Ca bệnh nhõn thứ nhất:
BN Nguyễn Đức V, 23 tuổi, nam, vào khoa HSCC ngày 23/8/2008, chuyển khoa ĐTLVT 22/9/2008, ra viện 24/10/2008.
Chẩn đoỏn: Bỏng lửa xăng 56% (25%) độ III, IV thõn chi, sốc bỏng ngày thứ 2.
Quỏ trỡnh điều trị: Được điều trị tớch cực tại khoa HSCC bằng truyền dịch, truyền mỏu, khỏng sinh, giảm đau, an thần thuốc bổ. Thay băng tại chỗ, phẫu thuật cắt hoại tử và ghộp da, khi toàn trạng ổn định chuyển lờn ĐTLVT
điều trị tiếp. Tổn thương cũn 2% tổ chức hạt đỏ, đẹp, phẳng, ớt dịch, bờ mộp xung quanh đỡ viờm nề, biểu mụ bờ mộp đang phỏt triển thu hẹp. Tại đõy thay băng ghộp tấm tế bào sừng nuụi cấy tự thõn.
Sinh thiết da ngày 27/8/2008 khoảng 3 cm2 vựng nỏch, nuụi cấy tạo tấm và ghộp lần đầu ngày 17/9/2008.
Hỡnh 10: Diễn biến quỏ trỡnh ghộp tấm TBS lờn nền tổ chức hạt vết bỏng sõu: 1. Tấm TBS đang ghộp lờn 2% tổ chức hạt cẳng chõn 17/9/2008. 2. Ngày thứ 3 sau ghộp tấm TBS 19/9/2008. 3. Ngày thứ 12 29/9/2008 sau ghộp tấm TBS, tỉ lệ thành cụng 80%. 4. Vết thương liền hoàn toàn thỏng thứ 2.
Ca bệnh nhõn thứ 2:
BN Hàn Quốc V, 26 tuổi, nam, vào khoa ĐTLVT ngày 7/8/2009, ra viện ngày 18/9/2009.
Chẩn đoỏn: 3% tổ chức hạt cẳng chõn T do tai nạn giao thụng đó rạch giải phúng chốn ộp N8.
1 2
Quỏ trỡnh điều trị: bệnh nhõn bị tai nạn chốn ộp khoang cẳng chõn T đó rạch hoại tử giải phúng chốn ộp, lộ cơ, được truyền dịch, dựng khỏng sinh, giảm đau, vào khoa ĐTLVT cũn tổn thương 3% tổ chức hạt xấu, cú nhiều giả
mạc, nhiều dịch, hoại tử, mỏu tụ đen, tại đõy được thay băng đắp cỏc thuốc mỡ biafin, vaselin. Tổ chức hạt phỏt triển tốt.
Sinh thiết da 3 cm2 vựng nỏch, nuụi cấy tạo tấm TBS ghộp ngày 25/8/2009. Hỡnh 11: Diễn biến quỏ trỡnh ghộp tấm TBS lờn TCH vết thương mất da: 1. Tấm TBS ghộp lờn TCH ngày 25/8/2009. 2. Tấm TBS bỏm sống tốt trờn vết thương ngày thứ 4 29/8/2009. 3. Tấm TBS bỏm sống ngày thứ 8 2/9/2009. Tỉ lệ bỏm sống đạt 100%. 4. Ngày thứ 28 ghộp tấm TBS. 1 3 4 2
Chương 4 BÀN LUẬN 4.1. Đặc điểm bệnh nhõn nghiờn cứu. 4.1.1. Tuổi, giới:
Trong nhúm bệnh nhõn nghiờn cứu của chỳng tụi, gặp tuổi trung bỡnh của nhúm nhúm bệnh nhõn bỏng và vết thương mất da cao hơn nhúm bệnh nhõn tự nguyện cho mẫu da, tuổi thấp nhất là 2 tuổi, cao nhất là 46 tuổi. Nhúm tuổi này tương đương nằm 2 đến 47 tuổi nằm trong nhúm tuổi 31,6 ± 22,1 của Snelling C.F.T., Williamson J.S. và CS trong 5 năm 1988-1999[56],
độ tuổi của Hickerson trung bỡnh là 38,8 tuổi [36]. Đõy là lứa tuổi mà chỳng ta cần tập trung nghiờn cứu, lứa tuổi lao động chớnh của xó hội, để gúp phần cứu chữa trả lại cho cộng đồng những người khoẻ mạnh, cũn sức lao động phục vụ cho bản thõn và xó hội. Nhúm tuổi này nằm trong tuổi mà tế bào cơ
thể cú khả năng nuụi cấy dưới 75 tuổi [22,56,58].
Trong độ tuổi này tỷ lệ nam gặp nhiều hơn nữ (64,79% và 34,21%) tuy nhiờn chỳng tụi khụng thấy liờn quan nào giới tớnh đến.
Đối với nhúm bỏng sõu: bệnh nhõn cú diện tớch bỏng sõu lớn nhất là 50% DTCT và bệnh nhõn cú diện tớch bỏng sõu nhỏ nhất là 1% DTCT. Đối với nhúm vết thương mất da: bệnh nhõn cú diện tớch mất da lớn nhất là 25% DTCT, bệnh nhõn cú diện tớch mất da bộ nhất là 3% DTCT, trung bỡnh là 8,00 ± 5,67% DTCT trung bỡnh là 22,23 ± 2,68% DTCT. Diện tớch trung bỡnh vựng nghiờn cứu là 2,00 ± 0,21% DTCT. Diện tớch bỏng chung nghiờn cứu cú bệnh nhõn tới 75% DTCT, và bộ nhất là 2% DTCT, chỳng tụi nhận thấy những BN cú diện tớch bỏng chung lớn sẽ làm giảm nhiều vựng cho da ghộp, và nếu cú diện tớch bỏng sõu nhiều sẽ dẫn đến là phải lấy da nhiều lần trờn cựng một vựng cho da ghộp tự thõn, và bệnh nhõn đú phải chờ thời gian lõu
hơn để vựng da cho lành lại, chịu nhiều cuộc phẫu thuật hơn (do mỗi cuộc phẫu thuật chỉ cho phộp khoảng 10% DTCT vỡ liờn quan chủ yếu mất mỏu, dịch thể của bệnh nhõn) và bệnh nhõn cú nguy cơ gặp những biến chứng và tai biến trong cụng tỏc điều trị nhiều hơn. Do đú những BN bỏng sõu và vết thương mất da cần lượng một số lượng lớn cỏc vật liệu che phủ tạm thời hoặc vĩnh viễn càng sớm càng tốt, (cú nguồn gốc từ cơ thể là tốt nhất) giảm cỏc cuộc phẫu thuật, giảm mất mỏu, giảm biến chứng do dựng thuốc... [17,22,27,56,38]. Quỏ trỡnh điều trị khụng thành cụng, một phần trong đú cũng khụng cú nguồn vật liệu phự hợp che phủ ngay cho bệnh nhõn.
4.1.2. Đặc điểm vựng lấy da nghiờn cứu.
Vị trớ lấy da vựng nỏch là chủ yếu chiếm 78,58%, vựng nỏch và mu này cú những đặc điểm chung: đú là vựng da mềm mại, chun dón tốt, cú nhiều nang lụng, dày, nơi kớn đỏo đảm bảo mặt thẩm mỹ; cũn vựng mặt trong đựi và mặt trong cỏnh tay thỡ mềm mại, cú ớt nang lụng. Kết quả nuụi cấy ở những ngày đầu thấy những mẫu da ở vựng nỏch thỡ cỏc tế bào sừng bỏm sống tốt hơn những vựng khỏc; vấn đề này chỳng tụi chưa dỏm khẳng định là vựng nỏch cỏc tế bào sừng khoẻ hơn và nuụi cấy dễ hơn cỏc vựng mặt trong đựi, mặt trong cỏnh tay do cỡ mẫu cũn hạn chế, và độ tuổi cũn rộng. Nhưng qua những kinh nghiệm trong quỏ trỡnh tỏch lọc tế bào sừng thỡ chỳng tụi thấy những tế bào mầm gốc nang lụng cú khả năng phỏt triển mạnh hơn hẳn cỏc tế
bào mầm biểu bỡ ở phớa trờn lớp nhỳ, và nghiờn cứu của chỳng tụi cũng phự hợp với kết quả của Alain Limat và Thomas Hunziker khẳng
định[3,23,29,62]: Những tế bào quanh gốc nang lụng, túc (The outer root sheath – ORS - of hair follicles) khụng giỳp cho tỏi tạo được lụng túc nhưng chỳng cú khả năng gúp phần phỏt triển mạnh và tỏi tạo (phõn chia) di cư từ
sừng bị mất. Những nghiờn cứu gần đõy cũng chắc chắn rằng đú là quần thể tế
bào gốc của tế bào biểu mụ nằm ở vị trớ ở bao gốc ngoài nang lụng. Đõy là những tế bào mầm được chỳ ý quan tõm nhiều nhất và là nguồn tế bào sẵn cú
để dựng thay thế. Và cú rất nhiều những kinh nghiệm nuụi cấy tế bào ORS đó
được mụ tả, và kỹ thuật phỏt triển cụng nghệ nuụi cấy tế bào ORS sẽ làm tăng nhanh số lượng và rỳt ngắn thời gian về lựa chọn mẫu da, thời gian nuụi cấy[23,40,51]. Với những bệnh bỏng sõu, rộng và mất da nếu khụng được lựa chọn vựng da cú nhiều lụng dày thỡ chỳng ta cần cú những nghiờn cứu dài hơi hơn để đỏnh da khả năng mọc cỏc tế bào ở cỏc vựng da khỏc nhau, ở cỏc lứa tuổi từ đú sẽ cú quy trỡnh chuẩn trong lấy mẫu da điều trị. Từ đú chỳng tụi cũng khuyến cỏo nờn sinh thiết lựa chọn mẫu da ở vựng nỏch: để ứng dụng cụng nghệ nuụi cấy tấm tế bào sừng tự thõn ghộp cho bệnh nhõn.
4.2. Đặc điểm quỏ trỡnh nuụi cấy sơ cấp.
4.2.1. Kết quả tỏch lọc tế bào sừng từ mẫu da nghiờn cứu.
Mẫu da đặt trong ống tube được ủ cựng với dung dịch Dispase II ở
nồng độ 0,5mg/ml trong dung dịch đệm Hank’s. Ta tỏch được lớp biểu bỡ ra khỏi hoàn toàn lớp trung bỡ. Thụng thường người ta sử dụng cỏc enzyme thuỷ
phõn protein như Trypsin, collagenase để tỏch mụ và tế bào, nếu ủ thời gian lõu thỡ cỏc enzyme này thường gõy tổn thương tế bào, việc sử dụng Dipase II giỳp vượt qua những khú khăn này. Dipase là proteinase trung tớnh, là một enzyme được sản xuất bởi Bacillus polymyxa, dú đú giảm nguy cơ nhiễm virus từđộng vật, và hoạt tớnh giảm bằng cỏch pha loóng, nú cú tỏc dụng tỏch vựng màng cơ bản của biểu bỡ và trung bỡ. Trong khi pha cựng dung dịch Trypsin, Desmosome liờn kết chặt chẽ giữa cỏc tế bào sẽ bị tỏch khỏi nhau. Hoạt tớnh của Trypsin mạnh hơn Dipase II, nờn cỏc tế bào sẽ được tỏch dời nhau ra [5, 26, 27, 31, 56, 61, 63].
Kết quả tỏch tế bào sừng ra khỏi mẫu da bằng Dispase II của 38 mẫu da
đều thành cụng 100%; tất cả cỏc mẫu da đều cú tế bào sừng. Trong đú hầu hết tế bào sừng của cỏc mẫu da bỏm sống chủ yếu ở ngày thứ 2 chiếm 89,47%; cũn lại 4 mẫu da ta thấy tế bào bỏm sống ngày thứ 3 là 10,53%. Kết quả của chỳng tụi tương đương với Horch R. E., Ronfard V. [3, 5, 32, 33, 36, 53] tế
bào sừng bỏm sống cao nhất sau 48h (ngày thứ 2 nuụi cấy), và hầu như khụng thấy tế bào bỏm vào ngày thứ 3. Kinh điển Rheiwald và Green đó sử dụng feeder 3T3 (nguyờn bào sợi chuột của dũng tế bào 3T3 lấy từ khối u chuột nhắt bị chiếu xạ khụng tăng sinh nhưng vẫn tiết ra một số chất giỳp tăng trưởng tế bào sừng [49, 52, 54] hoặc một số màng polymer, màng nylon, chất cơ bản ngoại tế bào (extrancellular matrix)[36, 53, 61, 63], những màng này giỳp cho cỏc tế bào bỏm nhanh và ổn định lờn trờn mụi trường. Nghiờn cứu của chỳng tụi khụng sử dụng cỏc feeder layer đú mà dung mụi trường KCM giỳp cỏc tế bào bỏm trực tiếp lờn đỏy chai nuụi cấy, nhưng sẽ làm đơn giản quỏ trỡnh nuụi cấy.Thấy được hạn chế trong phương phỏp của chỳng tụi đó khụng sử dụng lớp đỏy 3T3 để nuụi cấy ngay từ đầu. Nờn trong nuụi cấy sẽ
giảm giảm tỷ lệ thành cụng và tăng thời gian nuụi cấy. Từ đú đũi hỏi cú những vật liệu mới trong nước sản xuất, rẻ hơn, để trong quỏ trỡnh nuụi cấy sơ
cấp này giỳp cho cỏc tế bào bỏm ổn định nhanh hơn một trong số đú là collagen tỏch ra từ màng ối mà chỳng tụi đang tiến hành triển khai nghiờn cứu thờm [2, 5, 7, 12, 54].
Ở quỏ trỡnh nuụi cấy sơ cấp này thấy cú 5 mẫu da bị hỏng chiếm khoảng 13,15%, cú 3 mẫu da bị hỏng ngày thứ 3, trong đú cú 2 mẫu da mụi trường đục mầu (nhiễm khuẩn) cấy khuẩn khụng mọc vi khuẩn, cũn 1 mẫu da cỏc tế bào sừng trương to, vỡ bong khỏi đỏy chai nuụi cấy; ngày thứ 4 hỏng 2 mẫu da, trong đú 2 mẫu da mụi trường đục cấy khuẩn khụng mọc vi khuẩn, chưa chứng minh được chớnh xỏc là nhiễm khuẩn. Trong 2 nhúm bệnh nhõn
thỡ nhúm bệnh nhõn bỏng và vết thương mất da cú tỷ lệ nhiễm khuẩn cao hơn nhúm bệnh nhõn tỡnh nguyện cho mẫu da (19,05 % so với 5,88 %). Cho thấy bệnh bỏng, mất da cú vết thương là mụi trường thuận lợi cho vi khuẩn phỏt triển nguy cơ nhiễm khuẩn cao. Mẫu da hỏng cú thể xỏc định do những nguyờn nhõn sau:
Hàng đầu là do nhiễm khuẩn, nấm từ mẫu da sinh thiết làm cho mụi trương nuụi cấy đục màu, hoặc nhỡn thấy sợi nấm; thứ hai là do quỏ trỡnh phõn cắt cỏc liờn kết trong tế bào (desmosome), tế bào bỏm lờn đĩa thỡ chỳng bỏm dớnh chặt chẽ với nhau và chỳng ta khi tỏch cỏc tế bào để cấy chuyển phải dựng cỏc men proteinase như Trypsin để tỏch cỏc phõn cắt này, cỏc men Trypsin phõn huỷ rất mạnh, nếu để quỏ lõu gõy tổn thương tế bào.làm cỏc tế
bào chết, nhõn trương to, tế bào nổi, cú mảnh vỡ tế bào lơ lửng, và cỏc tế bào bỏm thỡ hỡnh trũn, xung quanh nhõn cú vũng sỏng; thứ ba là do nhiễm khuẩn từ trong Labụ, và sự thoỏi biến cỏc dung dịch nuụi cấy khụng làm phỏt triển tế
bào [22, 23, 28, 30, 33, 43, 48].
Khi tỏch tế bào sừng lần đầu tiờn bằng Trypsin ta thu được hỗn dịch tế
bào, được pha thờm dung dịch KCM và cấy vào chai (flask) 25 cm2, đếm tế
bào khoảng 5*104 cells/cm2đến 1* 105 cells/cm2 là đưa vào nuụi cấy ổn định trong chai. Lượng tế bào của chỳng tụi cũng tương đương một số tỏc giả như
Rheiwald và Green đưa ra là đạt mật độ từ 2-5*104 cells/cm2. Yvonne Barlow và Richard J. Pye cấy lờn chai đạt 6.25 x 104 to 1.25 x 105 cells/cm2 cao hơn. Lượng tế bào ban đầu đưa vào cao hay thấp đều phụ thuộc vào kinh nghiệm nuụi cấy và sử dụng cụng nghệ nuụi cấy tế bào sừng trong mụi trương khụng huyết thanh hay là mụi trường cú huyết thanh. Và mật độ tế bào bỏm ổn định
đỏy chai nuụi cấy của chỳng tụi tương đương với cỏc phương phỏp nuụi cấy tế
Sau 2 ngày nuụi cấy sơ cấp cỏc tế bào cú được từ mẫu da là những tế
bào nằm đơn lẻ rải rỏc trờn đĩa nuụi cấy, hoặc cỏc tế bào bỏm với nhau 2,3 tế
bào nhưng hỡnh thể của chỳng trũn, sỏng màu, chưa thấy hoặc chưa cú tế bào sừng nào được phõn chia, chủ yếu là cỏc tế bào ban đầu tỏch ra và bỏm ổn
định lờn đỏy chai. Lỳc đú chỳng tụi tiến hành thay mụi trường KCM bằng mụi trường KGM, đõy mới chớnh là mụi trường giỳp cho tế bào sừng phỏt triển phõn chia tăng nhanh về số lượng và chất lượng.
Ngày thứ 4,5: cỏc tế bào sau chi đó ổn định được thay thế bởi mụi trường KGM, bắt đầu cỏc tế bào phõn chia chậm chạp, đõy chớnh là quỏ trỡnh cỏc tế bào tớch luỹ về chất, chỳng trao đổi chất tổng hợp protein rất mạnh để
chuẩn bị cho sự phõn bào, giỳp cho tế bào bỏm tốt hơn. Những nghiờn cứu của chỳng tụi mụ tả cho thấy cỏc tế bào cũng bịảnh hưởng của quỏ trỡnh phõn cắt cỏc liờn kết gian tế bào bởi men Trypssin, điều đú cho thấy men Trypsin cú nồng độ phự hợp sẽ giỳp cỏc tế bào ổn định nhanh hơn.
Ngày thứ 6,7: cỏc tế bào phõn chia nhanh hơn, mạnh hơn, cỏc tế bào từ
những tế bào đơn lẻ ban đầu, phỏt triển thành cỏc đỏm tế bào (conoly), cỏc
đỏm tế bào này cũn nhỏ.
Từ ngày 8 đến 10 thỡ cỏc đỏm tế bào phỏt triển lan rộng ra xung quanh và bỏm phủ dần dần bề mặt chai nuụi cấy, chỳng ta thấy những hỡnh ảnh đặc trưng nhất của tế bào sừng: tế bào sừng hinh ovan, cỏc tế bào bỏm sỏt nhau,
đồng đều về kớch thước, nhõn rừ, nguyờn sinh chất và bào tương bỡnh thường, bờ ngoài tế bào nhẵn khụng cú gai, gờ; cú hỡnh ảnh tế bào hỡnh hạt đậu đang tỏch ra, ngoài ra cú một số tế bào trũn, nguyờn sinh chất và bào tương sang mầu thể hiện sự ngừng phõn chia. Mật độ bỏm khoảng (confluence) 70% đến 80%. Ngày cấy chuyển là ngày thứ 8 đến 10, chiếm tỷ lệ cao ngày thứ 9 là
36,84%. Lỳc này chỳng tụi tiến hành cấy chuyển tế bào sang giai đoạn nuụi cấy thứ cấp, đõy là thời điểm lựa chọn cấy chuyển phự hợp nhất mà chỳng tụi thu nhậđược cỏc tế bào khoẻ mạnh, số lượng nhiều và đồng đều nhau. Kiểm tra tế bào trong giai đoạn này chỳng ta cú thể thấy tế bào khoẻ hay yếu , định hướng ước lượng kết quả nuụi cấy thời gian tiếp theo. Nhiều tỏc giả chọn thời
điểm cấy chuyển từ ngày thứ 7 đến ngày 10, Ronfard V. cấy chuyển ngày 9[62]; cỏc tỏc giả khỏc thỡ thời gian nuụi cấy: Yvonne Barlow and Richard J. Pye thỡ mật độ tế bào bỏm đạt 70% vào ngày 10 đến 15 ngày, cũn một số cho rằng bỏm đạt 70% vào 10 đến 13 ngày. Nghiờn cứu này lựa chọn thời điểm cỏc tế bào chủ yếu là cỏc tế bào mầm khỏe mạnh, phõn chia cao, khi cấy chuyển sẽ tăng nhanh về số lượng; nếu để mật độ bỏm cao hơn sẽ làm cỏc tế
bào đi vào chu trỡnh biệt húa tế bào, làm cỏc tế bào già đi, sừng húa.
4.2.2. Kết quả quỏ trỡnh nuụi cấy sơ cấp.
Quỏ trỡnh nuụi cấy sơ cấp của nhúm BN cho mẫu da và bệnh nhõn bỏng sõu, vết thương mất da cấy chuyển thành cụng sang giai đoạn nuụi cấy thứ
cấp là tương đương nhau 94,11% và 80,84% với p=0,11 (>0,05). Ở Viện bỏng