá của tế bào gốc (mầm) biểu bì 14

1.2 Quá trình liền vết thương (wound healing) 15

1.2.1 Giai đoạn viêm (inflammatory phase) 15

1.2.2 Giai đoạn tăng sinh (proliferative phase) 16

1.2.2.1 Tăng sinh Nguyên bào sợi: 16

1.2.2.2 Hình thành mô liên kết 17

1.2.2.3 Tân tạo mạch 17

1.2.2.4 Tăng sinh biểu mô 18

1.2.2.5 Co kéo vết thương 19

1.2.3 Giai đoạn trưởng thành (maturation phase) 19

1.2.4 Vai trò của cytokines và yếu tố tăng trưởng trong liền vết thương 19

1.3 Các vật liệu thay thế da được sử dụng trong điều trị bỏng sâu và vết thương mất da 22

1.4 Quá trình nghiên cứu phát triển công nghệ nuôi cấy tế bào sừng 26

1.4.1 Công nghệ nuôi cấy tế bào và tạo tấm tế bào sừng trên thế giới 26

1.4.2 Công nghệ nuôi cấy tế bào và tạo tấm tế bào sừng tại Việt Nam 29

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.1 Đối tượng nghiên cứu 32

2.2 Các hóa chất, vật tư tiêu hao nuôi cấy tế bào sừng 32

2.2.1 Các hóa chất chính 32

2.2.2 Các vật tư tiêu hao chủ yếu 33

2.2 Phương pháp nghiên cứu 34

2.2.1 Quy trình lấy mẫu da 34

2.2.2 Quy trình tách lọc tế bào sừng 35

2.2.3 Quy trình nuôi cấy tạo tấm tế bào sừng 37

2.2.3.1 Các bước tiến hành trong ngày thứ nhất 37

2.2.3.2 Các bước tiến hành trong ngày thứ hai: 37

2.2.3.3 Các bước tiến hành trong ngày thứ ba và tiếp theo 38

2.2.3.4 Quy trình cấy chuyển nhân rộng số lượng tế bào sừng 38

2.2.3.5 Quá trình tạo tấm tế bào sừng: 39

2.2.4 Quy trình chuẩn bị nền ghép 40

2.2.4.1 Phương pháp chuẩn đoán tổn thương: 40

2.2.4.1 Quá trình chuẩn bị nền ghép: 40

2.2.5 Quá trình ghép tấm TBS tự thân nuôi cấy: 41

2.3 Thiết kế nghiên cứu 42

2.4 Cách thu thập số liệu 42

2.5 Xử lý số liệu: 42

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 43

3.1 Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu 43

3.2 Kết quả nghiên cứu nuôi cấy tế bào sừng trong môi trường không huyết thanh trên labô 45

3.3 Kết quả ghép thử nghiệm lâm sàng 54

3.4 Những ca bệnh nhân điển hình ghép thành công 61

Chương 4: BÀN LUẬN 64

4.1 Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu 64

4.1.1 Tuổi, giới: 64

4.1.2 Đặc điểm vùng lấy da nghiên cứu 65

4.2 Đặc điểm quá trình nuôi cấy sơ cấp 66

4.2.1 Kết quả tách lọc tế bào sừng từ mẫu da nghiên cứu 66

4.2.2 Kết quả quá trình nuôi cấy sơ cấp 70

4.3 Quá trình nuôi cấy thứ cấp 71

4.3.1 Tỷ lệ cấy chuyển tế bào nhân rộng về số lượng 71

4.3.2 Kết quả tạo tấm tế bào sừng 71

4.4 Kết quả ghép thử nghiệm trên lâm sàng 74

4.5 Thực tế ghép lâm sàng từng ca bệnh nhân 76

4.6 Lựa chọn tấm tế bào sừng nuôi cấy tự thân làm vật liệu thay thế da che phủ vĩnh viễn cho vết thương bỏng và vết thương mất da 78

KẾT LUẬN 80

KIẾN NGHỊ 81

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1: Cấu trúc giải phẫu mô học da 4

Hình 2: Vai trò của các tế báo trong liền vết thương 17

Hình 3: Tách lọc tế bào sừng 44

Hình 4: Tế bào sừng ngày thứ hai 45

Hình 5: Các đám tế bào sừng 45

Hình 6: Các đám tế bào sừng phát triển ngày thứ 8 45

Hình 7: Các đám tế bào sừng ngày thứ 10 46

Hình 8: Các đám tế bào sừng ngày thứ 2 46

Hình 9: Các tế bào sừng biệt hoá 46

Hình 10: Diễn biến quá trình ghép tấm tế bào sừng trên nền tổ chức hạt vết bỏng sâu 57

Hình 11: Diễn biến quá trình ghép tấm tế bào sừng trên nền tổ chức hạt vết thương mất da 58

Hà Nội, ngày tháng năm 2010

BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

I THÔNG TIN CHUNG

1 TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu quy trình công nghệ nuôi cấy tế bào sừng tự

thân trên màng nền collagen để điều trị bỏng sâu và vết thương mất da

Họ và tên: Nguyễn Văn Huệ

Ngày, tháng, năm sinh: Nam/ Nữ: Nam

Học hàm, học vị: Phó giáo sư; Tiến sỹ

Chức danh khoa học: Nghiên cứu viên cao cấp Chức vụ: Phó Giám đốc Điện thoại: Tổ chức: 04.36889344 Nhà riêng: 043

Mobile: 0913297440 Fax: 04.36883180 E-mail:

Tên tổ chức đang công tác: Viện Bỏng Lê Hữu Trác

Địa chỉ tổ chức: Tân Triều, Thanh trì, Hà Nội

Địa chỉ nhà riêng: Tập thể Học Viện Quân Y, khu A đường Lê Hữu Trác,

Hà Đông, Hà Nội

Điện thoại: 043.6889344 Fax: 043.6883180

E-mail: luonghll@gmail.com

Website:

Địa chỉ: Tân Triều, Thanh Trì, Hà Nội

Họ và tên thủ trưởng tổ chức: GS.TS Lê Năm

Số tài khoản:

Ngân hàng:

Tên cơ quan chủ quản đề tài: Bộ Y tế

II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN

1 Thời gian thực hiện đề tài/dự án:

- Theo Hợp đồng đã ký kết: từ tháng 04 năm 2007 đến tháng 04 năm 2010

- Thực tế thực hiện: từ tháng 04 năm 2007 đến tháng 04 năm 2010

- Được gia hạn (nếu có):

+ Kinh phí từ các nguồn khác: Không tr.đ

+ Tỷ lệ và kinh phí thu hồi đối với dự án (nếu có): Không

Thời gian (Tháng, năm)

Kinh phí (Tr.đ)

Ghi chú

(Số đề nghị quyết toán)

1

2

3

- Lý do thay đổi (nếu có):

3 Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện đề tài/dự án:

(Liệt kê các quyết định, văn bản của cơ quan quản lý từ công đoạn xác định nhiệm vụ, xét chọn, phê

duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực hiện nếu có); văn bản của

tổ chức chủ trì đề tài, dự án (đơn, kiến nghị điều chỉnh nếu có)

Quyết định của Bộ Trưởng Bộ KHCN

về việc thành lập Hội đồng khoa học công nghệ cấp Nhà Nước tư vấn tuyển chọn, xét chọn tổ chức cá nhân chủ trì thực hiện Đề Tài cấp Nhà Nước thực hiện kế hoạch năm 2006 thuộc lĩnh vực Y Dược và sức khoẻ cộng đồng

2

Quyết định số

775/QĐ-BKHCN

ngày 19/4/2006

Quyết định của Bộ Trưởng Bộ KHCN

về việc phê duyệt các tổ chức và cá nhân trúng tuyển chủ trì thực hiện đề tài dự án SXTN năm 2006 thuộc lĩnh vực Y Dược và sức khoẻ cộng đồng

3

Quyết định số

2096/QĐ-BKHCN ngày

Quyết định của Bộ Trưởng Bộ KHCN

về việc phê duyệt Chủ nhiệm, cơ quan chủ trì và kinh phí các đề tài dự án

đoạn 2006-2010 cho đề tài KC.10.11/06-10

Quyết định của Bộ Trưởng Bộ KHCN

về việc điều chỉnh thời gian thực hiện

đề tài/dự án SXTN năm 2006 thuộc Chương trình KHCN trọng điểm cấp Nhà Nước giai đoạn 2006-2010 cho đề tài KC.10.11/06-10

từ Ts Trần Công Toại (Đại Học Y khoa Phạm Ngọc Thạch) sang Bộ môn

mô phôi Đại Học Y khoa Hà Nội

Trước đó Chủ nhiệm

đề tài KC10.11/06-10

đã 2 lần gửi văn bản cho TS Toại và TS Toại đã trả lời miệng

là không tiếp tục thực hiện được hợp đồng

Đề tài cũng đã báo cáo nhiều lần với Ban chủ nhiệm các chương trình và BCN chương trình KC10/06-10

4 Tổ chức phối hợp thực hiện đề tài, dự án:

Nội dung tham gia chủ yếu

Sản phẩm chủ yếu đạt được Ghi chú*

1 Bộ môn mô

phôi HVQY

Bộ môn mô phôi HVQY

Làm xét nghiệm mô học

Hình ảnh mô học vùng tổn thương sau ghép tấm TBS

Hà Nội

Cung cấp màng collagen làm

từ màng ối

đã được nghiên cứu

Màng collagen làm từ màng ối

để làm giá đỡ tế bào sừng nuôi cấy

nghiên cứu

- Lý do thay đổi (nếu có): Thay đổi từ trung tâm đào tạo cán bộ y tế, sở y tế TP

Hồ Chí Minh sang Bộ môn Mô phôi đại Học Y Hà Nội Lý do thay đổi: do lúc xét duyệt đề cương, Hội đồng khoa học xét duyệt có đề xuất với Viện Bỏng kết hợp với trung tâm đào tạo cán bộ y tế, sở y tế TP Hồ Chí Minh trong việc nghiên cứu sản xuất màng collagen từ ối làm giá đỡ tế bào Tuy nhiên Trung tâm ĐT cán bộ y tế TP HCM chỉ có thể cung cấp được màng ối đông khô mà không cung cấp được dạng tươi, mặc dù thời hạn hợp đồng đã hết nhưng vì không thực hiện được nên Chủ nhiệm đề tài đã báo cáo và xin đổi sang mua sản phẩm màng collagen từ màng ối do Bộ môn Mô phôi, đại học Y Hà Nội nghiên cứu và sản xuất

5 Cá nhân tham gia thực hiện đề tài, dự án:

(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không quá 10 người kể cả chủ nhiệm)

Nội dung tham gia chính

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

Đang CN một đề tài cấp NN khác

Nguyễn Văn Huệ

PGS.TS Nguyễn Văn Huệ

Chủ nhiệm Đề tài

3 TS Nguyễn Viết Lượng TS Nguyễn Viết Lượng

Thư ký khoa học, Chủ nhiệm đề tài nhánh

4 TS Đinh Văn Hân TS Đinh Văn Hân

Nghiên cứu viên, chủ nhiệm ĐT nhánh

5 PGS.TS Nguyễn Gia Tiến

Đang CN một đề tài cấp NN khác

6 PGS.TS Nguyễn

Ngọc Tuấn

PGS.TS

Nguyễn Ngọc Tuấn

Nghiên cứu viên, chủ nhiệm ĐT

7 TS Nguyễn Như Lâm Như Lâm nhiệm ĐT viên, chủ

Nghiên cứu viên, chủ nhiệm ĐT nhánh

11

TS Chu Anh Tuấn TS Chu Anh

Tuấn

Nghiên cứu viên, chủ nhiệm ĐT nhánh

12 CN Nguyễn Phong Thấu Phong Thấu CN Nguyễn Nghiên cứu viên,

13 Ths Thanh Hải Tống Nghiên cứu viên Học sinh cao học

- Lý do thay đổi ( nếu có):

6 Tình hình hợp tác quốc tế:

Số

TT

Theo kế hoạch

(Nội dung, thời gian, kinh

phí, địa điểm, tên tổ chức

người tham gia )

Ghi chú*

1

Năm 2007: Tổ chức đoàn

vào: mời các chuyên gia về

nuôi cấy tế bào của

Singapore sang để hỗ trợ kỹ

thuật Dự kiến có 2 chuyên

gia vào trong 10 ngày, kinh

phí dự kiến là 35 triệu đồng

Năm 2007: Đã mời đoàn chuyên gia Singapore vào hỗ trợ kỹ thuật đoàn có 1 chuyên gia vào trong vòng 10 ngày

Nội dung hỗ trợ kỹ thuật là quy trình nuôi cấy tế bào sừng trên labô bằng phương pháp không huyết thanh

2

Năm 2008: Tổ chức đoàn

vào: mời 01 chuyên gia về

nuôi cấy tế bào của

Singapore sang để hỗ trợ kỹ

thuật Dự kiến vào trong 14

ngày, kinh phí dự kiến là 25

triệu đồng

Năm 2008: Đã mời đoàn chuyên gia Singapore vào hỗ trợ kỹ thuật đoàn có 1 chuyên gia vào trong vòng 14 ngày

Nội dung hỗ trợ kỹ thuật là lựa chọn màng nền collagen làm giá đỡ tế bào và nuôi cấy

- Lý do thay đổi (nếu có):

7 Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị:

(Nội dung, thời gian, kinh

phí, địa điểm ) Ghi chú*

1

Hội thảo về quy trình kỹ

thuật nuôi cấy tế bào sừng:

dự kiến tổ chức vào 2007,

địa điểm tại Viện Bỏng Quốc

Gia Kinh phí dự kiến 6 triệu

đồng

Đã tổ chức hội thảo về quy trình kỹ thuật nuôi cấy tế bào sừng, tại VBQG tháng 12/2007 Số lượng đại biểu tham dự 36 ngưòi Kinh phí chi 6 triệu đồng

2

Hội thảo về tấm vật liệu

collagen sử dụng làm giá đỡ

tế bào sừng: dự kiến tổ chức

vào 2008, địa điểm tại Viện

Bỏng Quốc Gia Kinh phí dự

kiến 6 triệu đồng

Đã tổ chức hội thảo về tấm vật liệu collagen sử dụng làm giá đỡ tế bào sừng, tại VBQG tháng 4/2008 Số lượng đại biểu tham dự 38 ngưòi Kinh phí chi 6 triệu đồng

3

Hội thảo về ứng dụng ghép

tấm tế bào sừng tự thân nuôi

cấy trên lâm sàng: dự kiến tổ

chức vào 2009, địa điểm tại

Viện Bỏng Quốc Gia Kinh

phí dự kiến 8 triệu đồng

Đã tổ chức hội thảo về ứng dụng ghép tấm tế bào sừng

tự thân nuôi cấy trên lâm sàng, tại VBQG tháng 07/2009 Số lượng đại biểu tham dự 42 ngưòi Kinh phí chi 8 triệu đồng

- Lý do thay đổi (nếu có):

8 Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:

(Nêu tại mục 15 của thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát trong nước và nước ngoài)

Người,

cơ quan thực hiện

1 Nghiên cứu quy trình kỹ

thuật tạo tấm vật liệu làm giá

2

Nghiên cứu quy trình công

nghệ nuôi cấy tế bào sừng tự

Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở

của tấm TBS nuôi cấy được

tạo ra

10/09 10/08-10/09 VBQG

cơ quan nghiên cứu do đó thời gian thực hiện cũng bị chậm lại

III SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI, DỰ ÁN

1 Sản phẩm KH&CN đã tạo ra:

Thực tế đạt được

1 Tấm tế bào sừng tự tấm 100 tấm 100 tấm 400 tấm

thương mất da

- Lý do thay đổi: Theo đăng ký kích thước tấm tế bào sừng là 75 cm2 nhưng thực tế nghiên cứu: Do thực tế tại thời gian nghiên cứu màng collagen từ màng Biobrane hay từ màng ối để làm giá đỡ đều có kích thước là 25 cm2 mà không

có loại kích thước 75 cm2, hơn nữa nuôi cấy tạo tấm tế bào sừng kích thước 25

cm2 thuận lợi hơn trong việc tạo tấm tế bào sừng, đặc biệt trong việc chuyển ghép tấm tế bào sừng lên nền vết thương, vết bỏng Vì vậy nhóm nghiên cứu đã thay đổi kích thước tấm tế bào sang loại 25 cm2 Như vậy so với đăng ký thì diện tích tấm tế bào sừng thực tế tạo ra vẫn vượt (đăng ký là 100 x 75 cm2 = 7.500 cm2 ; thực tế đạt được 400 x 25 cm2 = 10.000 cm2)

Ghi chú

1 Quy trình công nghệ tạo tấm tế bào sừng tự thân

nuôi cấy

01 quy trình đạt tiêu chuẩn

cơ sở

01 quy trình đạt tiêu chuẩn

cơ sở

01 quy trình đạt tiêu chuẩn

cơ sở

01 bảng tiêu chuẩn cơ sở đạt tiêu chuẩn

(Tạp chí, nhà

xuất bản)

1

giá kết quả nghiên cứu báo cáo toàn

văn báo cáo toàn văn

2 Bài báo khoa học

02 bài báo trong nước

01 bài báo quốc tế

02 bài báo trong nước

Tạp chí y học thực hành,

Bộ Y tế và

Kỷ yếu hội thảo khoa học về ứng dụng tế bào

và tế bào gốc trong y học

do Bộ Y tế và

Bộ KHCN tổ chức, Nhà xuất bản Y học

- Lý do thay đổi (nếu có): Do phải kết thúc số liệu mới đủ điều kiện để viết bài

báo quốc tế do đó bài báo quốc tế đã không kịp đăng trước khi nghiệm thu đề tài

d) Kết quả đào tạo:

Số lượng

Số

TT

Cấp đào tạo, Chuyên

hoạch Thực tế đạt được

Ghi chú

(Thời gian kết thúc)

1 Thạc sỹ 0

01 thạc sỹ đã bảo vệ thành công luận văn

9/2009

- Lý do thay đổi: Do trong thời gian triển khai nghiên cứu không có NCS nào

đăng ký đề tài Do đó nhóm nghiên cứu đã phải chuyển sang đào tạo 01 thạc sỹ

chuyên ngành bỏng Học viên đã bảo vệ thành công luận văn vào tháng 9/2009

đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp, quyền đối với giống

cây trồng:

- Lý do thay đổi (nếu có):

e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN đã được ứng dụng vào thực tế

Kết quả

sơ bộ

1 Quy trình công nghệ tạo tấm tế bào sừng tự

thân nuôi cấy

Từ tháng 12 năm 2007 đến nay

Labô nghiên cứu ứng dụng

và điều trị bỏng - VBQG

Đã thành thạo

và làm chủ quy trình tạo tấm tế bào sừng

Các khoa lâm sàng của Viện Bỏng Quốc Gia

Đã tạo được

400 tấm TBS

tự thân loại 25

cm2 và ghép thử nghiệm cho 30 bệnh bỏng sâu và vết thương mất da

Các khoa lâm sàng của Viện Bỏng Quốc Gia

Đã thành thạo quy trình ghép

và chăm sóc sau ghép tấm TBS nuôi cấy

2 Đánh giá về hiệu quả do đề tài, dự án mang lại:

a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:

Nuôi cấy tế bào sừng là một trong những kỹ thuật phức tạp và khó khăn nhất trong các kỹ thuật nuôi cấy tế bào Nếu không tiến hành được kỹ thuật này thì việc cứu sống các bệnh nhân bỏng sâu diện tích từ 60% diện tích cơ thể trở lên sẽ rất khó khăn, ngoài ra nếu thực hiện thành công được kỹ thuật này thì đây

các nhà nghiên cứu, các kỹ thuật viên để ứng dụng cho nhiều công nghệ tiếp theo trong đó có công nghệ sản xuất da nhân tạo

Do đó hiệu quả lớn nhất của đề tài KC10.11/06-10 mang lại đó là đề tài

đã xây dựng và hoàn thiện được quy trình công nghệ nuôi cấy tế bào sừng, đã tạo thành công tấm tế bào sừng nuôi cấy trên màng nền collagen và đã bước đầu ghép thành công cho 31 bệnh nhân Đây là tiền đề thuận lợi cho việc phát triển các kỹ thuật này trong tương lai Phương pháp nuôi cấy tế bào sừng kinh điển là phương pháp không phù hợp và không thực hiện được ở Việt Nam, trong điều kiện đó đề tài đã đưa lại một giải pháp, một triển vọng về mặt khoa học đó là: nếu kết hợp nuôi cấy tế bào sừng tự thân trên màng nền collagen với các biện pháp điều trị khác như sử dụng các vật liệu thay thế da tạm thời (da đồng loại,

da dị loại, các vật liệu tổng hợp ) với da tự thân tỷ lệ giãn rộng lớn thì có thể cứu sống được các bệnh nhân bỏng sâu diện tích lớn từ 60% DTCT trở lên (hiện tại những bệnh nhân này hầu hết là tử vong do thiếu hụt nguồn da ghép tự thân) Quy trình nuôi cấy tế bào sừng và kết quả ghép tấm tế bào sừng mà đề tài đạt được cho thấy các nhà khoa học tại Viện Bỏng Quốc Gia đã hoàn toàn làm chủ được kỹ thuật này Theo các tham khảo thì tỷ lệ ghép thành công của đề tài tương đương với tỷ lệ thành công của nhiều tác giả và trung tâm khác trên thế giới

b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:

Nuôi cấy tế bào sừng là một kỹ thuật khó, phức tạp và khá tốn kém nhưng cho đến nay là giải pháp duy nhất để có thể cứu sống các bệnh nhân bỏng sâu diện tích trên 60% DTCT Do đó sự thành công của đề tài mang lại một giá trị và ý nghĩa về xã hội và nhân văn lớn Xét về ý nghĩa kinh tế, chúng

ta cũng thấy những sản phẩm tương tự được tạo ra bởi các trung tâm khác trên thế giới có giá thành rất cao Tuy nhiên, trên thực tế kể cả chấp nhận giá cao, do

đó đưa sản phẩm trở về ghép cho bệnh nhân cũng rất khó khăn, không khả thi

và chắc chắn giá thành sẽ còn cao hơn rất nhiều Trong khi đó, việc đưa các bệnh nhân bỏng nặng, có bỏng sâu trên 60% DTCT sang các nước có kỹ thuật nuôi cấy tế bào để điều trị cũng rất khó khăn, tốn kém và ít khả thi Vì vậy đề tài đã tạo ra được một lối thoát, một hướng đi khả thi hơn, đỡ tốn kém hơn và cũng hiệu quả hơn trong việc tiến tới cứu sống những bệnh nhân bỏng sâu diện tích lớn Ngoài ra lượng bệnh nhân có các vết thương mãn tính càng ngày càng nhiều do đó sản phẩm của đề tài mang lại cũng là một giải pháp có ý nghĩa đối với các bệnh nhân này nhằm nâng cao chất lượng cuộc sống cho họ

3 Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài, dự án:

Số

Thời gian thực hiện

Ghi chú

(Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ trì…)

MỞ ĐẦU

1 GIỚI THIỆU TÓM TẮT SỰ HÌNH THÀNH ĐỀ TÀI:

Viện Bỏng Quốc Gia Lê Hữu Trác là Viện tuyến cuối về chuyên ngành bỏng và liền vết thương của cả nước Trong nhiều năm qua Viện Bỏng đã có những bước tiến vượt bậc trong điều trị, nghiên cứu khoa học về chuyên ngành bỏng Một trong những thành tựu quan trọng của Viện Bỏng là các nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ trong lĩnh vực công nghệ sinh học phục vụ điều trị bỏng, trong đó có nuôi cấy tế bào Một số thành công điển hình của Viện trong lĩnh vực công nghệ sinh học là: Viện Bỏng đã thành công trong việc nuôi cấy nguyên bào sợi, tạo được tấm nguyên bào sợi điều trị bệnh nhân bỏng, bệnh nhân vết thương phầm mềm, các bệnh nhân có các vết loét, vết thương mãn tính Viện Bỏng cũng đã thành công trong nghiên cứu, sản xuất các vật liệu thay thế da tạm thời để điều trị vết thương bỏng (trung bì da lợn, da đồng loại từ tử thi, da ếch, các màng sinh học khác) Tuy nhiên, việc cứu sống các bệnh nhân bỏng sâu diện tích lớn vẫn là vấn đề còn gặp rất nhiều khó khăn đối với chuyên ngành bỏng Việt Nam, trong đó có Viện Bỏng Quốc Gia

Tại Viện Bỏng Quốc Gia, từ năm 2000 đến hết năm 2009 chỉ có 11 bệnh nhân (BN) bỏng sâu diện tích từ 50% diện tích cơ thể (DTCT) trở lên được cứu sống, trong đó bệnh nhân có diện tích bỏng sâu lớn nhất từ trước đến nay được cứu sống là 75% DTCT Một trong những khó khăn lớn nhất trong điều trị những BN bỏng sâu diện tích lớn trên 60% DTCT đó là việc thiếu nguồn da ghép tự thân, khi mà công nghệ nuôi cấy tế bào sừng tại Việt Nam nói chung và Viện Bỏng nói riêng chưa được triển khai, trên thực tế mới chỉ có những nghiên cứu bước đầu trên labô trước đây Trong khi đó nhiều trung tâm bỏng trên thế giới đã triển khai kỹ thuật này từ khá lâu và đã có những thành công đáng kể Một trong những nơi như vậy là Trung tâm bỏng

bệnh viện đa khoa Singapore Tại đây có PGS.TS.BS Phan Toàn Thắng là một chuyên gia về nuôi cấy tế bào, người sẵn sàng hỗ trợ kỹ thuật và kinh nghiệm để triển khai kỹ thuật này tại Việt Nam Xuất phát từ những vấn đề thực tiễn nói trên Viện Bỏng đã đề xuất nhiệm vụ đề tài khoa học cấp nhà nước về lĩnh vực này và đã được Bộ Y tế, Bộ Khoa học và Công nghệ chấp thuận là một trong những nhiệm vụ khoa học công nghệ trọng điểm cấp Nhà nước giai đoạn 2006 – 2010 Sau khi trúng thầu thực hiện đề tài, đề tài mang

mã số KC10.11/06-10 do PGS.TS Nguyễn Văn Huệ làm chủ nhiệm đã được triển khai tại Viện Bỏng Quốc Gia từ 4/2007

2 ĐẶT VẤN ĐỀ

Mặc dù điều trị bỏng và vết thương phần mềm đã có nhiều tiến bộ vượt bậc trong những thập niên gần đây, song trên thực tế các bác sỹ lâm sàng vẫn gặp không ít khó khăn, những khó khăn lớn nhất đó là việc thiếu hụt nguồn da ghép tự thân ở những bệnh nhân bỏng sâu diện tích lớn hay khả năng không liền, chậm liền vết thương ở những vết thương mãn tính [5,7,16,19,54] Để giải quyết những khó khăn nói trên đòi hỏi phải có những kỹ thuật hiện đại nhằm tăng khả năng che phủ của da tự thân hay nuôi cấy tế bào da Công nghệ nuôi cấy tế bào sừng (keratinocytes) điều trị vết thương, vết bỏng đã được các nhà khoa học, các bác sỹ lâm sàng áp dụng từ khá lâu trên thế giới

Những người tiên phong trong công nghệ nuôi cấy tế bào sừng là Rheiwald và Green Năm 1975 Rheiwald và Green đã chứng minh rằng các tế bào biểu mô có thể được tách lọc từ da và nuôi cấy trong ống nghiệm [54] Hiện nay trên thế giới đã có nhiều trung tâm tiến hành nuôi cấy thành công tế bào sừng để điều trị vết thương, vết bỏng mà công nghệ chủ yếu là công nghệ kinh điển của Rheiwald và Green [34, 54]

Ở Việt Nam, số lượng bệnh nhân bỏng, đặc biệt là bệnh nhân bỏng sâu diện rộng vẫn chiếm một tỷ lệ khá cao , bên cạnh đó các bệnh nhân vết thương mãn tính gặp ngày càng nhiều và rất khó khăn trong điều trị bằng các biện pháp thông thường [8, 10, 11, 13, 16] Những thực tế đó đòi hỏi phải có các công nghệ mới, kỹ thuật mới trong điều trị, trong đó công nghệ nuôi cấy

tế bào sừng để điều trị vết thương, vết bỏng là một nội dung cần phải quan tâm và hướng tới Trước đây, cũng đã có một số tác giả tiến hành nghiên cứu nuôi cấy tế bào sừng để điều trị vết bỏng, nhưng chủ yếu vẫn là nghiên cứu trên labô, với chỉ một vài bệnh nhân được thử nghiệm [4, 16] Hơn nữa, công nghệ nuôi cấy tế bào sừng điều trị vết thương vết bỏng của Rheiwald và Green sẽ rất khó để triển khai và áp dụng ở Việt Nam vì: công nghệ đó là công nghệ độc quyền, chúng ta phải mua loại tế bào 3T3 làm lớp nuôi, ngoài

ra Việt Nam không có trung tâm chiếu xạ phù hợp để triển khai kỹ thuật nuôi cấy đó Trong nhiều năm qua, nhiều trung tâm trên thế giới cũng đã bắt đầu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào sừng theo phương pháp mới không sử dụng huyết thanh, phương pháp này đã cho thấy những ưu điểm của nó so với phương pháp kinh điển [ ], [ ]

Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, từ 2006 Viện Bỏng Quốc Gia đã tiến hành kỹ thuật nuôi cấy tế bào sừng theo phương pháp mới đó là nghiên cứu nuôi cấy tế bào sừng trên màng nền collagen để điều trị vết thương, vết bỏng [1, 5, 6, 7] Kỹ thuật này giúp chúng ta có thể triển khai nuôi cấy tế bào sừng phù hợp với điều kiện của nước ta (không có tế bào 3T3, trung tâm chiếu xạ) [54], đồng thời có thể nâng cao khả năng thành công cũng như hạ

giá thành sản phẩm Do đó đề tài “ Nghiên cứu quy trình công nghệ nuôi cấy tế bào sừng tự thân trên màng nền collagen để điều trị bỏng sâu và vết thương mất da” được tiến hành là nhằm 2 mục tiêu sau đây:

1 Xây dựng quy trình công nghệ nuôi cấy tế bào sừng tự thân trên màng nền collagen để điều trị bỏng sâu và vết thương mất da

2 Đánh giá hiệu quả điều trị vết bỏng sâu và vết thương mất da của tấm tế bào sừng tự thân nuôi cấy

3 TÍNH CẤP THIẾT, Ý NGHĨA KHOA HỌC, Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

Tính cấp thiết:

Cho dù có những tiến bộ đáng kể trong điều trị bỏng hiện nay như: Tiến bộ trong hồi sức cấp cứu BN sốc bỏng, trong nuôi dưỡng sớm BN bỏng nặng, các tiến bộ trong phẫu thuật bỏng như cắt bỏ hoại tử sớm, rất sớm, những tiến bộ trong việc sản xuất và ứng dụng các vật liệu thay thế da tạm thời trên vết thương bỏng cũng như điều trị bỏng hô hấp hay lọc máu trong bỏng…mà những tiến bộ nói trên đã góp phần to lớn trong việc giảm tử vong, tăng khả năng cứu sống BN bỏng nặng Tuy nhiên, một trở ngại vẫn còn rất lớn trong việc cứu sống các bệnh nhân bỏng sâu diện tích lớn đó là thiếu hụt nguồn da ghép tự thân Đã có nhiều cố gắng trong việc sử dụng da đồng loại,

da dị loại hay các vật liệu thay thế da tạm thời nhằm che phủ tạm thời vết thương bỏng, chờ thời gian để sử dụng các biện pháp lấy da tự thân nhiều lần hay các biện pháp nhằm giãn rộng tối đa các phần da tự thân còn lại, nhưng kết quả điều trị các BN bỏng sâu diện tích lớn trên 70% DTCT vẫn hết sức khó khăn Do đó, kỹ thuật nuôi cấy tế bào sừng da tự thân để từ một phần da

ít ỏi còn lại có thể tạo ra được những diện tích đáng kể các tấm tế bào sừng nuôi cấy nhằm cứu sống các BN bỏng sâu diện tích lớn là một vấn đề không chỉ cấp thiết mà còn hết sức bức xúc và cấp bách, không chỉ thể hiện sự tiến

bộ của khoa học công nghệ mà còn thể hiện tính nhân văn cao cả đó là bằng mọi cách cứu sống tính mạng con người

Ý nghĩa khoa học của đề tài

Tế bào biểu mô nói chung, trong đó các tế bào sừng nói riêng của da có khả năng đặc biệt đó là tái sinh, tái tạo để thay thế các tế bào đã già hay đã chết Từ một số lượng tế bào biểu mô nhất định qua quá trình nuôi cấy nhân lên có thể tạo ra được những tấm tế bào biểu mô có kích thước rộng gấp nhiều lần phục vụ cho mục đích điều trị Với công nghệ nuôi cấy tế bào sừng hiện nay, từ một vài cm2 da ban đầu, qua nuôi cấy, nhân rộng người ta có thể tạo ra hàng m2 tấm tế bào nuôi cấy phục vụ cho việc cấy ghép điều trị bỏng sâu và vết thương mất da diện rộng

Nuôi cấy tế bào nói chung và nuôi cấy tế bào sừng nói riêng là một kỹ thuật đã được nhiều trung tâm, nhiều tác giả trên thế giới thực hiện từ nhiều năm nay và đã cho những kết quả tích cực Kỹ thuật nuôi cấy tế bào sừng phổ biến trước đây là kỹ thuật kinh điển của tác giả Rheiwald và Green H Đây là

kỹ thuật nuôi cấy tế bào sừng trong môi trường huyết thanh, cần phải có một loại tế bào đặc biệt là 3T3 làm lớp nuôi Kỹ thuật này là kỹ thuật độc quyền của Green H, hơn nữa cần có các trung tâm chiếu xạ để thực hiện các quy trình kỹ thuật, ngoài ra kỹ thuật này ngày càng cho thấy có nhiều nhược điểm

và giá thành thường cao Với những lý do đó một hướng mới trong nuôi cấy

tế bào sừng đã được nghiên cứu và triển khai trong nhiều năm nay đó là kỹ thuật nuôi cấy tế bào sừng trong môi trường không huyết thanh, người ta nuôi cấy tế bào sừng lên một “giá đỡ”, thay vì các tế bào sừng phát triển đủ nhiều lớp mới được cấy ghép lên vết thương thì với kỹ thuật này tế bào sừng chỉ cần phá triển một vài lớp là có thể ghép nhờ sự “hỗ trợ” của các “giá đỡ” Kỹ thuật nuôi cấy tế bào sừng trên màng nền collagen là kỹ thuật khắc phục được nhiều hạn chế của phương pháp kinh điển, đơn giản hơn trong việc cấy ghép

và giá thành thấp hơn Việc làm chủ kỹ thuật nuôi cấy tế bào sừng còn giúp chúng ta làm chủ các kỹ thuật nuôi cấy tế bào khác để phục vụ cho các mục

đích điều trị và nghiên cứu khác nhau, bởi vậy đây là một đề tài có ý nghĩa khoa học lớn

Ý nghĩa thực tiễn

Trong những năm qua, điều trị bỏng nặng đã có những tiến bộ vượt bậc: Tiến bộ trong hồi sức sốc bỏng; tiến bộ trong nuôi dưỡng sớm bệnh nhân bỏng nặng; tiến bộ trong phẫu thuật cắt bỏ hoại tử sớm, trong nghiên cứu, ứng dụng các vật liệu thay thế da tạm thời, trong việc sử dụng các kỹ thuật nhằm giãn rộng các mảnh da ghép tự thân…Tuy nhiên, thực tế cho thấy việc điều trị những bệnh nhân bỏng sâu diện tích lớn trên 60% DTCT vẫn gặp rất nhiều khó khăn, nguyên nhân chủ yếu vẫn là sự thiếu hụt nguồn da ghép tự thân

Do đó, ý nghĩa thực tiễn lớn nhất của đề tài này đó chính là vấn đề cứu sống tính mạng con người Nếu thành công và làm chủ được kỹ thuật nuôi cấy

tế bào sừng, sẽ là chìa khoá giúp chúng ta tăng khả năng cứu sống các bệnh nhân bỏng sâu và mất da diện rộng Ngoài bỏng, các vết thương phần mềm

do tai nạn giao thông, tai nạn lao động hay các vết thương, vết loét mãn tính cũng là những tổn thương chúng ta thường gặp, kỹ thuật nuôi cấy tế bào sừng

có thể giúp chúng ta điều trị các loại tổn thương đó mà không cần phải ghép

da, góp phần nâng cao chất lượng cuộc sống cho người bệnh Nếu không có

kỹ thuật nuôi cấy tế bào sừng ở Việt Nam, muốn cứu sống những bệnh nhân bỏng sâu diện rộng chúng ta sẽ phải gửi các mẫu da sang nước ngoài để nuôi cấy hoặc chuyển bệnh nhân sang các nước để điều trị, điều đó ít khả thi và tốn kém nhiều hơn, chưa nói còn những khó khăn về tính an toàn, thủ tục pháp lý…bởi vậy, một lần nữa cho thấy đề tài này có một ý nghĩa thực tiễn cao

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cấu trúc cơ bản của lớp biểu bì da

1.1.1 Cấu trúc cơ bản của da

Da có cấu trúc khá phức tạp bởi da có nhiều chức năng quan trọng với

cơ thể, nếu chia cấu trúc da theo mặt cắt thẳng từ ngoài vào trong, da gồm ba lớp cơ bản là: biểu bì (thượng bì) , trung bì và hạ bì hay còn gọi là chân bì Ngoài ra da còn có hệ thống mạch máu, thần kinh và các thành phần phụ của

da Có những chỗ da có những cấu trúc đặc biệt để đảm bảo các chức năng khác nhau như mắt, môi….và có thể không có lớp hạ bì dưới da Các lớp liên kết chặt chẽ với nhau thành một khối thống nhất bao phủ toàn bộ cơ thể mang tính chun giãn về các phía, tạo hình [15, 18, 43]

Những thành phần của da có nguồn gốc mô học từ ngoại bì: bao gồm các tế bào biểu mô thuộc lớp biểu bì, các tế bào biểu mô thuộc phần phụ của

da (tuyến mồ hôi, tuyến bã, nang lông…) đây là những tế bào chính trong những nghiên cứu và ứng dụng những công nghệ nuôi cấy tế bào biểu mô, từ

đó giúp ích rất nhiều cho việc tìm kiếm các vật liệu thay thế da vĩnh viễn để điều trị vết bỏng và vết thương mất da đảm bảo che phủ cơ thể nhưng vẫn giữ được các chức năng chính của cơ thể Những thành phần từ phôi trung bì gồm các tế bào mô liên kết ở trung bì và lớp dưới da….[3, 15, 18]

Diện tích của da tuỳ thuộc vào độ tuổi chiều cao và cân nặng và có thể tính chung theo công thức của Delafield du Bois và Engene F du Bosi (1916):

S (cm2) = P (cân nặng: kg)*0.425 * H (cao cm) *0.725*71,84*1000 Người ta cũng thấy có sự tương ứng giữa cân nặng và diện tích da: 1kg tương đương 221cm2[18]

Hình 1 : Cấu trúc giải phẫu mô học da [43].

Arrector pili muscule: cơ dựng lông, tóc; Hair follicle: nang lông, tóc; Eccrine sweat gland, duct – opening: tuyến tiết mồ hôi, ống, lỗ; Sebaceous gland: tuyến bã nhờn; Dermal papillae:nhú trung bì (1): lớp tế bào sừng; (2): lớp tế bào bóng; (3): lớp tế bào hạt; (4): lớp tế bào gai; (5): lớp tế bào mầm; (6): màng đáy

1.1.2 Cấu trúc cơ bản của lớp biểu bì (Epidermis)

Biểu bì là lớp ngoài cùng của da, dầy từ 0,07 đến 1,8 mm, che phủ ngăn cách toàn bộ cơ thể với môi trường Biểu bì gồm nhiều các tế bào biểu mô xếp dính chặt chẽ với nhau, phát triển biệt hoá từ trong ra ngoài (từ màng đáy lên trên bề mặt) Các tế bào lớp biểu bì thực chất là các tế bào biểu mô nhưng được phát triển và biệt hoá ở các giai đoạn khác nhau nên có những tên gọi khác nhau, từ lớp tế bào mầm trên màng đáy đến lớp tế bào gai, lớp tế bào hạt, lớp tế bào bóng và lớp tế bào sừng, các tế bào sừng chiếm tới 95% của

lớp biểu bì Những chỗ da mỏng nhất cũng gồm có hai lớp mầm và lớp sừng, chỗ dày nhất gồm đủ năm lớp và có thêm lớp tế bào bong vảy sừng [15, 18,

41, 55, 62, 64]

1.1.2.1 Lớp tế bào mầm (Stratum germinatum)

Lớp này còn được gọi là lớp đáy, gồm các tế bào biểu mô cao, to hình lăng trụ hoặc hình cột trụ thấp, những tế bào biểu mô của lớp mầm hay lớp đáy (Basic cell layer) là các tế bào gốc sừng của lớp biểu bì (epidermal stem cell) [38, 41, 62, 64], các tế bào này được gắn xuống màng đáy bằng các phân tử kết dính là fibronectin, bám dính chặt chẽ và lồi lõm theo sự nâng đội của lớp trung bì, giữa các tế bào sừng có các cầu nối gian bào (desmosome) các cầu nối gắn kết các tế bào sừng với nhau và gắn với các tế bào khác rất chặt chẽ, giúp cho các tế bào có cấu trúc ổn định không

bị vặn ép, các cầu nối này rất tinh tế, chúng cũng có thể bị phá bỏ và tự tái tạo giúp các tế bào phân chia sinh sản và di chuyển lên lớp trên Đảm bảo các tế bào mầm có khả năng liên tục phân chia và di chuyển về phía bề mặt

để thay thế các tế bào bề mặt đã mất đi, quá trình tái sản sinh nhiều và nhanh diễn ra trong suốt đời sống của con người và nhờ đó lớp biểu bì luôn được thay, đổi mới [3, 15, 18, 41, 43, 62, 64]

Trong bào tương của các tế bào mầm có mang các hạt sắc tố (Melanosome) do thực bào từ tế bào hắc tố (Melaninocytes) vỡ ra, có các sợi

tơ sừng (keratin filament) xếp thành bó nối với các cầu nối gian bào Do đó, khi phân cắt các cầu nối gian bào này để tách tế bào sừng ra riêng biệt, rất dễ làm tổn thương tới cấu trúc tế bào Ngoài ra, các tế bào mầm còn có các sợi tơ cực nhỏ (tạo thành các chất actin, myosin, alpha-actin) giúp cho tế bào dịch chuyển và biệt hoá dần ra bên ngoài [3, 18, 43]

Lớp mầm sản sinh ra các tế bào sừng cho toàn lớp biểu bì, trong lớp này có khoảng 10% là các tế bào gốc biểu bì (epidermal stem cell), 50% tế bào ở thời điểm giao thời sinh trưởng, 40% tế bào ở thời điểm hậu kỳ gián phân [43]

Quá trình sinh trưởng và phân chia của các tế bào mầm tạo nên tính cân bằng giữa sự bong vẩy của da và sự tăng sinh biệt hoá của tế bào mầm từ đáy lên Thời gian phát triển và biệt hoá từ lớp mầm đến lớp sừng trên cùng khoảng từ 26 đến 42 ngày Đặc biệt sau khi tổn thương, những kích thích sinh học và các tín hiệu từ bề mặt vết thương là những yếu tố cần thiết điều chỉnh kích thích đáp ứng phân bào và định hướng phù hợp các tế bào biểu mô, đa số làm cho quá trình này diễn ra mạnh mẽ hơn để làm lành vết thương Hầu hết các tín hiệu và kích thích sinh học từ các yếu tố trung bì gồm các protein chất nền mô liên kết và các yếu tố tăng trưởng (growth factor) là do các tế bào trung bì tiết ra [3, 18, 24, 30, 43, 58, 59]

Ở đây còn có các loại tế bào khác đó là tế bào hắc sắc tố, tế bào Langerhan, tế bào Meckel

* Tế bào hắc sắc tố (melanocytes): là tế bào có dạng hình đuôi gai chứa các hạt sắc tố melanosome có sắc tố melanin; tế bào hắc sắc tố nằm giữa các

tế bào mầm lớp đáy hoặc ngay trên lớp đáy, chúng tiếp giáp với các tế bào bên cạnh bằng các đuôi gai của chúng và giữa các tế bào này có khoảng cách

và không có cầu nối gian bào với nhau Các tế bào này quyết định tới màu sắc của da, càng trẻ hoặc càng già thì lượng tế bào hắc tố giảm, chúng bảo vệ cơ thể tránh khỏi bị tổn thương khi da tiếp xúc với các tia tử ngoại có hại, chúng thâm nhập vào các tế bào sừng bằng cac đuôi gai và chuyển các hạt sắc tố sang tế bào sừng [15, 18]

* Tế bào Langerhan (tế bào thực bào): là các tế bào có dạng đuôi gai giống tế bào hắc tố, không có hạt sắc tố và chúng sống rời rạc chủ yếu ngay mặt trên của tế bào mầm và trong các lớp tế bào ở trên, chúng di chuyển trong

da, chúng còn có trong trung bì và ở nhiều cơ quan khác nhau như lách, hạch lympho có nguồn gốc từ tế bào máu Langerhan là tế bào quan trọng trong phát hiện, xử lý (thực bào) giới thiệu các kháng nguyên giúp cho quá trình miễn dịch của da và cơ thể [47]

* Tế bào Lympho T: chiếm 1% của lớp tế bào biểu bì, tập trung chủ yếu dọc theo lớp tế bào mầm, lympho T tiếp xúc với các tế bào khi một số bệnh lý da chúng tiết ra interferon, lumphokin

* Tế bào Meckel: là các tế bào thụ cảm cơ học (mecano receptor) được phân bố ở lớp mầm, những vùng nhậy cảm cao như đầu ngón tay, môi, quanh ngoài gốc lông có nhiều Chúng có thể liên kết với nhau thành đĩa xúc giác nhờ cầu nối gian bào [18]

1.1.2.2 Lớp tế bào gai (stratum spinosum)

Lớp tế bào này nằm ngay phía trên lớp tế bào mầm, có từ 7 đến 15 hàng

tế bào, các tế bào được liên kết với nhau bởi các cầu nối và giữa chúng có các khe được hình thành nhằm để các chất dinh dưỡng được thẩm thấu tốt hơn từ dưới màng đáy lên Ngoài việc giúp các tế bào tăng trưởng còn giúp cho các

tế bào biệt hoá chuyên biệt Hình dạng chung của các tế bào là hình đa diện, nhân tròn, càng lên phía trên các tế bào này có hình dẹt hơn thể hiện sự biệt hoá cao hơn Bào tương chứa các sợi keratin được liên kết thành các bó cắm sâu nối tiếp các cầu nối gian bào, ở ngoại vi tạo thành các cầu gai liên kết tế bào Những cầu gai này khi bị tác động bởi các tác nhân vừa phải như bỏng nông sẽ bị cắt đứt và hình thành nốt phỏng, đồng thời kích thích vào đầu tận cùng thần kinh gây cảm giác đau tăng [15,18, 43]

Các tế bào gai có khả năng phân chia liên tiếp làm tăng số lượng tế bào sừng, giúp cho sự cân bằng trong quá trình tăng sinh và quá trình chết bong ra của tế bào sừng Những nghiên cứu về lớp tế bào mầm, tế bào gai giúp cho việc ứng dụng và phát triển công nghệ nuối cấy tế bào sừng là rất quan trọng, quyết định đến khả năng thành công của công nghệ, phần này sẽ được trình bày ở phần đặc điểm của tế bào sừng

1.1.2.3 Lớp tế bào hạt (stratum granulosum)

Gồm những tế bào dẹt nhân chứa các chất vùi bào tương (cytoplasmic inclusion) đó là chất sừng trong suốt (keratohyalin) ái kiềm mà chất protein

cơ bản là chất filaggin Dưới tác dụng của men membran bound epidermal transglutaminaza ở tế bào gai, tế bào hạt, men có tác dụng chuyển các glycolipid, sterol tự do, phospholipid thành một hàng rào chất béo nằm giữa hàng tế bào gai và tế bào sừng hoá giúp chống mất nước, chúng không có ở viền môi, mặt trong môi lớn âm đạo nên những vùng này có thể nhìn thấy

rõ vi mao mạch ở dưới Các tế bào hạt không chỉ tổng hợp, biến hoá và nối tiếp chéo các protein mới trong quá trình sừng hoá mà còn tự huỷ theo chương trình biệt hoá từ tế bào hạt thành tế bào sừng hoá Đa phần tế bào ở lớp này không còn khả năng phân chia nữa mà chúng chỉ làm nhiệm vụ biệt hoá biến thành tế bào bóng, tế bào sừng hoá Trong quá trình nuôi cấy các tế bào này thường phát triển rất kém đa số già đi và chết, chỉ có một phần nhỏ lớp tế bào này phát triển phân chia tiếp [3, 18,43]

1.1.2.4 Lớp tế bào trong suốt (stratum lucidum)

Hay còn gọi là lớp tế bào bóng, gồm khoảng từ 7 dến 15 tầng tế bào Sự thay đổi từ môi trường giàu dinh dưỡng đến môi trường nghèo dinh dưỡng hơn đã giúp cho quá trình biệt hoá các tế bào mầm ở màng đáy thành các tế

bào bóng được hoàn thành, do đó lớp tế bào này biến thành các đĩa trong và đặc, nhân tế bào mất đi, lớp tế bào này tạo thành dải mỏng ưa eosophin nằm ngay dưới lớp tế bào sừng, ở các vị trí tỳ đè thì lớp tế bào này rất dày chúng giữ da không mất nước đi và bảo bảo vệ các tế bào bên dưới trước những tác động cơ học có hại

1.1.2.5 Lớp tế bào sừng (stratum corneum)

Là lớp ngoài cùng gồm 15 đến 20 tầng tế bào, các tế bào này mất khả năng sống, chúng dính chặt vào lớp tế bào trong suốt tạo thành lớp bảo vệ ngoài cùng của da, bào tương chỉ chứa 10% nước, chúng thấm các chất nhờn

từ tuyến bã tiết ra, chúng có hình dẹt đa diện và trên 80% sừng là keratin

Lớp tế bào sừng rụng thành vẩy (stratum disjunctivum): đó là lớp tế bào ngoài cùng đã bị mòn thành những vẩy rụng đi cùng các chất bẩn trên da,

và các cầu nối gian bào ở lớp này đã bị huỷ bởi các men phân huỷ protein Quá trình điều hoà sự biệt hoá sừng và bong vẩy còn nhiều phức tạp

Biểu bì có chức phận giữ cho cơ thể tránh khỏi các yếu tố độc hại từ môi trường, chống sự xâm nhập của vi khuẩn, cách điện và cách nhiệt, giữ nước cho cơ thể, giữ độ ẩm Nếu hàng rào này bị tổn thương, sẽ mất nước tăng 10 đến 20 lần bình thường và phần còn lại như màng bán thấm mà vi khuẩn, các yếu tố độc hại có thể xâm nhập

Đại thể, lớp biểu bì như một màng trong qua đó chúng ta có thể nhìn thấy màu sắc của vi mao mạch dưới da, đồng thời màu sắc của da còn được quyết định bởi các sắc tố đen có tác dụng ngăn chặn các bức xạ có hại từ ánh nắng mặt trời xuyên sâu vào các lớp của da

1.1.3 Đặc điểm chung của tế bào sừng và quá trình biệt hoá của tế bào gốc (mầm) biểu bì

Các tế bào sừng chiếm 95% tổng số tế bào biểu bì Các tế bào mầm lớp đáy có khả năng sinh sản (phân chia nguyên phân) không ngừng Trong quá trình biệt hoá, chúng di chuyển lên phía trên thành nhiều tầng biểu mô luôn được thay thế mới nhờ sự phân bào liên tục của lớp mầm, lớp hạt giúp cung cấp các lớp tế bào mới cho sự bong vẩy sừng [18, 35, 38, 43]

Tế bào sừng có nguồn gốc từ tế bào gốc biểu mô, tế bào gốc biểu mô tạo sự cân bằng và là nền tảng sửa chữa cho các cơ quan, chúng có khả năng đặc biệt là tự làm mới mình trong suốt quá trình sống tại cơ quan mà chúng cư trú, chúng có thể sản xuất ra các tế bào chị em mà về sau có thể biệt hoá theo các hướng khác nhau thành tế bào đơn dòng hay đa dòng [38, 41, 62, 64]

Các tế bào gốc biểu mô được xác định là có mặt ở lớp đáy biểu bì, tồn tại xung quanh các gốc lông, tức là chỗ phình ra của gốc lông, đáy của các tuyến tiết bã Các tế bào gốc biểu mô này là nguồn gốc của tế bào gốc sừng và

từ đó tạo ra các tế bào sừng trong các lớp biểu bì Các tế bào gốc sừng có nhiệm vụ cung cấp nguồn tế bào thay thế cho các tế bào mất đi hàng ngày và chúng còn sản xuất nhanh hơn khi có tổn thương như bỏng, vết thương từ đó

da kịp thời hồi phục [22, 24, 25, 41, 60, 64]

Quá trình biệt hoá: khi các tế bào sừng ở lớp hạt chúng sản xuất ra hàng loạt protein dạng K1, K10 cùng một số protein bao bọc khác, làm vững thêm mạng lưới IF (Intermediate Filament, mạng sợi trung gian) và do đó làm căng các tế bào ra, các chất sừng sau đó tập trung lại kết hợp với IF tạo thành bó đàn hồi và giống như sợi cáp mạng

Các công trình nghiên cứu hoặc ứng dụng công nghệ nuôi cấy tế bào sừng đều dựa trên cơ sở cấu trúc, sự sinh trưởng phát triển và biệt hoá của tế bào, một chu trình sống của tế bào sừng trong môi trường cơ thể sẽ phân bào khoảng 30 đến 50 thế hệ, còn phân bào in vitro khi có các môi trường nuôi cấy kích thích tăng trưởng thì có thể lên tới 150 thế hệ [35, 40, 41, 47, 64]

1.2 Quá trình liền vết thương (wound healing)

Tất cả các vết thương ở cơ thể bình thường đều trải qua quá trình liền vết thương, đây là quá trình phản ứng của toàn thân biểu hiện tại chỗ bằng các giai đoạn: viêm cấp tính, giai đoạn tăng sinh, và giai đoạn tái tạo, phục hồi, các giai đoạn này kế tiếp nhau xen kẽ và ảnh hưởng lẫn nhau [2, 6, 18,

24, 45, 51]

1.2.1 Giai đoạn viêm (inflammatory phase)

Khởi phát khi có tổn thương, đáp ứng liền vết thương xảy ra ngay khi tổn thương Chấn thương cơ học, bỏng hoặc do phẫu thuật làm phá huỷ cấu trúc mô (mô da) gây chảy máu Khi chảy máu tiếp xúc collagen vết thương làm hoạt hoá, ngưng kết tiểu cầu và hoạt hoá các yếu tố đông máu Tiểu cầu

bị hoạt hoá là những tế bào chiếm ưu thế trong giai đoạn sớm ngay sau tổn thương, tiết ra các cytokines tiền viêm và yếu tố tăng trưởng TGF- β, PGDFm, các yếu tố này hoá hướng động các tế bào bạch cầu đa nhân trung tính, đại thực bào, nguyên bào sợi xâm nhập vết thương [2, 24, 51]

Giai đoạn viêm bao gồm: Tạo cục máu đông tăng tính thấm thành mạch

để cho các tế bào máu và các protein chủ chốt của quá trình liền vết thương như: fibronectin và fibrin vào mô Cục máu đông cùng với các proteinnày tạo thành giá đỡ tạm thời để các tế bào xâm nhập vết thương, dòng máu tăng lên,

sự xuyên mạch xảy ra, Bạch cầu đa nhân trung tính tập trung tại vết thương trong vòng vài phút để chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn Đối với những

vết thương sạch, không bị bội nhiễm thì Bạch cầu đa nhân trung tính sẽ giảm sau 3 ngày [2, 24]

Tiếp đến là các Đại thực bào xâm nhập vết thương, chúng có mặt tại vết thương sau 48 giờ đến 96 giờ, đạt đỉnh điểm ngày thứ ba sau tổn thương Đại thực bào có thể tồn tại ở vết thương lâu hơn Bạch cầu đa nhân trung tính

và tồn tại cho đến khi lành Đại thực bào có chức năng thực bào vi khuẩn, mô chết tại vết thương, tiêu hoá chúng, tiết ra các bFGF (hoá hướng động và kích thích phân chia Nguyên bào sợi và tế bào nội mạch), tiết ra IL-1 kích thích nhiều tế bào tăng sinh,trong đó các tế bào viêm và tế boà nội mạch Giảm số lượng Đại thực bào có thể gây ra rối loạn liền vết thương, do giảm khả năng làm sạch vết thương và giảm tăng sinh Nguyên bào sợi, giảm tân tạo mạch [2,

6, 9, 18, 45, 50]

1.2.2 Giai đoạn tăng sinh (proliferative phase)

Khi vết thương không có dấu hiệu nhiễm trùng, vết thương được làm sạch, loại bỏ mô chết hoặc khi giai đoạn tăng sinh ngắn thì giai đoạn viêm tăng sinh sớm xảy ra Đặc trưng của giai đoạn tăng sinh là hình thành mô hạt,

mô hạt là sự kết hợp của các thành phần: Nguyên bào sợi chiếm chủ yếu, các

tế bào viêm, mạch máu tân tạo nằm giữa mô liên kết căn bản ngoại bào gồm collagen, fibronectin, hyaluronic acid [2, 18, 24] Các quá trình xảy ra trong giai đoạn này gồm :

1.2.2.1 Tăng sinh Nguyên bào sợi:

Nguyên bào sợi xuất hiện sớm với số lượng lớn ở vết thương ngày thứ hai, đạt đỉnh điểm ngày thứ 7 sau khi bị tổn thương Nguyên bào sợi từ vùng lân cận di cư đến vết thương qua giá đỡ tạm thời của các sợi fibrin và fibronectin, Đại thực bào tiết ra bFGF, TGF-β, PDGF kích thích Nguyên bào

sợi tăng sinh và tổng hợp Glycosaminoglycan, proteoglycan hình thành chất nền của mô liên kết ngoại bào của mô hạt [18, 24, 45, 51]

Số lượng Đại thực bào giảm dần và Nguyên bào sợi còn sản xuất ra yếu

tố kích thích tăng trưởng tế bào sừng KGF, IGF-1 Lúc này Nguyên bào sợi là

tế bào chiếm ưu thế tại vết thương, cao nhất ngày 7-14 [2, 24, 45, 51]

1.2.2.2 Hình thành mô liên kết

Bắt đầu từ 5 -7 ngày, đỉnh cao 4 tuần, bao gồm các quá trình khác nhau Sản xuất collagen: là thành phần chính của chất nền mô liên kết trung bì Collagen giúp hồi phục cấu trúc mô bị tổn thương và tạo ra độ bền vững cho vết thương Nguyên bào sợi sản xuất collagen khi có các yếu tố tăng trưởng

do Đại thực bào và tiểu cầu tiết ra, collagen thấy ở ngày thứ 3 và cũng tăng nhanh trong ba tuần, tăng từ từ trong ba tháng ổn định vết thương Nguyên bào sợi sản xuất các phân tử collagen sắp xếp thành sợi collagen, tiếp theo các sợi liên kết chéo và tổ chức hoá thành các bó xếp song song dọc bề mặt vết thương làm tăng độ bền vững của mô [1, 2, 16, 18]

Nguyên bào sợi còn sản xuất ra các thành phần khác của mô liên kết trung bì như: fibronectin, hyaluronic acid và các glycosaminoglycans

Các thành phần mô liên kết trung bì có chức năng là môi trường cho các cytokine và các yếu tố tăng trưởng hoạt động, là môi trường tương tác, truyền đạt thông tin từ các thành phần chất mô liên kết trung bì điều tiết các giai đoạn liền vết thương

1.2.2.3 Tân tạo mạch

Bề mặt vết thương bị thiếu máu khi tổn thương sâu quá lớp trung bì Liền vết thương sẽ không hiệu quả khi thiếu hụt dòng máu mang dưỡng chất đến khu vực vết thương Đại thực bào tiết ra các yếu tố tân tạo mạch thông

qua hoá ứng động Nguyên bào sợi và tế bào nội mạch, các tế bào nội mô tăng sinh và tạo ra các mầm mao mạch Các mầm mao mạch tạo ra mạng lưới quai mao mạch đứt quãng để tạo ra nền cho mao mạch mới Tái tạo mạch của da ghép cũng là kết quả của quá trình này[1, 2, 16, 18]

Biểu mô hoá sớm sẽ hạn chế được mức độ ứ máu của vết thương và các tín hiệu kích thích tân tạo mạch giảm, mất đi

1.2.2.4 Tăng sinh biểu mô

Với những tổn thương nông, bỏng nông, sượt da thì biểu mô hoá là quá trình then chốt của lành vết thương Khi đó, các tế bào ở lớp mầm biểu bì sẽ tăng sinh để biểu mô hoá, lớp trung bì tiếp tục sinh trưởng định hướng, nuôi dưỡng lớp biểu bì

Tổn thương sâu mất toàn bộ trung bì, quá trình biểu mô hoá sẽ nhờ vào các tế bào mầm ở xung quanh bờ mép vết thương, hoặc nhờ phẫu thuật ghép da

Các thành phần chủ yếu của trung bì gồm: protein kết dính, sợi fibrin, collagen….cho phép các tế bào biểu mô bám dính lên nền mô hạt và di cư vào trung tâm vết thương Các yếu tố tăng trưởng PDGF, TGF- β, bFGF, KGF, IGF-1 trong giai đoạn tăng sinh sẽ kich thích các tế bào biểu mô di cư đến vết thương tăng sinh Khoảng cách tế bào di chuyển giới hạn trong 3 cm tính

từ mép vết thương, quá trình này có thể diễn ra trong 5- 7 ngày hoặc vài tháng tuỳ mức độ tổn thương….[1, 2, 6, 9, 12, 24, 51]

Quá trình biểu mô hoá sẽ diễn ra thuận lợi nếu duy trì độ ẩm phù hợp trên bề mặt vết thương Các loại vật liệu thay thế da tạm thời khi đắp lên vết thương sẽ duy trì độ ẩm giúp cho quá trình biểu mô hoá thuận lợi Các tấm tế

bào sừng có nguồn gốc tự thân sẽ bám lên bề mặt vết thương làm nhanh liền tổn thương này và không bị đào thải [9, 11, 12, 13, 20]

1.2.3 Giai đoạn trưởng thành (maturation phase)

Quá trình tái tạo hình (remodeling) bắt đầu vào khoảng tuần thứ 3 sau chi bi tổn thương và kéo dài hàng tháng, hàng năm Quá trình tái tạo hình là kết quả của tái tổ chức collagen, hoạt động collagen bắt đầu phân cắt để tạo sự cân bằng tổng hợp và thoái biến collagen, giảm mạng lưới các mao mạch, giảm proteoglycans thay thế bằng thành phàn nước vết thương

1.2.4 Vai trò của cytokines và yếu tố tăng trưởng trong liền vết thương

Họ yếu tố tăng trưởng tế bào biểu bì (Epidermal Growth Factor EGF): gồm những yếu tố gây phân bào, EGF, Transforming Growth Factor –

family-α (TGF-family-α), heparin-binding EGF (HB-EGF), amphiregludin, epiregulin, betacellulin, neuregulins, epigen Các yếu tố EGF là yếu tố kích thích phân chia tế bào sừng và nguyên bào sợi, có vai trò quan rọng trong hiệp đồng với

IGF, kích thích tế bào sừng tăng sinh TGF-α và HB-EGF tăng cao trong giai đoạn tăng sinh tế bào sừng, những nghiên cứu cho thấy rằng nguyên bào sợi tiết ra HB-EGF, TGF-α

Họ yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi (Fibroblast Growth Factor Family-FGF): gồm các yếu tố tăng trưởng có cấu trúc polypeptid, do chính nguyên bào sợi tiết ra chúng kích thích tăng trưởng nhiều loại tế bào khác nhau

ở lớp trung bì, có tác dụng điều tiết sự di cư, biệt hoá, bảo vệ, hỗ trợ tăng khả năng sông tế bào FGF7 gọi là KGF chỉ kích thích phân bào tế bào sừng

Họ yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu (Platelet Derived Growth Factor Family-PDGF): chủ yếu da tiểu cầu, đại thực bào, nguyên bào sợi tiết

ra Có tác dụng hoá ứng động các tế bào di cư đến vùng tổn thương, kích thích nguyên bào sợi sản xuất chất nền mô liên kết, có tác dụng kiểm soát hoạt động các tế bào mô liên kết trong quá trình liền vết thương

Họ yếu tố tăng sinh nội mô mạch máu (Vascular Endothelial Growth Factor Family-VEGF) và Placenta Growth Factor (PLGF) do nguyên bào sợi,

tế bào nội mạch tiết ra có vai trò chính trong tăng sinh tế bào nội mô mao mạch, đẩy nhanh quá trình lành vết thương

Transforming Growth Factor – β (TGF-β) đây là một trong những mediator mạnh nhất được giải phóng trong quá trình liền vết thương, tác động lên quá trình sinh trưởng di cư tế bào Kích thích nguyên bào sợi tăng sinh nhưng lại ức chế các tế bào khác, còn kích thích hoạt động các protein chất nền mô liên kết và integrin

Ngoài ra còn rất nhiều các yếu tố khác như: Granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF), Granulocyte-macrophage cology stimulating factor ( GM-CSF), Nerve growth factor (NGF), Neurotrophins, Erythropoietin