BÁO CÁO KHOA HỌC: "NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ THU NHẬN SILYMARIN VÀ TẠO SINH KHỐI TẾ BÀO TỪ CÚC GAI (SILYBUM MARIANUM) TRỒNG Ở VIỆT NAM." pptx

Nghiên cứu công nghệ nhân giống nguyên liệu ở các vùng sinh thái khác nhau và công nghệ tạo sinh khối tế bào Cúc gai: Để thực hiện các vấn đề đặt ra, cần nghiên cứu Cúc gai một cách hệ

NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ THU

NHẬN SILYMARIN VÀ TẠO SINH KHỐI TẾ BÀO

TỪ CÚC GAI (SILYBUM MARIANUM) TRỒNG Ở VIỆT NAM

Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn Quốc Khang

Khoa Sinh học– Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Hà nội

Lê Thị Lan Oanh, Nguyễn Thị Tố Nga, Nguyễn Thị

Ngọc Dao

Viện Công nghệ Sinh học, Hà nội

I ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây Cúc gai (Silybum marianum) thuộc họ Cúc Asteraceae,

là cây thảo 1-2 năm, ra hoa vào năm thứ 2, nguyên liệu

dùng sản xuất thuốc là hạt quả hoặc toàn cây Cây phát

triển chủ yếu ở châu Âu, châu Phi, Nam Mỹ, Trung và

Đông Á

Đây là một cây thuốc có giá trị cao, để điều trị các bệnh hiểm nghèo về gan thận, hiện đang phổ biến ở nước ta Do

đó việc khai thác phát triển sử dụng cây Cúc gai đã được di thực trồng ở Việt Nam để sản xuất các chế phẩm thuốc chữa bệnh gan thận trong nước tạo nguồn dược phẩm quí, mới, phong phú và rẻ tiền phục vụ bảo vệ sức khoẻ cộng đồng là một vấn đề đang được quan tâm và rất cấp thiết

Cây cúc gai đã được du nhập vào trồng ở Việt Nam từ lâu, hiện nay đang phát triển tốt tại các vùng cao có đất tốt và khí hậu mát mẻ như: Tam Đảo, Sapa,…; lượng dược liệu này nhu cầu ngày càng gia tăng Do đó chúng tôi thực hiên

đề tài nêu trên, nhằm góp phần phát triển, mở rộng và làm phong phú nguồn dược liệu của đất nước

II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:

2.1 Đối tượng:

- Hạt Cúc gai được dùng trong thí nghiệm có nguồn gốc từ cây Cúc gai trồng ở Cộng hoà liên bang Đức (CHLB Đ) và

cây trồng ở Sapa Việt Nam Hạt được sấy khô

Lá, thân và quả Cúc gai thu được từ cây Cúc gai trồng thử nghiệm tại Hà Nội vào tháng 4-5 khi quả bắt đầu chín và lá

đã ngả hơi vàng Các bộ phận được thái lát, sấy ở nhiệt độ dưới 60OC đến khô và nghiền nhỏ thành bột mịn

- Các hoá chất khác dùng dưới dạng sạch phân tích (pa.) của các hãng Sigma và Merk

Hình 1 Cây Cúc gai đang phát triển

Hình 2 Cây Cúc gai đang ra hoa

2.2 Phương pháp nghiên cứu:

- Nghiên cứu tỷ lệ nảy mầm hạt.Hạt Cúc gai được gieo trên giấy lọc bão hoà nước trong hộp Petri Mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần gieo 100 hạt để trong tối hoàn toàn và ở các nhiệt độ 15, 25 và 35OC Tỷ lệ nảy mầm được theo dõi qua các thời đIểm 3, 5 và 7 ngày

- Định tính các nhóm chất hữu cơ trong các bộ phận cây bằng các phương hoá lý thông thường và thuốc thử hoá học đặc hiệu

- Chiết rút phân đoạn flavonoit theo phương pháp Talli

- Nghiên cứu thành phần hoá học bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM), sắc ký lỏng cao áp (HPLC),…

Nuôi cấy mô rễ, thân và lá để tạo sinh khối

III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Nghiên cứu công nghệ nhân giống nguyên liệu ở các vùng sinh thái khác nhau và công nghệ tạo sinh khối tế bào Cúc gai:

Để thực hiện các vấn đề đặt ra, cần nghiên cứu Cúc gai một cách hệ thống từ việc tạo giống và nguyên liệu bằng qui trình nhân giống trồng đại trà ở các vùng sinh thái thích hợp và nuôi cấy tạo sinh khối đến nghiên cứu thành phần hoá học Cúc gai trồng tại Việt Nam, qui trình công nghệ chiết rút các chất có hoạt tính và sản xuất các chế phẩm thuốc để thử nghiệm Qua nhiều thăm dò, thử nghiệm,

chúng tôi đã thành công qui trình công nghệ, tóm tắt như sau:

3.1.1 Sự nảy mầm hạt Cúc gai

Bước đầu chúng tôi tiến hành khảo sát sự nảy mầm của hạt Cúc gai từ cây trồng ở Việt nam (VN) và ở Cộng hoà liên bang Đức (Đức)

Hạt cúc gai được sấy khô đạt độ ẩm 9-10% và tiến hành thí nghiệm Hạt được gieo trên giấy lọc thấm nước cất trong

hộp petri, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần gieo 100

hạt, để trong tối và ở các nhiệt độ 15, 25 và 35OC Số hạt

nảy mầm được theo dõi sau 3, 5 và 7 ngày Kết quả trình

bầy trong bảng 1

Bảng 1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến thời gian nảy mầm

của hạt Cúc gai

Nhiệt độ tối ưu khoảng 25OC, hạt Cúc gai Đức nảy mầm

sau 7 ngày, như vậy nhiệt độ đóng vai trò quan trọng trong quá trình nảy mầm hạt Cúc gai Các hạt Cúc gai sau nẩy

mầm được nhân trong các chậu thí nghiệm và phát triển

bình thường như đã trình bày ở hình 3 dưới đây:

Hình 3 Cây Cúc gai từ hạt Cúc gai Đức (1) và hạt Cúc gai

VN (2)

3.1.2 Thử nghiệm trồng Cúc gai

Cúc gai đẫ được trồng tại Sapa trong nhiều năm qua do khí hậu thích hợp với loài cây ôn đới này và cho hàm lượng hoạt chất không kém Cúc gai của (CHLB Đ)

Chúng tôi thử nghiệm trồng Cúc gai trong điều kiện đồng bằng tại Hà Nôi, ở ngoại thành Hà Nội trên diện tích vườn 50m2 và tại Trung Tâm Giống cây thuốc thuộc Viện Dược liệu, cũng đã thử nghiệm trồng Cúc gai tại An Khánh,

Thường Tín cho thấy Cúc gai có thể trồng trong điều kiện khí hậu ở Hà Nội, cho hoa và quả trong năm thứ 1 Tuy

nhiên cần xác định thời vụ trồng thích hợp là từ tháng 10 năm trước đến tháng 5 năm sau vào vụ Thu Đông , cần

phân tích đánh giá sản lượng, hàm lượng và chất lượng

thuốc của hạt Cúc gai trồng trong những điều kiện trên

trong năm 2002 Hiện nay chúng tôi đã cho trồng thử

nghiệm lại đồng thời tại Sapa và tại Trung tâm Cây thuốc, cây Cúc gai đã được gần 3 tháng tuổi cây sinh trưởng

tốt.(hình 1 và 2)

3.2 Thử nghiệm nuôi cấy mô tế bào

Với độ nảy mầm tốt chúng tôi tiến hành nuôi cấy mô rễ Cúc gai tạo sinh khối tế bào trong phòng thí nghiệm Hiện nay mới bắt đầu thực hiện nội dung trên, đã thử nghiệm cho hạt cúc gai nảy mầm trong điều kiện vô trùng và thử nuôi cấy mô lá, thân và rễ Bước đầu đẫ tìm được môi trường thích hợp và đã tạo được mô sẹo của các khối mô trên cho

2 giống Cúc gai của Đức và Việt Nam Quá trình tạo mô sẹo diễn ra qua các bước sau:

3.2.1 Các bước khử trùng hạt và nẩy mầm:

Kết quả của bước này trải qua các công đoạn sau:

- Ngâm hạt và rửa nước cất 3 lần

- Lắc trong ethanol 70% trong thời gian 1 phút, sau đó lắc trong nước gia ven 50% trong thời gian 20 phút

- Rửa lại nước cất nóng ấm 3 lần

- Cuối cùng cấy hạt vào trong bình có chứa môi trường cho hạt nảy mầm

Thành công là::

+ Hạt nảy mầm đạt kết quả 100%

+ Môi trường cho hạt nảy chồi tốt ký hiệu là T/2

3.2.2 Tạo mô sẹo từ lá và rễ của cây cúc gai

Có thể tóm tắt như sau:

- Sau khi hạt nảy mầm thành cây con hoàn chỉnh, chúng tôi tiếp tục cắt mảnh lá và mảnh rễ để đưa vào môi trường tạo

mô sẹo

- Sau thời gian 1 tháng bắt đầu hình thành mô sẹo

- Đối với lá môi trường thích hợp cho việc tạo mô sẹo có

ký hiệu là: TM1, đối với rễ là môi trường có ký hiệu TMS

- Sau khi mô sẹo đã được hình thành, sau nhiều thăm dò và thử nghiệm trên các môi trường khác nhau điển hình thì môi trường phù hợp cho việc nuôi cấy mô sẹo là 141 và MSD2

Những kết quả này được phản ảnh rõ nét qua các ảnh chụp sau

Hình 4 Tạo mô sẹo từ thân cây Cúc gai

Hình 5 Mô sẹo từ lá cây Cúc gai trên môi trường 141

Hình 6 Mô sẹo từ rễ cây Cúc gai trên môi trường 141

Hình 7 Tạo mô sẹo từ lá Cúc gai trên môi trường MT1

Hình 8 Nuôi mô sẹo từ lá Cúc gai trên môi trường MT1

3.3 Xây dựng qui trình thu nhận Silymarin qui mô phòng

thí nghiệm:

Qui trình thu nhận silymarin từ hạt cây Cúc gai có thể trình bầy tổng quát trong sơ đồ sau:

-Đã chọn được hệ dung môi thích hợp và ít độc để chiết rút

thu nhận Silymarin làm thuốc qui mô phòng thí nghiệm

Hiệu suất thu nhận chế phẩm này so với phương pháp phân tích định lượng Qui trình này với quy mô Pilot 20 lit- có hàm lượng 2,12% trọng lượng khô Như vậy hiệu suất thu được Silymarin của quy trình là 87% so với phân tích định

lượng

Kết quả đã thu được 20 gam Silymarin tinh khiết Kết quả

phân tích trên SKLM cho 4 vết đậm trên sắc ký đồ có Rf

(0,40; 0,46; 0,55 và 0,58) gần giống với giá trị Rf của 4

thành phần Silymarin của Bungary làm chất chuẩn

Chế phẩm Carsil và hai chế phẩm VN1 và VN2 tách chiết

bằng 2 hệ dung môi khác nhau được phân tích thành phần

trên máy HPLC

Bảng 4 Kết quả phân tích trên máy HPLC

Mẫu Silymarin của Bungary có 6 peak đặc trưng và chiếm

tới 88,7% tổng số chế phẩm đưa vào phân tích, mẫu

Silymarin thu được (từ hạt Cúc gai VN1 và VN 2) của

chúng tôi cũng có 6 peak tương tự và chiếm tới 93,3 -

81,2% tổng số mẫu đưa vào phân tích Như vậy các thành

phần chính của Silymarin thu được từ các mẫu của chúng tôi đều giống thành phần Silymarin dùng làm thuốc của Bungary

Tuy nhiên tỷ lệ các peak trong 3 mẫu có khác nhau Thành phần peak 4 của Silymarin Bungary có hàm lượng cao nhất chiếm tới 29,9%, trong khi đó peak này ở chế phẩm

Silymarin VN 1 thu được chiếm có 7,8%, nhưng peak 2 chiếm tới 44,9%, còn peak2 của Silymarin Bungary chỉ chiếm 11,6% và của chế phẩm Silymarin VN2 là 17,4 và 38,0%

Thành phần Silymarin Cúc gai VN 1 và VN 2 có thành phần tương đương nhau, như vậy có thể dùng cả 2 loại dung môi được thí nghiệm để thu nhận Silymarin Chúng tôi đang tiến hành để tách từng peak và phân tích thành phần hoá học và tính chất của chúng, trong các công trình tiếp sau

IV KẾT LUẬN

1 Đã nghiên cứu sự nẩy mầm hạt Cúc gai từ hạt đã sấy khô dưới 60OC, còn 9-10% ẩm độ Sau đó khử trùng và đưa vào môi trường nẩy mầm thích hợp ( T/2 ) Kết quả hạt nẩy mầm đạt 63,34 – 78,93% ở 25OC, sau 7 ngày

2 Đã thành công qui trình tạo mô sẹo từ lá, thân và rễ Cúc gai trong các môi trường khác nhau là:lá và thân trong môi trường thích hợp là TM1 và cho rễ là môi trường là TMS Đồng thời cũng đã lựa chọn được môi trường thích hợp để nuôi mô sẹo phát triển thành cây là 141 và MSD2

3 Tiến hành qui trình sản xuất cây Cúc gai thành công trên thực địa trong điều kiện môi trường có nhiệt độ cao ở Hà nội

4 Xây dựng qui trình thu nhận Silymarin từ cây Cúc gai qua các bước:Bột nguyên liệu  Loại chất béo  Chiết rút bằng etylacetat  Đuổi dung môi  Tinh chế lại  Chế phẩm Silymarin Chế phẩm thu được có hiệu xuất khai thác cao và chất lượng tốt tương tự Silymarin của Bungary,

được phân tích bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM) và sắc ký

lỏng cao áp (HPLC)

TÀI LIỆU THAM KHẢO:

1 Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Quốc Khang, Đào Kim Nhung (1977)- Thực tập Sinh hoá, Đại học Tổng hợp Hà nội

2 Đào Kim Nhung (1996)- Luận án PTS Khoa Sinh học, ĐHTH Hà nội

3 Võ Văn Chi (2000)- Từ điển cây thuốc Việt nam

NXB Y-học Hà nội, tr 339

4 Carsil, a product with confirmed effectivenes in toxic, metabolic and degenerative diseases of the hepatic

parenchyma, 2000, Sopharma, Bungary

5 Flora K., Hahn M Rosen H, Benner K (1999)- Milk thistle (S marianum) for the therapy of liver diseases Am

J Gastroenterol 94 (2), 545 – 546

6 Amirghofran Z., Azadbakht M., Karimii MH (2000).- Evaluation of the immunomodulatory effects of five herbal plants J Ethnopharmacol 72 (1-2), 167-172

7 Luper S (1998)- A review of plants used in the

treatment of liver disease Altern Med Rev 3 (6), 410-421

8 Syed AH Et al (2002) Contemporary role and future propects of medicinal plants TelMedPak

9 Alikaridis F (2000)- Hairy root’s Silybum marianum biosynthesis Fitoterapia, 379 –384

SUMMARY:

Study on extraction procedure of flavolignans silymarin and production of biomass from milk thistle sylibum marianum grown in viet nam

Germination process of the dryed under 60oC seeds from

milk thistle (Silybum marianum) growing in Vietnam was

investigated The results showed that 63,34 – 78,93% of the seeds were germinated at 25OC after 7 days

The procedure of callus culture of leaves, stem and roots in different mediums was completted The suitable medium for leaves and stem callus formation was TM1, and for root callus formation was TMS The mediums 141 and MSD2

were suitable for plant formation from callus

The production of milk thistle in field was carried out Milk thistle could grow in higher temperature condition of

Hanoi

The 20 litre volume extraction procedure of flavolignans Silymarin from the plant was done with two solvent

systems (VN1 and VN2) with following steps: Material powder  lipid removal  etylacetat extraction  solvent evaporation  refinement  Silymarin preparation

The obtained bioactive preparation had good quantity with 2,12% per dry weight and quality as Silymarin drug of

Bulgaria (Carsil) analyzed by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) and Think Layer

Chromatography (TLC) techniques

The components Silymarin from VN1 and VN2 are similar,

so both solvents can be used to obtain Silymarin

The obtained preparation Silymarin should be a promising component of a drug using for treatment of liver diseases

Người thẩm định nội dung khoa học: PGS Trịnh Đình Đạt