Bài viết trình bày kết quả nghiên cứu tính đa dạng di truyền của các giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau trong tập đoàn giống đậu tương Việt Nam.
28(3): 49-53 9-2006 Tạp chí Sinh học Nghiên cứu tính đa dạng di truyền số giống đậu tơng có khả kháng bệnh gỉ sắt khác Trần Thị Phơng Liên, Lê Thị Muội Viện Công nghệ sinh học Trần Đình Long Trung tâm nghiên cứu thực nghiệm Đậu đỗ Nấm Phakospora pachyrhizi Sydow gây bệnh gỉ sắt đậu tơng (Glycine max (L) Merr) Nhiều nòi nấm đợc phân lập [1] Một số nghiên cứu phân ly tính kháng bệnh gỉ sắt cách lai hữu tính cho thấy gien trội (đơn gien) kháng bệnh Rpp1, Rpp2, Rpp3 dòng đậu tơng khác locut khác [2] Nhng việc phân lập gien nh định vị chúng nhóm liên kết gien đậu tơng vấn đề đợc nghiên cứu Việc tìm kiếm thị phân tử liên quan đến tính kháng bệnh gỉ sắt tiến tới phân lập gien đợc nghiên cứu nhiều đối tợng trồng nh lúa mỳ, ngô, đậu [3, 4] Một bớc tiệm cận để phân lập gien kháng bệnh nghiên cứu tính đa dạng di truyền giống đậu tơng có khả kháng bệnh khác thị phân tử để tìm thị phân tử cho tính đa hình giống kháng giống mẫn cảm với bệnh gỉ sắt Trong này, trình bày kết nghiên cứu tính đa dạng di truyền giống đậu tơng có khả kháng bệnh gỉ sắt khác tập đoàn giống đậu tơng Việt Nam I phơng pháp nghiên cứu Nguyên liệu - Các giống đậu tơng có khả kháng bệnh gỉ sắt khác Các giống G1, G2, G3 mẫn cảm với bệnh gỉ sắt; giống G8, G9 kháng bệnh mức trung bình giống G4, G7 G10 - kháng bệnh gỉ sắt tốt Các giống Trung tâm nghiên cứu thực nghiệm Đậu đỗ (TT ĐĐ) thuộc Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam nhân giống khảo sát sơ khả kháng bệnh gỉ sắt Hình Các giống đậu tơng với tính kháng bệnh gỉ sắt khác Công trình đợc hỗ trợ kinh phí Chơng trình Công nghệ sinh học (2001-2005) 49 - Các enzim hóa chất chuyên dụng đợc mua từ hãng Fermentas, Sigma, Merk Các cặp mồi SSR đợc đặt tổng hợp hãng Invitrogen Phơng pháp - Phơng pháp SSR: ADN tổng số giống đậu tơng nghiên cứu đợc tách chiết theo phơng pháp Keim (1987) [5] Phơng pháp sử dụng 12 cặp mồi SSR: Satt042, Satt005, Satt146, Satt175, Satt173, Satt557, Satt489, Satt373, Satt567, Satt150, Satt009 Satt431 [6]; trình tự cặp mồi SSR theo công bố Cregan cs (1999) [7] Phản ứng PCR đợc tiến hành thể tích 25 µl bao gåm: 20 ng ADN; 10 pmole måi tæng sè; 1,6 mM MgCl2; 250 µM dNTP; 10 mM Tris-HCl pH 8,8; 50 mM KCl; 0,08% Nonidet P40; đơn vị Taq DNA polymeraza Chu trình nhiệt phản ứng: 95°C: phót, 35 chu kú gåm ba b−íc 95°C: 45 giây, 50C: 45 giây, 72C: 60 giây; sau 72C: phút kết thúc 4C máy PCT-100TM (MJ Research, Inc.) Sản phẩm PCR đợc kiểm tra gel agaroza 1,5% độ đa dạng đợc theo dõi điện di gel agaroza từ 2,4-3% 12-15% polyacrylamit gel (PAGE), nhuộm etidium bromit phát băng ADN đèn UV - Số liệu đợc xử lý chơng trình NTSYS 2.0 phân tích cách tính hệ số đa dạng di truyền (genetic diversity index) [8] cho thị phân tử: H = 1- Pi2 (Pi tần xuất gặp an-len thứ i thị phân tử) - Đánh giá khả kháng bệnh gỉ sắt đậu tơng: Chuẩn bị nguồn bệnh: thu đồng ruộng; chọn xanh, bị bệnh 50%; cho vào hộp ẩm, nhiệt độ 25oC - 28oC phòng tối 12 để kích thích tạo bào tử Dùng bàn chải, chải nhẹ bào tử vào cốc nớc vô trùng tiến hành kiểm tra nồng độ Sử dụng dung dịch có nồng độ ì 104/ml để gây nhiễm bệnh Phơng pháp nhiễm bệnh khu cách biệt: đậu tơng đợc gieo trồng điều kiện đất chăm bón Tiến hành lây nhiễm non có kép mở hoàn toàn 50 Dịch bào tử đợc phun (hoặc dùng quét) lên mặt với lợng 0,5 ml/dm2 vào lúc chiều muộn Giữ độ ẩm 80-90%, nhiệt độ 25oC- 28oC Sau 15 ngày, tiến hành xác định khả tạo vết bệnh theo số lợng vết bệnh diện tích lá, đặc điểm vết bệnh (mức độ tạo gờ, kích thớc vết) mức độ hình thành bào tử theo phơng pháp Bộ môn Di truyền miễn dịch, Viện Khoa học Kỹ thuật nông nghiệp Việt Nam Khả kháng gệnh gỉ sắt đợc đánh giá nh sau: kháng cao: 0-20%; kháng: 21-30%, nhiễm trung bình: 31-50%; nhiễm: 51-70%; nhiễm nặng: 71-100% II Kết thảo luận Các giống đậu tơng đợc khảo nghiệm sơ khả kháng bệnh gỉ sắt G1-G10 giống ĐT2000 đợc nghiên cứu tiếp thị phân tử SSR Sử dụng 12 thị SSR để khảo sát khác giống cho kết hình Trong đó, 10 thị SSR cho đa dạng di truyền giống, hai thị Satt005 Satt567 không phát đợc đa dạng Các thị Satt146 Satt373 cho đa dạng giống nghiên cứu (5 anlen), thị Satt557 (2 an-len) Hệ số đa dạng di truyền đợc tính bảng Nh vậy, việc nghiên cứu giống cho thấy thị Satt557 có hệ số thấp 0,1975, thị Satt373 có hệ số cao 0,7655, trung bình 0,6161 Việc nghiên cứu chơng trình NTSYS 2.0 khoảng cách di truyền giống cho thấy chúng chia thành nhóm Nhóm gồm giống G1, G2 G3; nhóm gồm giống G4, G7, G8, G9, G10 ĐT2000 Trong nhóm 2, chia tiếp thành nhánh nhỏ: hai giống G8, G9 tách riêng so với giống lại G4, G7, G10, ĐT2000 (hình 3) Song song với việc nghiên cứu sử dụng thị phân tử, TTĐĐ tiến hành thí nghiệm đánh giá khả kháng bệnh gỉ sắt giống đậu tơng (bảng 2) Các ký hiệu từ G1-G10 giống tơng ứng tập đoàn đậu tơng nh sau: G1-V74, G2-ĐH4; G3-AGS332; G4-ĐT2000; G7-GC104.28; G8-GC58; G9GC8586; G10-8600.49 Đánh giá điều kiện nhân tạo sử dụng nguồn bệnh gỉ sắt lấy khu nhà lới Viện Cây lơng thực Cây thực phẩm, sở (Thanh Trì, Hà Nội) Khả kháng bệnh gỉ sắt đợc đánh giá nh sau: kháng cao: 0-20%; kháng: 21-30%; nhiễm trung bình: 31-50%; nhiễm: 51-70%; nhiễm nặng: 71-100% Cần lu ý bệnh gỉ sắt nhiều nòi nấm gây bp ra; nòi nấm vùng khác tác động lên giống khác Kết khảo sát giống sử dụng nòi gây bệnh gỉ sắt từ Viện Cây lơng thực Cây thực phẩm, cở (Hải Dơng) có biên độ giao ®éng nhÊt ®Þnh 250 200 Satt173 200 150 Satt150 200 Satt557 200 150 Satt175 200 150 Satt042 300 200 Satt373 Hình Phổ điện di sản phẩm SSR PAGE 12% giống đậu tơng: G1; G2; G3; G4; G7, G8; G9; G10 Bảng Kết phân tích đa dạng sử dụng thị SSR liên quan đến tính đa dạng di truyền STT 10 SSR Satt146 Satt175 Satt173 Satt431 Satt009 Satt 557 Satt 489 Satt373 Satt150 Satt 042 D¹ng SSR (Att)17 (Att)16 (Att)18 (Att)21 (Att)14 (Att)17GAT (Att)23GTT (Att)21 (Att)20 (Att)27 KÕt qu¶ cho thÊy ba giống G1, G2 G3 bị nhiễm nặng với chØ sè bƯnh 90-95% Ba gièng G4, G7 vµ G10 giống kháng bệnh gỉ sắt cao: 10-15%; thực tế, giống G4 giống ĐT2000 Còn hai giống G8, G9 giống nhiễm trung bình: 33-36% (bảng 2) Kết tơng đối phù hợp với kết so sánh khoảng cách di truyền gièng sư dơng Sè an-len 4 4 Hệ số đa dạng (H) 0,7162 0,4938 0,6914 0,7161 0,7285 0,1975 0,568 0,7655 0,6174 0,6668 12 thị phân tử SSR Để chọn cặp bố mẹ cho phép lai nhằm tìm gien kháng bệnh, ba giống bị nhiễm nặng G1, G2 G3 ba giống kháng cao G4, G7 G10 sử dụng lai tạo Việc cần thiết tìm đợc thị phân tử cho đa hình cặp lai với khả kháng bệnh ngợc Mời thị phân tử SSR cho đa dạng hai nhóm 51 mức độ khác Ví dụ nh: thị Satt557 cho đa hình giống bị nhiễm bệnh G2 giống kháng bệnh cao G4, G7 G10; nhng không cho đa dạng hai giống bị nhiễm bệnh G1, G3 với giống kể Chỉ thị Satt173 cho đa hình giống G3 với ba giống G4, G7 G10; nhng cho đa hình giống G2 hai giống G4 G7; giống G1 giống G10 Vì vậy, khả tìm đa hình giống bị nhiễm bệnh giống kháng bệnh rÊt cã triÓn väng G1 G2 G3 G4 DT2000 G10 G7 G8 G9 0,57 0,65 0,72 0,79 0,87 HÖ sè Hình Tính đa dạng di truyền số giống đậu tơng kháng bệnh gỉ sắt Bảng Khả kháng bệnh gỉ sắt giống đậu tơng đợc nghiên cứu (số liệu TT Đậu đỗ) Ký hiệu G1 G2 G3 G4 Giống đậu tơng V74 ĐH4 AGS 332 §T2000 ChØ sè bƯnh 95 … 95 … 90 … 15 … ChØ thÞ phân tử SSR đợc sử dụng rộng rãi nghiên cứu tính đa dạng di truyền đậu tơng Abe cs [9] sử dụng 20 thị phân tư SSR trªn 20 nhãm liªn kÕt di trun cđa đậu tơng để nghiên cứu 131 giống đậu tơng nớc châu cho biết sơ đồ phân loại hình cây, chúng phân thành nhóm: tập đoàn giống đậu tơng Trung Quốc Nhật Bản nguồn gien riêng biệt; tập đoàn giống đậu tơng Bắc Triều Tiên Hàn Quốc gần với Trung Quốc Nhật Bản, giống đậu tơng nớc Đông Nam Nam bắt nguồn từ Trung Quốc Sử dụng 12 thị phân tử SSR để nghiên cứu số giống đậu tơng kể trên, bớc đầu nhận thấy chúng phân thành nhóm theo mức độ kháng bƯnh gØ s¾t 52 Ký hiƯu G7 G8 G9 G10 Giống đậu tơng GC 10428 GC58 GC 8586 8600,49 Chỉ sè bÖnh 10 … 33 … 36 … 15 … B»ng c¸ch kh¸c, theo h−íng lËp đồ gien cho tính trạng kháng bệnh thối thân thối rễ nấm Phytophthora sojae gây ra, Gordon cs [10] nghiên cứu 379 thị SSR (trong 104 thị SSR cho đa hình cặp bố mẹ với khả kháng bệnh đối nhau) quần thể F2, F3 tìm locut kháng bệnh Rps8 nằm nhóm liên kết F hai thị Satt425 Satt114 Những kết quan träng viƯc chän gièng víi sù trỵ gióp thị phân tử (MAS-marker assisted selection) Khảo sát 12 thị phân tử SSR để tìm đa hình cặp bố mẹ bệnh gỉ sắt số khiêm tốn Kết bớc đầu định hớng cho việc nghiên cứu gien kháng bệnh gỉ sắt tập đoàn giống đậu tơng nớc ta III Kết luận Nghiên cứu giống đậu tơng có khả kháng bệnh gỉ sắt khác 12 thị phân tử SSR, cho thấy 10 thị SSR cho đa hình với hệ số đa dạng di truyền từ 0,1975 (Satt557) đến 0,7655 (Satt373), trung bình 0,6161 Về khoảng cách di truyền, giống đợc chia thành nhóm Ba giống mẫn cảm với bệnh gỉ sắt G1, G2 G3 tách thành nhóm; nhóm gồm giống lại Nhóm hai đợc chia thành hai nhánh: hai giống nhiễm trung bình G8, G9 tách thành nhánh, giống kháng bệnh gỉ sắt cao G4, ĐT2000, G7 G10 tạo thành nhánh Nh vậy, 10 thị SSR cho đa hình mức độ khác ba giống mẫn cảm với bệnh gỉ sắt G1, G2 G3 với giống kháng bệnh Tài liệu tham khảo Hartman G L et al., 1992: Plant Dis., 76: 396-399 Hartwig E E., Bromfield K R., 1983: Crop Sci., 23: 237-239 Feuillet C et al., 2003: Proc Natl Acad Sci USA, 100(25): 15253-15258 Smith S M., Hulbert S H., 2005: Mol Plant Microbe Interact., 18(3): 220-228 Keim P et al., 1988: Soybean Genet Newsl., 15: 150-152 Trần Thị Phơng Liên cs., 2004: Tạp chí Công nghệ sinh häc, 2(1): 77-84 Cregan P B et al., 1999: Crop Sci., 39: 1464-1490 Nei M., 1987: Molecular Evolutionary Genetics Columbia Univesity Press NY Abe J et al., 2003: Theor Appl Genet., 106: 445-453 10 Gordon S G et al., 2006: Crop Sci., 46: 168-173 Study of the genetic biodiversity of some soybean cultivars with different rust resistant abilities Tran Thi Phuong Lien, Le Thi Muoi, Tran Dinh Long Summary The soybean cultivars G1, G2, G3, G4, G7, G8, G9, G10 and DT2000 were grown and tested for rust resistance DNA isolated from the young leaves of these cultivars was also studied for the genetic diversity using 12 SSR (simple sequence repeats) markers The results showed the polymorphism between these cultivars The genetic diversity index (H) values ranged from 0.1975 for Satt557 to 0.7655 for Satt373 An average of 3.8 alleles produced by SSR loci and a mean gene diversity of 0.6161 were obtained The genetic distance data revealed that there were two cultivar groups Three cultivars G1, G2 and G3, which were susceptible to the rust, were in the first group The second group consisted of six other cultivars G4, G7, G8, G9, G10 and DT2000 The second group was divided into two branches, based on their susceptibility to the rust infection In the first branch were two varieties G8 and G9, which were moderately infected by the rust and the second branch consisted of four varieties G4, DT2000, G7 and G10, which were highly resistant to the rust According to the results of the investigation using fungal race provided by the Legume Research and Development Center, there were three susceptible cultivars G1, G2 and G3, with a disease index of 90 to 95% and three high resistant cultivars G4, G7 and G10, with a disease index of 10 to 15% All of the ten SSR markers (Satt042, Satt146, Satt175, Satt173, Satt557, Satt489, Satt373, Satt150, Satt009 and Satt431) gave out polymorphism at different levels between the first and the second groups This study has provided new data that would be useful for the selection of parents with different rust resistance abilities and high diversity of the SSR markers that were linked to the rust resistance characteristic Ngµy nhËn bµi: 9-11-2005 53 ... 0,79 0,87 Hệ số Hình Tính đa dạng di truyền số giống đậu tơng kháng bệnh gỉ sắt Bảng Khả kháng bệnh gỉ sắt giống đậu tơng đợc nghiên cứu (số liệu TT Đậu đỗ) Ký hiệu G1 G2 G3 G4 Giống đậu tơng V74... kháng bệnh gỉ sắt tập đoàn giống đậu tơng nớc ta III Kết luận Nghiên cứu giống đậu tơng có khả kháng bệnh gỉ sắt khác 12 thị phân tử SSR, cho thấy 10 thị SSR cho đa hình với hệ số đa dạng di truyền. .. đa dạng Các thị Satt146 Satt373 cho đa dạng giống nghiên cứu (5 anlen), thị Satt557 (2 an-len) Hệ số đa dạng di truyền đợc tính bảng Nh vậy, việc nghiên cứu giống cho thấy thị Satt557 có hệ số