2.2.1. Quy trỡnh lấy mẫu da.
Những bệnh nhõn được chọn sẽ tiến hành giải thớch và lấy mẫu da.
* Vị trớ sinh thiết mẫu da:
Trong đề tài chỳng tụi chọn lọc vựng da lấy là những vựng da lành, khụng bị sẹo, khụng nhiễm trựng, khụng cú tổn thương, hoặc xa tổn thương trỏnh được sự nhiễm khuẩn từ vết thương vào mẫu da trong quỏ trỡnh lấy da.
Vựng thường được lựa chọn da mềm mại, chu gión tốt, cú nhiều (dày) nang chõn lụng, cú thẩm mỹ : nỏch, mu, bẹn, bụng, mặt trong cỏnh tay- đựi.
Da lấy dầy toàn lớp diện tớch khoảng 2 đến 4 cm2.
* Vệ sinh, sỏt trựng vựng lấy da:
Cạo sạch lụng vựng định lấy, tắm toàn thõn từ ngày hụm trước phẫu thuật (nếu thực hiện được)
Vệ sinh vựng lấy da ngay trước khi phẫu thuật (Rửa vựng da bằng xà phũng y tế (Microshiedl) sau đú rửa lại bằng nước vụ khuẩn).
Sỏt trựng bằng Betadine 10% 2 đến 3 lần. Sỏt trựng bằng cồn 70% thể tớch 2 đến 3 lần. Rửa bằng nước muối 0,9%.
Thấm khụ.
* Sinh thiết, bảo quản mẫu da:
Tube vụ trựng co chứa 5mL mụi trường bảo quản DMEM: 95% thờm Antibiotic 1% và Antimycotic 5%.
2.2.2. Quy trỡnh tỏch lọc tế bào sừng.
* Chuẩn bị nghiờn vật liệu.
PBS; Dispase II 0.5mg/ml; Ethanol 70% thể tớch; Trypsin 1X; DMEM90%/FCS10%.
KCM - Keratinocyte Culture Medium bao gồm: (FCS: 10%; DMEM: 90%; EGF: 5 nanogram/mL; Cholera toxin: 1 x 10-10M; Hydrocortisone: 0.4microgam/ml).
KGM - Completed Keratinocyte Serum-Free Medium bao gồm Epilife và EDGS.
* Mụi trường nuụi cấy tế bào sừng
Mụi trường nuụi cấy tế bào sừng phỏt triển cỏch đõy hơn 25 năm từ khi những hệ thống trung tõm lớn được thiết lập. Gần đõy thỡ cỏc nghiờn cứu liờn tục và phỏt triển từ mụi trường cơ bản và cú thể chia ra làm hai loại mụi trường chớnh:
+ Mụi trường cú huyết thanh: huyết thanh động vật được bổ xung vào mụi trường như nguồn dinh dưỡng cho tế bào phỏt triển: huyết thanh bào thai bũ (FCS), huyết thanh bũ mang thai (FBS) nú hoạt động như hệ đệm pH và cung cấp cỏc hormon và cỏc GF, protein cần cho ổn định và phõn tỏn hormon, dinh dưỡng tế bào và cỏc chất ức chế men protease....Tuy nhiờn huyết thanh khụng được coi là chất tốt nhất tạo nờn mụi trường tối ưu cho sự phỏt triển tăng trưởng và biểu hiện chức năng tế bào, do dễ biến đổi, dẽ mang mầm bệnh nấm, virus...ngoài ra cú LDH, LDL, vitamin C...khụng bền ở nhiệt độ thấp.
+ Mụi trương khụng huyết thanh: do những hạn chế của mụi trường bổ
xung huyết thanh, nhiều nhà khoa học tỡm ra những mụi trường mới và Ts. Richard G. Ham đó thiết lập quy trỡnh nuụi cấy tế bào sừng trong mụi trường
khụng cú huyết thanh, trong mụi trường này cú sự thay đổi cỏc thành phần như: acid amin, nguyờn tố vi lượng, vitamin, ion... do đú trong quỏ trỡnh nuụi cấy cần bổ xung cỏc thành phần như: EGF, insulin, transferrin,... cho phộp sự
tăng trưởng, tăng sinh tế bào. Tuy nhiờn số lần cấy chuyển sau nuụi cấy sơ
cấp cũng ớt hơn với mụi trường cú huyết thanh do đú cần bổ xung một số yếu tố từđộng vật.
Hiện nay những mụi trường nuụi cấy tế bào sừng chuyờn biệt khụng bổ
xung huyết thanh cú rất nhiều và nghiờn cứu phỏt triển rất mạnh khắc phục những nhược điểm của cỏc mụi trường trước đú như: MCDB151, MCDB153, MCDB 154, Epilife... Trong đú mụi trường Epilife là mụi trường cơ bản nuụi cấy tế bào sừng giỳp tế bào sừng tăng trưởng mạnh, tăng sinh mạnh, sụng khỏe, dài hơn cú thể tạo tới 150 thế hệ.
Do đú chỳng tụi chọn nuụi cấy tế bào sừng trong mụi trường Epilife. Kiểm tra hàng ngày sự phỏt triển của tế bào sừng, đỏnh giỏ chất lượng tế bào, sự nhõn lờn, sự nhiễm khuẩn. Chia quỏ trỡnh nuụi cấy thành 2 giai đoạn chớnh. + Giai đoạn nuụi cấy sơ cấp: tớnh từ khi lấy mẫu da đưa vào trong Labụ nuụi cấy đến khi thu nhận được cỏc mẫu tế bào phỏt triển bỏm đỏy chai che phủ khoảng trờn 70% diện tớch đỏy chai thỡ tiến hành tỏch và cấy chuyển bằng Trypsin sang cỏc chai nuụi cấy flask.
+ Giai đoạn nuụi cấy thứ cấp: tớnh từ khi tỏch Trypsin cỏc tế bào sừng bỏm 70% đến 80% trờn đĩa, tiến hành đếm tế bào sừng trờn mẫu, và cấy chuyển nhõn rộng số lượng tế bào sừng trờn nhiều đĩa: lần cấy chuyển đầu thu
được cỏc đĩa tế bào mật độ bỏm 70% là P1, tiếp tục cấy chuyển lần 2 thu được P2, P3, P4... đến khi tế bào chết khụng phỏt triển nữa, bong ra và vỡ tế bào.
+ Giai đoạn tạo tấm TBS tự thõn: giai đoạn này cũng lựa chọn cỏc thời
collagen sau 1 đến 2 ngày thu được cỏc tấm tế bào sừng cú đủ điều kiờnk ghộp lờn bệnh nhõ. 3 thời điểm này sẽđược mụ tả kỹ bằng cỏc ngày nuụi cấy.
2.2.3. Quy trỡnh nuụi cấy tạo tấm tế bào sừng. 2.2.3.1. Cỏc bước tiến hành trong ngày thứ nhất 2.2.3.1. Cỏc bước tiến hành trong ngày thứ nhất
Cắt lọc mỡ ở mẫu da.
Rửa mẫu da 2 lần bằng PBS để loại bỏ mỏu và tổ chức chết.
Cắt nhỏ mẫu da thành cỏc mẩu da cú kớch thước 0,5cm x 0,2cm trong
đĩa petri cú chứa 5ml DMEM cú 1% khỏng sinh. Ngõm mẫu da 30 giõy trong cồn 70% thể tớch. Rửa mẫu da 2-3 lần bằng PBS để loại bỏ cồn.
Đặt cỏc mẩu da đó xử lý vào tube vụ trựng cú chứa 10ml dung dịch Dispase II ở nồng độ 0,5mg/ml trong dung dịch đệm Hank’s.
Đặt tube da vào mụi trường lạnh 40C trong 12 giờ.
2.2.3.2. Cỏc bước tiến hành trong ngày thứ hai:
Đặt tube chứa da ởđiều kiện nhiệt độ phũng trong vũng 4 giờ. Làm ấm dung dịch trypsin đến 370C.
Lấy cỏc mẩu da từ tube vụ trựng bằng pipet, đặt vào đĩa petri. Bổ sung dung dịch trypsin 1X .
Dựng dao mổ thường cạo lớp biểu bỡ tỏch ra khỏi trung bỡ. Hỳt chuyển cỏc tế bào biểu bỡ sau khi tỏch vào ống ly tõm.
Sục mạnh dung dịch tế bào trong tub ly tõm bằng pipet để làm tỏch cỏc tế bào khỏi sự kết nối bằng desmosome, thời gian tiến hành trong khoảng 3 phỳt .
Bổ sung DMEM cú 10% FCS để ngừng quỏ trỡnh trypsin.
Ly tõm tube tế bào ở tốc độ 8.000 vũng/phỳt và tiến hành trong 8-10 phỳt và loại bỏ dịch nổi.
Bổ sung KCM với số lương 1,5ml cho lượng tế bào tỏch từ 1cm2.
Đếm tế bào và cấy tế bào vào chai nuụi cấy ở số lượng 5 x 104 – 1 x 105 /cm2, bổ sung KCM đủ số lượng 3ml cho chai 25cm2.
Đặt chai tế bào nuụi cấy vào tủ ấm 370C với 95% thể tớch khớ trời và 5% thể tớch CO2.
2.2.3.3. Cỏc bước tiến hành trong ngày thứ ba và cỏc ngày tiếp theo
Kiểm tra chai nuụi cấy đỏnh giỏ tỡnh trạng nhiễm khuẩn. Hỳt bỏ dịch nổi trong chai nuụi cấy.
Rửa tế bào đó bỏm vào bề mặt chai nuụi cấy bằng dung dịch PBS hoặc HanK’s để làm sạch huyết thanh.
Thay KCM bằng KGM vào chai nuụi cấy với số lượng tương đương (3ml KGM đối với chai 25cm2).
Đặt chai tế bào nuụi cấy vào tủ ấm 370C với 95% thể tớch khớ trời và 5% thể tớch CO2 và theo dừi hàng ngày.
Từ ngày thứ 4 trởđi kiểm tra tế bào hàng ngày và thay mụi trường nuụi cấy KGM sau 2-3 ngày.
Khi tế bào sừng mọc thành cỏc đỏm (colony) và nhõn lờn đạt 70% - 80% diện tớch che phủ đỏy chai nuụi cấy thỡ tiến hành cấy chuyển nhõn rộng tế bào sừng.
2.2.3.4. Quy trỡnh cấy chuyển nhõn rộng số lượng tế bào sừng
Kiểm tra cẩn thận tỡnh trạng tế bào nuụi cấy để phỏt hiện cỏc dấu hiệu bị ụ nhiễm. Đỏnh giỏ sơ bộ mật độ tế bào bằng mức độ phủ kớn bề mặt (confluence), pH mụi trường...trước khi tiến hành cấy chuyển. Khi tế bào đạt
độ che phủ 70%-80% thỡ tiến hành cấy chuyển để nhõn rộng số lượng tế bào. Quy trỡnh cấy chuyển thực hiện như sau:
Trypsin/EDTA 1X (Trypsin 0.125%/EDTA0.01% )làm ấm ở 370C. Mụi trường làm dừng quỏ trỡnh Trypsin: DMEM 90%, FCS 10%. Dung dịch đệm PBS 1X.
Mụi trường nuụi cấy tế bào sừng KGM.
* Cỏc bước tiến hành cấy chuyển:
Hỳt bỏ dịch nổi trong chai nuụi cấy.
Rửa tế bào bằng dung dịch đệm PBS với số lượng 0,2 ml/cm2. Thờm dung dịch Trypsin/EDTA với số lượng 0,1mL/cm2.
Đặt chai nuụi cấy vào tủấm theo dừi trong 4-5 phỳt.
Cho thờm 0,1 – 0,2 mL/cm2 mụi trường DMEM 90%, FBS 10% làm ngừng quỏ trỡnh trypsin.
Thu tế bào vào ống ly tõm, đếm số lượng tế bào.
Ly tõm ở tốc độ 1000 vũng/phỳt trong khoảng thời gian 5 phỳt.
Hỳt bỏ dịch nổi sau ly tõm, cho thờm mụi trường nuụi cấy tế bào sừng (KGM). Cấy chuyển sang chai khỏc mật độ 3000 TB/cm2 hoặc 1chai nuụi cấy 25cm2 nhõn rộng ra 9 chai 25cm2 (tỷ lệ 9/1).
Đặt cỏc chai nuụi cấy trở lại tủấm, hàng ngày theo dừi tỡnh trạng tế bào và thay mụi trường sau 2-3 ngày.
Kết quả thu được của lần cấy chuyển này là P1. Tiến hành thu được đĩa nuụi cấy 70% - 80% diện tớch che phủ đỏy chai nuụi cấy thỡ tiến hành cấy chuyển lần hai P2. Tiếp tục cấy chuyển cỏc lần tiếp theo ta thu được P3, P4, P5.
2.2.3.5. Quỏ trỡnh tạo tấm tế bào sừng:
Chuẩn bị húa chất như cấy chuyển, cựng màng collagen.
Tiến hành kiểm tra đĩa nuụi cấy ở P3 chi đạt 70% - 80% diện tớch che phủđỏy chai nuụi cấy thỡ tiến hành tỏch lọc tế bào sừng và cấy lờn tấm giỏ đỡ, màng collagen.
Đặt lại cỏc đĩa chứa màng vào tủa ấm và theo dừi ngày thứ 1, thứ 2. Khi mật độ tế bào sừng che phủ hết đỏy màng tiến hành đưa tấm tế bào sừng đến ghộp lờn nền ghộp cú tổ chức hạt chuẩn bị trờn chớnh bệnh sinh thiết mẫu da.
2.2.4. Quy trỡnh chuẩn bị nền ghộp.
2.2.4.1. Phương phỏp chuẩn đoỏn tổn thương:
Chẩn đoỏn diện tớch vết thương bỏng, diện tớch mất da theo ba phương phỏp: phương phỏp Lờ Thế Trung 1,3,6,9,18; phương phỏp bàn tay Blokhin; phương phỏp con số 9 (Wallas) và bảng tớnh diện tớch bỏng theo tuổi (VBQG).
Chẩn đoỏn độ sõu vết thương bỏng theo 5 độ, vựng mất da.
Những bệnh nhõn được ghộp tấm tế bào sừng tự thõn cú vết thương bỏng sõu IV và vết thương mất da.
2.2.4.1. Quỏ trỡnh chuẩn bị nền ghộp:
Bệnh nhõn bị bỏng sau khi được chẩn đoỏn, tiến hành lấy da ngay trong những ngày đầu, sau đú được điều trị kết hợp bằng nhiều phương phỏp như: Cỏc bệnh nhõn nặng được hồi sức chống sốc tớch cựu, cứu sống tớnh mạng bệnh nhõn.
Sử dụng cỏc thuốc nõng đỡ cơ thể, khỏng sinh toàn thõn phũng và điều trị nhiễm khuẩn tại chỗ toàn thõn.
Chăm súc vết thương, sử dụng cỏc thuốc đắp tại chỗ làm bong dụng sạch hoại tử tại vết thương: Flamizin, Silverin, Maduxin... Cỏc vết thương cú hoại tử rộng, khú rụng, tiến hành phẫu thuật cắt hoại tử sớm hoặc muộn theo phương phỏp tiếp tuyến, hoặc toàn bộ, sau đú được đắp cỏc màng sinh học che phủ: trung bỡ da lợn, da đồng loại, tấm nguyờn bào sợi, hoặc cỏc màng
tổng hợp: Urgotul, Vaselin ... dựng che phủ tạm thời kớch thớch tổ chức hạt phỏt triển. Đối những vết thương cú hoại tử sõu rạch hoại tử rải phúng chốn ộp, cú thể hỳt ỏp lực õm (VAC) làm nhanh sạch hoại tử và tổ chức hạt phủ đầy cỏc tổn khuyết...cho tới khi mụ hạt phỏt triển trờn cỏc vết thương thỡ ta cú thể tiến hành ghộp.
Cỏc bệnh nhõn trờn sau khi lấy da nuụi cấy trong quỏ trỡnh điều trị theo dừi thời gian nuụi cấy tế bào sừng và ghộp lờn màng thỡ trong lỳc đú vẫn được
điều trị tớch cực tạo điều kiện và thời gian làm sạch tổn thương để cú tổ chức hạt đẹp chuẩn bị ghộp da.
2.2.5. Quỏ trỡnh ghộp tấm TBS tự thõn nuụi cấy:
Kiểm tra chất lượng tấm TBS: cỏc tấm TBS đồng đều nhau, hỡnh dạng như nhau, phẳng, màu trắng búng, soi qua kớnh nhỡn thấy mật độ bỏm cỏc tế
bào trờn màng collagen cú hỡnh dạng kớch thước tương đối giống nhau, cỏc tế
bào sừng chủ yếu là tế bào mầm đang phõn chia, và bỏm dàn đều trờn mặt tấm, cú khoảng 1 hoặc 2 lớp TBS. Tiến hành chuẩn bị nền ghộp và mang tấm tế bào sừng ra ngoài ghộp trong 30 phỳt khi nhấc tế bào khỏi chai nuụi cấy. * Chuẩn bị nền ghộp giống như chuẩn bị nền ghộp da tự thõn mảnh mỏng. Nền ghộp được thỏo bỏ băng gạc nhẹ nhàng. Tiến hành cấy khuẩn trước ghộp Tiến hành sỏt trựng bằng Betadin loóng khoảng 3% và đắp gạc khụ để
che phủ và thấm hết dịch tại nền ghộp.
Sau đú được rửa nước muối từ 2 đến 3 lần đắp 2,3 lớp gạc khụ hỳt ẩm hoặc làm khụ vết thương.
Xỏc định vết thương sạch thỡ tiến hành bỏ gạc khụ và lấy cỏc tấm TBS
sỏt vào nền tổ chức hạt) sao cho cỏc tấm phẳng, khụng quăn bờ mộp, khụng cú khớ dưới cỏc tấm (tương tự như ghộp da- nhưng chỉ cần làm tại buồng băng vụ trựng) khụng được day đi, làm trượt cỏc tấm TBS.
Tiến hành đặt gạc vaselin đậm đặc lờn trờn cỏc tấm TBS và sau đú đặt 3
đến 5 lớn gạc khụ, cố định băng dớnh chống xụ, tiến hành băng cuộn với ỏp lực vừa phải 80mmHg như băng trong ghộp da.
Thay băng sau 2 ngày, và cỏc tấm TBS chuẩn bị ghộp bổ xung vào những vựng khụng cú tấm TBS, và băng lại như trờn kiểm tra và thay băng 2 ngày 1 lần. Đến thời điểm khoảng 6, 8,12 đỏnh giỏ kết quả.
2.3. Thiết kế nghiờn cứu.
Nghiờn cứu can thiệp kết hợp phõn tớch và mụ tả
Nghiờn cứu tiến cứu.
2.4. Cỏch thu thập số liệu.
Chỉ tiờu lõm sàng: tuổi, giới, tỏc nhõn bỏng, diện tớch, …thời gian sử
dụng thuốc, thời gian lành.
Xột nghiệm mỏu, sinh húa. Xột nghiệm vi khuẩn tại chỗ.
Tiến hành thu thập cỏc đặc trưng quỏ trỡnh nuụi cấy trong Labụ. Xột nghiệm mụ bệnh học tấm tế bào sừng.
2.5. Xử lý số liệu:
Chương 3 KẾT QUẢ NGHIấN CỨU 3.1. Đặc điểm bệnh nhõn nghiờn cứu. Bảng 3.1.1: Tuổi trung bỡnh của bệnh nhõn nghiờn cứu. Nhúm Tuổi trung bỡnh Bệnh nhõn cho da (n=17) 7,94 ± 2,61 Bệnh nhõn bỏng sõu và vết thương mất da (n=21) 25,95 ± 1,78 Nhận xột: Độ tuổi trung bỡnh của nhúm nhúm bệnh nhõn bỏng và vết thương mất da cao hơn nhúm bệnh nhõn tự nguyện cho mẫu da (25,95 ± 1,78 và 7,94 ± 2,61 tuổi), tuổi thấp nhất là 2 tuổi, cao nhất là 46 tuổi. Bảng 3.1.2: Giới tớnh của bệnh nhõn nghiờn cứu. Nhúm Nam Nữ Bệnh nhõn cho da (n=17) 11 6 Bệnh nhõn bỏng sõu và vết thương mất da (n=21) 14 7 Tổng cả hai nhúm (n=38) 25 (65,79%) 13 (34,21%)
Nhận xột: Tỷ lệ bệnh nhõn nam chiếm khoảng 65,79% cao hơn bệnh nhõn nữ 34,21%.
Biểu đồ 3.1: Giới tớnh của cả hai nhúm nghiờm cứu. Bảng 3.1.3: Diện tớch tổn thương chung và diện tớch vựng nghiờn cứu ở cỏc bệnh nhõn bỏng và vết thương mất da.
Nhúm Diện tớch %
Bệnh nhõn bỏng sõu Bệnh nhõn vết thương mất da
Trung bỡnh tổn thương chung 22,23 ± 2,68 8,00 ± 5,67
Trung bỡnh vựng nghiờn cứu 2,00 ± 0,21 2,50 ± 0,28 Nhận xột: Đối với nhúm bỏng sõu: bệnh nhõn cú diện tớch bỏng sõu lớn nhất là 50% DTCT và bệnh nhõn cú diện tớch bỏng sõu nhỏ nhất là 1% DTCT, trung bỡnh là 22,23 ± 2,68% DTCT. Diện tớch trung bỡnh vựng nghiờn cứu là 2,00 ± 0,21% DTCT. Đối với nhúm vết thương mất da: bệnh nhõn cú diện tớch mất da lớn nhất là 25% DTCT, bệnh nhõn cú diện tớch mất da bộ nhất là 3% DTCT, trung bỡnh là 8,00 ± 5,67% DTCT. Diện tớch trung bỡnh vựng nghiờn cứu là 2,50 ±