Những cụng trỡnh nghiờn cứu đó bắt đầu rất sớm từ những giữa thế kỷ
XX nhưng cho đến những năm 1960 Cruickhanh và cộng sự, năm 1967 Briggaman và cộng sự, năm 1970 Yuspa và cộng sự, năm 1971 Fusnig … đó cụng bố về nuụi cấy tế bào sừng.
Đến 1975 Rheinwarld J.G và Green H đó cú những chứng minh cỏc tế
bào biểu mụ tỏch lọc từ da nuụi cấy in vitro, trong quỏ trỡnh nuụi cấy dựa trờn sự nuụi cấy đồng thời nguyờn bào sợi chuột tạo thành lớp đỏy 3T3. Lớp đỏy 3T3 “feeder-layer” là nguyờn bào sợi của chuột dũng tế bào 3T3 lấy từ khối u chuột nhắt bị chiếu xạ liều cao đủ đến chi cỏc tế bào này khụng tăng sinh nhưng vẫn tiết ra một số chất giỳp cho sự tăng trưởng của tế bào. Nguyờn bào sợi chuột được cấy trong mụi trường D’MEM cú nồng độ Glucose cao, bổ
xung 10% FBS, Penicillin, Steptomycin (100UI/mL), dung dịch đệm bicarbonate sodium với một lượng phự hợp được chiếu xạ, mật độ tế bào bỏm
đạt 50% đĩa nuụi cấy thỡ được sử dụng giỏ đỡ trực tiếp cho nuụi cấy tế bào sừng.Và hiện nay thỡ dũng tế bào này độc quyền bởi Green và cú giỏ thành rất cao. Nờn nhiều nhà khoa học đó nghiờn cứu tỡm ra nhiều loại màng đỏy nhõn tạo làm giỏ đỡ tạo điều kiện tốt cho sự tăng trưởng của tế bào [54, 37, 64].
Năm 1983 Paul W Cook và cộng sựđó nuụi cấy tế bào sừng trong cỏc mụi trường khỏc nhau chứa cỏc hợp chất: BSA (bovine serum albumin), transferrin… và trờn lớp nguyờn bào sợi [37, 64].
Cú thể nuụi cấy TBS phỏt triển nhanh mà khụng cần lớp đỏy (giỏ đỡ) trong huyết thanh tạo ra cấu trỳc nhiều lớp trờn mảnh ghộp “sheet grafts”; tạo ra cấu trỳc kết hợp bởi biểu bỡ – chất tương tự trung bỡ. Nuụi cấy tế bào sừng trờn cỏc giỏ đỡ là cỏc màng lưới collagen khụng cú tế bào, màng fibrin …
Trong in-vitro nuụi cấy TBS tự thõn và ứng dụng điều tri cỏc loại vật liệu như:
TBS trờn collagen gel kết hợp nguyờn bào sợi.Bell E và CS năm 1983; Archambault M, Yaar M, Gilchrest BA năm 1995.
Tấm TBS với màng collagen- Glycosaminoglycan (collagen-GAG) kết hợp nguyờn bào sợi; Hansbrough JK và CS năm 1989; Cooper ML và CS năm1993;
Tấm TBS trờn lớp fibrin gel, fibrin Glue; V. Ronfardvà CS năm 1991. Tấm TBS trờn tế bào trung bỡ da lợn Matouskova E năm 1993.
Tấm TBS trờn tế bào trong trung bỡ da người; Rennekampff HO và CS năm 1997.
Tấm TBS trờn lưới collagen ngựa; Horch RE và CS 1998
Tấm TBS trờn micro-perforated hyaluroic acid membrane (LaserskinTM VivodermTM); Andreassi L năm 1991.
Tấm TBS trờn collagen + Chondroitin-6-sulfate cựng silicon
membrane; Brurke JF và CS năm 1981.
Ngoài ra cũn tỏch lọc TBS trong hỗn dịch cú nuụi cấy và khụng nuụi cấy và phun trực tiếp vào vết thương kết hợp nền collagen, acid hyaluronic, silicon…
Nuụi cấy TBS tạo cấu trỳc 3D trung tõm là hệ thống giỏ đỡ [37]
Năm 1988 tế bào biểu bỡ tự thõn nuụi cấy trở nờn phổ biến ở cỏc nước phương tõy, Mỹ như Epicel (Genzym Tissue Repair Corporation, Cambridge, MA). Cho đến nay thỡ tõm tế bào sừng tự thõn nuụi cấy đó được sử dụng nhiều trờn một số nước Boston (Mỹ), Oxford (Anh), Thượng Hải (Trung Quốc), Singapore và mang lại những thành cụng trong điều trị vết thương bỏng, vết thương mất da, liền vết thương món tớnh….[64]
1.4.2. Cụng nghệ nuụi cấy tế bào và tạo tấm tế bào sừng tại Việt Nam.
Tại Việt Nam, cũng đó cú những cụng trỡnh nghiờn cứu nuụi cấy tế bào sừng cho mục đớch điều trị bỏng và vết thương phần mềm. Từ năm 1998, Lờ Thế Trung đó cụng bố nghiờn cứu nuụi cấy thành cụng tế bào sừng ca đầu tiờn
ở Việt Nam để điều trị cho bệnh nhõn bỏng, tiếp theo đú là cỏc cụng trỡnh nuụi cấy tế bào sừng đơn thuần trong in vitro của cỏc nhà sinh học tế bào, tuy nhiờn chưa ỏp dụng điều trị thành cụng trờn bệnh nhõn. Từ 2006 cỏc tỏc giả
Nguyễn Văn Huệ, Đinh Văn Hõn, Nguyễn Viết Lượng và cộng sự đó tiến hành cụng trỡnh nghiờn cứu cụng nghệ nuụi cấy tế bào sừng trong mụi trường khụng huyết thanh và thử nghiệm ghộp tự thõn nuụi cấy điều trị vết thương bỏng đó mở ra hướng mới trong phương phỏp trị liệu tế bào [3, 5, 19].
Ở nước ta trong những năm gần đõy ước tớnh trung bỡnh cú khoảng 791.000 người bị bỏng và chiếm gần 1% dõn số trong cả nước và cú thể
cũn cao hơn nữa. Trong đú tỷ lệ bỏng sõu diện rộng chiếm khoảng 10% - 15% số nạn nhõn bị bỏng. Tỡnh hỡnh bệnh nhõn vết thương mất da do nhiều nguyờn nhõn như tai nạn giao thụng, tai nạn lao động… cũng ngày một tăng. Mặc dự chưa cú cỏc thống kờ cụ thể nhưng chỉ tại Viện Bỏng Quốc Gia trung bỡnh mỗi thỏng đó thu dung điều trị từ 30 – 40 bệnh nhõn. Tại Viện Bỏng Quốc Gia hiện nay mỗi năm cú khoảng 3000 bệnh nhõn bỏng
được điều trị tại Viện và cũn rất nhiều bệnh nhõn chấn thương mất da (được chuyển đến từ cỏc tuyến dưới,trung tõm chấn thương lớn) đang ngày càng tăng lờn [10, 13, 19, 20, 21].
Và cụng nghệ nuụi cấy tấm tế bào sừng tự thõn đó cú những thành cụng và ngày càng sử dụng như một phương phỏp trị liệu tế bào hàng đầu trong
Cỏc hướng nghiờn cứu chớnh về nuụi cấy tế bào và ứng dụng tế bào sừng nuụi cấy hiện nay.
Hiện nay nuụi cấy tế sừng dưới sự hỗ trợ của cỏc cụng nghệ khỏc nhau
để rỳt ngắn thời gian từ khi nuụi cấy đến khi cú tấm tế bào đầu tiờn ghộp cho bệnh nhõn và giảm chi phớ nuụi cấy.
Nuụi cấy tế bào sừng được gắn trờn cỏc giỏ đỡ tương đương trung bỡ nhằm tăng tớnh bền vững cơ học cho mụ sẹo và dễ dàng ghộp lờn vết thương. Cỏc vật liệu này cú thể là fibrin, collagen hoặc chất đệm kết hợp với thành phần của tế bào fibroblast.
Nghiờn cứu ghộp tấm tế bào sừng tự thõn nuụi cấy trờn giỏ đỡ đơn thuần hay kết hợp ghộp với da đồng loại, tấm tế bào khỏc tấm Tergaderm, Biobrane, hay ghộp cựng với da mảnh mỏng tự thõn.
Nghiờn cứu ra những tấm da nhõn tạo cú cấu trỳc hai lớp giống da người, đểđảm bảo một phần chức năng cú thể.
Ngoài ra cũn nghiờn cứu chớnh là tỡm “giỏ đỡ tế bào” phự hợp tiờu chuẩn: chất liệu của giỏ đỗ phải thớch hợp ghộp lờn vết thương, giỏ đỡ giỳp tế
bào sừng sống và phỏt triển tốt, dễ sản xuất, giỏ thành thấp mà chỳng ta cú thể
sản xuất [1, 2, 5, 6, 12] .
Tại VBQG đó ứng dụng cụng nghệ hiện đại nuụi cấy tế bào và một số
kinh nghiệm trong việc ghộp tế bào điều trị vết thương. Cỏc nghiờn cứu màng collagen từ cỏc nguồn nguyờn vật liệu trong nước đó sản xuất màng collagen từ nhau thai điều trị bỏng…. Hiện nay hợp tỏc nghiờn cứu cựng với cỏc trung tõm nổi tiếng trờn thế giới về nuụi cấy tế bào và được chuyển giao cụng nghệ
bậc nhất từ trung tõm Cell Research Corporation của Singapore đó sản xuất ra tấm tế bào sừng nuụi cấy trờn giỏ đỡ màng collagen [1, 5, 7].
Tấm tế bào sừng tự thõn nuụi cấy giỏ đỡ đó khắc phục được những phần lớn những yờu cầu trong cụng tỏc điều trị và nhược điểm của một số
màng sinh học như: bỏm song vĩnh viễn, cú thể tự sản xuất, dễ ghộp, sử dụng nhiều cỏc vết thương da khỏc như: ghộp cho bệnh nhõn loột, ghộp cho bỏng nụng, ghộp thẩm mỹ [1, 5, 12].
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU 2.1. Đối tượng nghiờn cứu.
Bao gồm bệnh nhõn bị bỏng hoặc cú vết thương mất da được vào điều trị tại Viện Bỏng Quốc Gia thời gian từ thỏng 8/2008 đến thỏng 7/2009.
Bệnh nhõn tuổi từ 1 đến 45 tuổi.
Bệnh nhõn bỏng, bỏng sõu cú ớt nhất 1% DTCT.
Bệnh nhõn cú vết thương mất da, diện tớch từ 1% DTCT. Bệnh nhõn và gia đỡnh tự nguyện và hợp tỏc nghiờn cứu.
Bệnh nhõn khụng cú tiền sử dị ứng với cỏc khỏng sinh Penicillin, Steptomycin, Gentamycin. Khụng mắc bệnh về da đang tiến triển.
Xột nghiệm sinh húa và huyết học, nước tiểu cơ bản trong giới hạn bỡnh thường.
Xột nghiờm sàng lọc loại trừ cỏc bệnh nhõn nhiễm virus HIV, HBsAg, HCV, Giang mai.
2.2. Cỏc húa chất, vật tư tiờu hao nuụi cấy tế bào sừng. 2.2.1. Cỏc húa chất chớnh.
Mụi trường DMEM (Dulbeco’s Modified Eagle Media)
Mụi trường PBS (Phosphate – Buffered Salines) hoặc Hank’s Balance Solution
Trypsin – EDTA (0,005% Trypsin, 0,53mM EDTA .Na): dung dịch gồm 0,5g/L trypsin và 0,2g/L EDTA.4Na trong dung dịch Hanks’ khụng cú CaCl2
Antibiotic/Antimycotic: dung dịch hỗn hợp khỏng sinh gồm 100 đơn vị
penicillin 100 àg streptomycin và 0,025 àg amphotericin B trong 1 mL natriclorid 0,85%
FBS (Fetal Bovine Serum) Epilife bao gồm EDGS Dispase II
EGF (Epithelium Growth Factor) Hydrocortisone, Choleratoxin DMSO (dimethyl sulfoxide)
Cỏc hoỏ chất do hóng Gippco/Invitrogen và hóng Sigma cung cấp, đạt tiờu chuẩn quốc tế vềđộc tớnh, loại trừ cỏc bệnh truyền nhiễm.
2.2.2. Cỏc vật tư tiờu hao chủ yếu.
Chai (Flask) nuụi cấy tế bào loại 75cm2 và 25cm2.
Đĩa petri loại D 100.
Pipet loại 1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL.
Ống ly tõm loại 15 mL, 50 mL. Cỏc màng lọc để pha mụi trường.
Cỏc vật tư tiờu hao do hóng Corning cung cấp đạt tiờu chuẩn quốc tế về
2.2. Phương phỏp nghiờn cứu. 2.2.1. Quy trỡnh lấy mẫu da. 2.2.1. Quy trỡnh lấy mẫu da.
Những bệnh nhõn được chọn sẽ tiến hành giải thớch và lấy mẫu da.
* Vị trớ sinh thiết mẫu da:
Trong đề tài chỳng tụi chọn lọc vựng da lấy là những vựng da lành, khụng bị sẹo, khụng nhiễm trựng, khụng cú tổn thương, hoặc xa tổn thương trỏnh được sự nhiễm khuẩn từ vết thương vào mẫu da trong quỏ trỡnh lấy da.
Vựng thường được lựa chọn da mềm mại, chu gión tốt, cú nhiều (dày) nang chõn lụng, cú thẩm mỹ : nỏch, mu, bẹn, bụng, mặt trong cỏnh tay- đựi.
Da lấy dầy toàn lớp diện tớch khoảng 2 đến 4 cm2.
* Vệ sinh, sỏt trựng vựng lấy da:
Cạo sạch lụng vựng định lấy, tắm toàn thõn từ ngày hụm trước phẫu thuật (nếu thực hiện được)
Vệ sinh vựng lấy da ngay trước khi phẫu thuật (Rửa vựng da bằng xà phũng y tế (Microshiedl) sau đú rửa lại bằng nước vụ khuẩn).
Sỏt trựng bằng Betadine 10% 2 đến 3 lần. Sỏt trựng bằng cồn 70% thể tớch 2 đến 3 lần. Rửa bằng nước muối 0,9%.
Thấm khụ.
* Sinh thiết, bảo quản mẫu da:
Tube vụ trựng co chứa 5mL mụi trường bảo quản DMEM: 95% thờm Antibiotic 1% và Antimycotic 5%.
2.2.2. Quy trỡnh tỏch lọc tế bào sừng.
* Chuẩn bị nghiờn vật liệu.
PBS; Dispase II 0.5mg/ml; Ethanol 70% thể tớch; Trypsin 1X; DMEM90%/FCS10%.
KCM - Keratinocyte Culture Medium bao gồm: (FCS: 10%; DMEM: 90%; EGF: 5 nanogram/mL; Cholera toxin: 1 x 10-10M; Hydrocortisone: 0.4microgam/ml).
KGM - Completed Keratinocyte Serum-Free Medium bao gồm Epilife và EDGS.
* Mụi trường nuụi cấy tế bào sừng
Mụi trường nuụi cấy tế bào sừng phỏt triển cỏch đõy hơn 25 năm từ khi những hệ thống trung tõm lớn được thiết lập. Gần đõy thỡ cỏc nghiờn cứu liờn tục và phỏt triển từ mụi trường cơ bản và cú thể chia ra làm hai loại mụi trường chớnh:
+ Mụi trường cú huyết thanh: huyết thanh động vật được bổ xung vào mụi trường như nguồn dinh dưỡng cho tế bào phỏt triển: huyết thanh bào thai bũ (FCS), huyết thanh bũ mang thai (FBS) nú hoạt động như hệ đệm pH và cung cấp cỏc hormon và cỏc GF, protein cần cho ổn định và phõn tỏn hormon, dinh dưỡng tế bào và cỏc chất ức chế men protease....Tuy nhiờn huyết thanh khụng được coi là chất tốt nhất tạo nờn mụi trường tối ưu cho sự phỏt triển tăng trưởng và biểu hiện chức năng tế bào, do dễ biến đổi, dẽ mang mầm bệnh nấm, virus...ngoài ra cú LDH, LDL, vitamin C...khụng bền ở nhiệt độ thấp.
+ Mụi trương khụng huyết thanh: do những hạn chế của mụi trường bổ
xung huyết thanh, nhiều nhà khoa học tỡm ra những mụi trường mới và Ts. Richard G. Ham đó thiết lập quy trỡnh nuụi cấy tế bào sừng trong mụi trường
khụng cú huyết thanh, trong mụi trường này cú sự thay đổi cỏc thành phần như: acid amin, nguyờn tố vi lượng, vitamin, ion... do đú trong quỏ trỡnh nuụi cấy cần bổ xung cỏc thành phần như: EGF, insulin, transferrin,... cho phộp sự
tăng trưởng, tăng sinh tế bào. Tuy nhiờn số lần cấy chuyển sau nuụi cấy sơ
cấp cũng ớt hơn với mụi trường cú huyết thanh do đú cần bổ xung một số yếu tố từđộng vật.
Hiện nay những mụi trường nuụi cấy tế bào sừng chuyờn biệt khụng bổ
xung huyết thanh cú rất nhiều và nghiờn cứu phỏt triển rất mạnh khắc phục những nhược điểm của cỏc mụi trường trước đú như: MCDB151, MCDB153, MCDB 154, Epilife... Trong đú mụi trường Epilife là mụi trường cơ bản nuụi cấy tế bào sừng giỳp tế bào sừng tăng trưởng mạnh, tăng sinh mạnh, sụng khỏe, dài hơn cú thể tạo tới 150 thế hệ.
Do đú chỳng tụi chọn nuụi cấy tế bào sừng trong mụi trường Epilife. Kiểm tra hàng ngày sự phỏt triển của tế bào sừng, đỏnh giỏ chất lượng tế bào, sự nhõn lờn, sự nhiễm khuẩn. Chia quỏ trỡnh nuụi cấy thành 2 giai đoạn chớnh. + Giai đoạn nuụi cấy sơ cấp: tớnh từ khi lấy mẫu da đưa vào trong Labụ nuụi cấy đến khi thu nhận được cỏc mẫu tế bào phỏt triển bỏm đỏy chai che phủ khoảng trờn 70% diện tớch đỏy chai thỡ tiến hành tỏch và cấy chuyển bằng Trypsin sang cỏc chai nuụi cấy flask.
+ Giai đoạn nuụi cấy thứ cấp: tớnh từ khi tỏch Trypsin cỏc tế bào sừng bỏm 70% đến 80% trờn đĩa, tiến hành đếm tế bào sừng trờn mẫu, và cấy chuyển nhõn rộng số lượng tế bào sừng trờn nhiều đĩa: lần cấy chuyển đầu thu
được cỏc đĩa tế bào mật độ bỏm 70% là P1, tiếp tục cấy chuyển lần 2 thu được P2, P3, P4... đến khi tế bào chết khụng phỏt triển nữa, bong ra và vỡ tế bào.
+ Giai đoạn tạo tấm TBS tự thõn: giai đoạn này cũng lựa chọn cỏc thời
collagen sau 1 đến 2 ngày thu được cỏc tấm tế bào sừng cú đủ điều kiờnk ghộp lờn bệnh nhõ. 3 thời điểm này sẽđược mụ tả kỹ bằng cỏc ngày nuụi cấy.
2.2.3. Quy trỡnh nuụi cấy tạo tấm tế bào sừng. 2.2.3.1. Cỏc bước tiến hành trong ngày thứ nhất 2.2.3.1. Cỏc bước tiến hành trong ngày thứ nhất
Cắt lọc mỡ ở mẫu da.
Rửa mẫu da 2 lần bằng PBS để loại bỏ mỏu và tổ chức chết.
Cắt nhỏ mẫu da thành cỏc mẩu da cú kớch thước 0,5cm x 0,2cm trong
đĩa petri cú chứa 5ml DMEM cú 1% khỏng sinh. Ngõm mẫu da 30 giõy trong cồn 70% thể tớch. Rửa mẫu da 2-3 lần bằng PBS để loại bỏ cồn.
Đặt cỏc mẩu da đó xử lý vào tube vụ trựng cú chứa 10ml dung dịch Dispase II ở nồng độ 0,5mg/ml trong dung dịch đệm Hank’s.
Đặt tube da vào mụi trường lạnh 40C trong 12 giờ.
2.2.3.2. Cỏc bước tiến hành trong ngày thứ hai:
Đặt tube chứa da ởđiều kiện nhiệt độ phũng trong vũng 4 giờ. Làm ấm dung dịch trypsin đến 370C.
Lấy cỏc mẩu da từ tube vụ trựng bằng pipet, đặt vào đĩa petri. Bổ sung dung dịch trypsin 1X .
Dựng dao mổ thường cạo lớp biểu bỡ tỏch ra khỏi trung bỡ. Hỳt chuyển cỏc tế bào biểu bỡ sau khi tỏch vào ống ly tõm.
Sục mạnh dung dịch tế bào trong tub ly tõm bằng pipet để làm tỏch cỏc tế bào khỏi sự kết nối bằng desmosome, thời gian tiến hành trong khoảng 3 phỳt .
Bổ sung DMEM cú 10% FCS để ngừng quỏ trỡnh trypsin.
Ly tõm tube tế bào ở tốc độ 8.000 vũng/phỳt và tiến hành trong 8-10 phỳt và loại bỏ dịch nổi.
Bổ sung KCM với số lương 1,5ml cho lượng tế bào tỏch từ 1cm2.
Đếm tế bào và cấy tế bào vào chai nuụi cấy ở số lượng 5 x 104 – 1 x 105 /cm2, bổ sung KCM đủ số lượng 3ml cho chai 25cm2.
Đặt chai tế bào nuụi cấy vào tủ ấm 370C với 95% thể tớch khớ trời và 5% thể tớch CO2.
2.2.3.3. Cỏc bước tiến hành trong ngày thứ ba và cỏc ngày tiếp theo