- Đánh giá hiệu quả điều trị bỏng sâu và các vết thương mất da bằng tấm TB sừng nuôi cấy đã được tạo ra. - Đánh giá hiệu quả lâm sàng. Xây dựng quy trình công nghệ nuôi cấy tế bào sừng tự thân trên màng nền Collagen; - Đánh giá hiệu quả lâm sàng của màng tế bào sừng da tự thân nuôi cấy trên vết thương bỏng sâu và vết thương mất da. 6. Các sản phẩm chính: - Quy trình công nghệ nuôi cấy tế bào sừng da tự thân trên màng nền Collagen tiêu chuẩn ASEAN; - Màng tế bào sừng tự thân nuôi cấy ( 100 đơn vị, mỗi đơn vị 75 cm2 ); - Bản báo cáo về kết quả lâm sàng của màng tế bào sừng tự thân nuôi cấy trên vết bỏng sâu và vết thương mất da.
BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ Y TẾ CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC10/06-10 BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu quy trình cơng nghệ ni cấy tế bào sừng tự thân màng collagen để điều trị bỏng sâu vết thương da MÃ SỐ ĐỀ TÀI: KC10.11/06-10 Chủ nhiệm đề tài PGS.TS Nguyễn Văn Huệ Ban chủ nhiệm chương trình Cơ quan chủ trì đề tài PGS.TS Nguyễn Gia Tiến Bộ Khoa học Công nghệ HÀ NỘI – 4/2010 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban giám đốc, Phòng sau đại học, Hệ sau đại học – Học viện Quân y Ban giám đốc, Bộ môn Bỏng - Viện bỏng Quốc gia tạo điều kiện thuận lợi cho phép tơi hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: GS TS Lê Năm, Giám đốc Viện bỏng Quốc gia PGS TS Nguyễn Văn Huệ, CN Bộ môn, PGĐ Viện bỏng Quốc gia PGS TS Nguyễn Gia Tiến, PCN Bộ môn, , PGĐ Viện bỏng Quốc gia TS Đinh Văn Hân, Chủ nhiệm khoa Labô Viện bỏng Quốc gia Tôi đặc biệt cảm ơn tới hướng dẫn giúp đỡ tận tình TS Nguyễn Viết Lượng, Trưởng phịng kế hoạch tổng hợp VBQG hướng dẫn giúp đỡ hồn thành luận văn Tơi vơ biết ơn thầy cô giáo, bạn đồng nghiệp, bệnh nhânđã hợp tác chặt chẽ, bảo tận tình tơi q trình học tập Tơi xin gửi lờ cảm ơn tới bác sĩ, điều dươngx, nhân viên: Khoa hồi sức bỏng - Viện bỏng Quốc gia Khoa bỏng người lớn - Viện bỏng Quốc gia Khoa bỏng trẻ em - Viện bỏng Quốc gia Khoa Labô - Viện bỏng Quốc gia Khoa gây mê phẫu thuật - Viện bỏng Quốc gia Khoa giải phẫu bệnh – Viện 103 Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè cổ vũ động viên, giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi suốt thời gian học tập, hồn thành luận văn Tống Thanh Hải DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BN bệnh nhân CEA tế bào sừng tự thân nuôi cấy : Cultured Epidermal Autograft CEAl tế bào sừng đồng loại nuôi cấy : Cultured Epidermal Allograft CS cộng DTCT diện tích thể P aeruginosa Pseudơmnas aeruginosa S aureus Staphylococcus aureus TBS tế bào sừng MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1:TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cấu trúc lớp biểu bì da 1.1.1 Cấu trúc da 1.1.2 Cấu trúc lớp biểu bì (Epidermis) 1.1.2.1 Lớp tế bào mầm (Stratum germinatum) 1.1.2.2 Lớp tế bào gai (stratum spinosum) 11 1.1.2.3 Lớp tế bào hạt (stratum granulosum) 12 1.1.2.4 Lớp tế bào suốt (stratum lucidum) 12 1.1.2.5 Lớp tế bào sừng (stratum corneum) 13 1.1.3 Đặc điểm chung tế bào sừng q trình biệt hố tế bào gốc (mầm) biểu bì 14 1.2 Quá trình liền vết thương (wound healing) 15 1.2.1 Giai đoạn viêm (inflammatory phase) 15 1.2.2 Giai đoạn tăng sinh (proliferative phase) 16 1.2.2.1 Tăng sinh Nguyên bào sợi: 16 1.2.2.2 Hình thành mơ liên kết 17 1.2.2.3 Tân tạo mạch 17 1.2.2.4 Tăng sinh biểu mô 18 1.2.2.5 Co kéo vết thương 19 1.2.3 Giai đoạn trưởng thành (maturation phase) 19 1.2.4 Vai trò cytokines yếu tố tăng trưởng liền vết thương 19 1.3 Các vật liệu thay da sử dụng điều trị bỏng sâu vết thương da 22 1.4 Quá trình nghiên cứu phát triển công nghệ nuôi cấy tế bào sừng 26 1.4.1 Công nghệ nuôi cấy tế bào tạo tế bào sừng giới 26 1.4.2 Công nghệ nuôi cấy tế bào tạo tế bào sừng Việt Nam 29 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Đối tượng nghiên cứu 32 2.2 Các hóa chất, vật tư tiêu hao nuôi cấy tế bào sừng 32 2.2.1 Các hóa chất 32 2.2.2 Các vật tư tiêu hao chủ yếu 33 2.2 Phương pháp nghiên cứu 34 2.2.1 Quy trình lấy mẫu da 34 2.2.2 Quy trình tách lọc tế bào sừng 35 2.2.3 Quy trình ni cấy tạo tế bào sừng 37 2.2.3.1 Các bước tiến hành trong ngày thứ nhất 37 2.2.3.2 Các bước tiến hành trong ngày thứ hai: 37 2.2.3.3 Các bước tiến hành trong ngày thứ ba và tiếp theo 38 2.2.3.4 Quy trình cấy chuyển nhân rộng số lượng tế bào sừng 38 2.2.3.5 Quá trình tạo tế bào sừng: 39 2.2.4 Quy trình chuẩn bị ghép 40 2.2.4.1 Phương pháp chuẩn đoán tổn thương: 40 2.2.4.1 Quá trình chuẩn bị ghép: 40 2.2.5 Quá trình ghép TBS tự thân nuôi cấy: 41 2.3 Thiết kế nghiên cứu 42 2.4 Cách thu thập số liệu 42 2.5 Xử lý số liệu: 42 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 43 3.1 Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu 43 3.2 Kết nghiên cứu nuôi cấy tế bào sừng môi trường không huyết labô 45 3.3 Kết ghép thử nghiệm lâm sàng 54 3.4 Những ca bệnh nhân điển hình ghép thành công 61 Chương 4: BÀN LUẬN 64 4.1 Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu 64 4.1.1 Tuổi, giới: 64 4.1.2 Đặc điểm vùng lấy da nghiên cứu 65 4.2 Đặc điểm q trình ni cấy sơ cấp 66 4.2.1 Kết tách lọc tế bào sừng từ mẫu da nghiên cứu 66 4.2.2 Kết q trình ni cấy sơ cấp 70 4.3 Q trình ni cấy thứ cấp 71 4.3.1 Tỷ lệ cấy chuyển tế bào nhân rộng số lượng 71 4.3.2 Kết tạo tế bào sừng 71 4.4 Kết ghép thử nghiệm lâm sàng 74 4.5 Thực tế ghép lâm sàng ca bệnh nhân 76 4.6 Lựa chọn tế bào sừng nuôi cấy tự thân làm vật liệu thay da che phủ vĩnh viễn cho vết thương bỏng vết thương da 78 KẾT LUẬN 80 KIẾN NGHỊ 81 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1: Cấu trúc giải phẫu mơ học da Hình 2: Vai trị tế báo liền vết thương 17 Hình 3: Tách lọc tế bào sừng 44 Hình 4: Tế bào sừng ngày thứ hai 45 Hình 5: Các đám tế bào sừng 45 Hình 6: Các đám tế bào sừng phát triển ngày thứ 45 Hình 7: Các đám tế bào sừng ngày thứ 10 46 Hình 8: Các đám tế bào sừng ngày thứ 46 Hình 9: Các tế bào sừng biệt hố 46 Hình 10: Diễn biến trình ghép tế bào sừng tổ chức hạt vết bỏng sâu 57 Hình 11: Diễn biến trình ghép tế bào sừng tổ chức hạt vết thương da 58 VIỆN BỎNG LÊ HỮU TRÁC CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Hà Nội, ngày tháng năm 2010 BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI I THÔNG TIN CHUNG TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu quy trình cơng nghệ ni cấy tế bào sừng tự thân màng collagen để điều trị bỏng sâu vết thương da Mã số đề tài: KC10.11/06-10 Thuộc: - Chương trình: Khoa học cơng nghệ trọng điểm cấp nhà nước Mã số KC10/06-10 Chủ nhiệm đề tài: Họ tên: Nguyễn Văn Huệ Ngày, tháng, năm sinh: Nam/ Nữ: Nam Học hàm, học vị: Phó giáo sư; Tiến sỹ Chức danh khoa học: Nghiên cứu viên cao cấp Chức vụ: Phó Giám đốc Điện thoại: Tổ chức: 04.36889344 Nhà riêng: 043 Mobile: 0913297440 Fax: 04.36883180 E-mail: Tên tổ chức công tác: Viện Bỏng Lê Hữu Trác Địa tổ chức: Tân Triều, Thanh trì, Hà Nội Địa nhà riêng: Tập thể Học Viện Quân Y, khu A đường Lê Hữu Trác, Hà Đơng, Hà Nội Tổ chức chủ trì đề tài/dự án: Tên tổ chức chủ trì đề tài: Viện Bỏng Lê Hữu Trác Điện thoại: 043.6889344 Fax: 043.6883180 E-mail: luonghll@gmail.com Website: Địa chỉ: Tân Triều, Thanh Trì, Hà Nội Họ tên thủ trưởng tổ chức: GS.TS Lê Năm Số tài khoản: Ngân hàng: Tên quan chủ quản đề tài: Bộ Y tế II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN Thời gian thực đề tài/dự án: - Theo Hợp đồng ký kết: từ tháng 04 năm 2007 đến tháng 04 năm 2010 - Thực tế thực hiện: từ tháng 04 năm 2007 đến tháng 04 năm 2010 - Được gia hạn (nếu có): - Lần từ tháng… năm… đến tháng… năm… - Lần … Kinh phí sử dụng kinh phí: a) Tổng số kinh phí thực hiện: 2.200 tr.đ, đó: + Kính phí hỗ trợ từ SNKH: 2.200 tr.đ + Kinh phí từ nguồn khác: Không tr.đ + Tỷ lệ kinh phí thu hồi dự án (nếu có): Khơng b) Tình hình cấp sử dụng kinh phí từ nguồn SNKH: Số TT Theo kế hoạch Kinh phí Thời gian (Tr.đ) (Tháng, năm) Thực tế đạt Thời gian Kinh phí (Tháng, năm) (Tr.đ) Ghi (Số đề nghị toán) c) Kết sử dụng kinh phí theo khoản chi: Đối với đề tài: Đơn vị tính: Triệu đồng Số TT Nội dung khoản chi Theo kế hoạch Thực tế đạt Trả công lao động (khoa học, phổ thông) Nguyên, vật liệu, lượng Thiết bị, máy móc Xây dựng, sửa chữa nhỏ Chi khác Tổng cộng Tổng SNKH Nguồn khác Tổng SNKH Nguồn khác - Lý thay đổi (nếu có): Các văn hành q trình thực đề tài/dự án: (Liệt kê định, văn quan quản lý từ công đoạn xác định nhiệm vụ, xét chọn, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực có); văn tổ chức chủ trì đề tài, dự án (đơn, kiến nghị điều chỉnh có) Số TT Số, thời gian ban hành văn Tên văn Quyết định Bộ Trưởng Bộ KHCN việc thành lập Hội đồng khoa học Quyết định số công nghệ cấp Nhà Nước tư vấn tuyển 237/QĐ-BKHCN chọn, xét chọn tổ chức cá nhân chủ trì ngày 22/9/2006 thực Đề Tài cấp Nhà Nước thực kế hoạch năm 2006 thuộc lĩnh vực Y Dược sức khoẻ cộng đồng Quyết định Bộ Trưởng Bộ KHCN Quyết định số việc phê duyệt tổ chức cá 775/QĐ-BKHCN nhân trúng tuyển chủ trì thực đề ngày 19/4/2006 tài dự án SXTN năm 2006 thuộc lĩnh vực Y Dược sức khoẻ cộng đồng Quyết định số Quyết định Bộ Trưởng Bộ KHCN 2096/QĐvề việc phê duyệt Chủ nhiệm, quan BKHCN ngày chủ trì kinh phí đề tài dự án Ghi 80 KẾT LUẬN Qua nghiên cứu ứng dụng công nghệ tạo tế bào sừng nuôi cấy tự thân ghép thử nghiệm bệnh nhân Viện Bỏng Quốc Gia Thời gian từ tháng 7/2008 đến tháng 8/2009 Chúng rút kết luận sau: Bước đầu, kỹ thuật nuôi cấy tế bào sừng tự thân màng collagen thực thành công labô nuôi cấy tế bào Viện Bỏng Quốc Gia: Tỷ lệ tách tế bào sừng khỏi mẫu da đạt 100%; tỷ lệ tế bào sừng sau tách khỏi mẫu da bám ổn định ngày thứ hai nuôi cấy đạt tỷ lệ 89,14% Tỷ lệ cấy chuyển thành công tế bào sừng nuôi cấy lên màng collagen (khi mật độ bám tế bào đạt 70% đến 80%) đạt tỷ lệ 63,15%, nhóm bệnh nhân bỏng sâu vết thương da đạt 66,67%, nhóm bệnh nhân cho mẫu da đạt 58,82% Thời gian tạo tế bào sừng màng collagen 23,85 ± 0,62 ngày Chất lượng tế bào sừng đồng nhau, có hai lớp tế bào mầm phát triển, mỏng dễ vỡ, khơng phải dùng gía đỡ (feeder layer) nuôi cấy, mà dùng màng collagen việc tạo tế bào Bước đầu, qua ghép thử nghiệm lâm sàng 11 bệnh nhân, có 10 bệnh nhân bỏng sâu bệnh nhân vết thương da Viện Bỏng Quốc gia, chúng tơi thấy: Thời gian chuẩn bị ghép trung bình 16,24 ± 7,34 ngày; ghép phải đạt số tiêu chuẩn như: mô hạt đỏ, phẳng, sạch, cấy khuẩn không mọc vi khuẩn mật độ vi khuẩn